Elizabeth Álvarez. Junio 20, 2013 Ecuador

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1 Detección Temprana de Phytophthora palmivora en Palma de Aceite Mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (qpcr) Utilizando Sondas Molecular Beacon Elizabeth Álvarez Junio 20, 2013 Ecuador

2 Pudrición de Cogollo (PC) Es la enfermedad más limitante de la palma de aceite en América del Sur. Investigaciones en CIAT desde el año de 1999 han identificado a Phytophthora como el agente causante de esta enfermedad.

3 Sánchez, N.J., Ayala, A., Álvarez, E Patogenicidad, identificación y Caracterización molecular de Phytophthora spp. en palma de aceite. Boletín Divulgativo Ceniavances 60:1-4. Álvarez, E., J, Sánchez, O. Grajales y P. L. Gómez Pathogenic variation and DNA polymorphism in Phytophthora spp., causal agent of bud rot of oil palm. Phytopathology 89:S3. Álvarez, E., Llano, G.A., Feris, M.C., Hernández, M.L. and Rodríguez, S.M Control of bud rot in oil palm, Elaeis guineensis, using resistance inducers. ICPP2003 Memories 2:179. Llano, G.A, Álvarez, E., Feris M.C., Hernández M.L., Rodríguez S.M Efecto de inductores de resistencia sobre pudrición del cogollo de palma de aceite en los Llanos Orientales de Colombia. Fitopatología Colombiana 30(1): Álvarez, E. Loke, J.B., Trujillo, R Avances en la caracterización patogénica de Phytophthora spp. Asociado al complejo pudrición de cogollo en palma africana Elaeis guineensis Jacq. Fitopatología Colombiana 31(1): Álvarez, E., Marroquín-Guzmán, M., Mejía, J.F. Pardo, J.M Early detection of Phytophthora palmivora in oil palm, using real-time polymerase chain reaction (QPCR) an molecular beacon probes. Phytopathology 101 (6): S253

4 Pudrición de Cogollo (PC) Causada por Phytophthora sp. (Álvarez et al. 2007) Plantaciones comerciales de Colombia. Se reprodujeron síntomas de la enfermedad inoculando palmas de dos años de edad. Se logró establecer la asociación de Phytophthora sp. con la PC. Pudrición de Cogollo Phytophthora sp. Testigo A partir de muestras de suelo de plantaciones afectadas con PC, se aisló Phytophthora sp.

5 Aislamiento y Patogenicidad Pruebas de patogenicidad bajo condiciones de invernadero y cámara húmeda. Identificación morfológica del patógeno. Testigo Identificación por microscopía

6 Identificación de aislamientos de Phytophthora spp. Código Origen Fuente CPP1 Denpasa (Brasil) Meristemo CPP2 Denpasa (Brasil) Raíz CPP3 Denpasa (Brasil) Raíz CPP4 Denpasa (Brasil) Raíz CPP5 Denpasa (Brasil) Cogollo CPP6 Denpasa (Brasil) Ruana CPP7 Denpasa (Brasil) Raíz CPP8 Denpasa (Brasil) Ruana CPP9 P. Ecuador Estipe CPP10 P de Tumaco Pedúnculo CPP11 Tumaco Meristemo CPP12 P. de Casanare Raíz CPP13 Denpasa (Brasil) Meristemo CPP14 Villavicencio Meristemo CPP15 Costa Suelo (10-15cm) CPP16 Costa suelo (10-15cm) CPP17 Costa suelo (10-15cm) CPP18 Costa suelo (10-15cm) CPP19 Costa suelo (5-10cm) CPP20 Costa suelo (10-15cm) CPP21 Villavicencio Palera Código Origen Fuente CPP22 Villavicencio Suelo CPP23 Brasil Ruana CPP24 Villavicencio Suelo CPP25 Villavicencio Suelo CPP26 Villavicencio Suelo CPP27 Villavicencio Suelo CPP28 Villavicencio Suelo CPP29 Villavicencio Suelo CPP30 Villavicencio Suelo CPP31 Villavicencio Suelo CPP21 Villavicencio Tejido afectado CPP33 Brasil Raíz (trampa) CPP34 Brasil Raíz CPP35 Brasil Raíz CPP36 Brasil Raíz #59 Villavicencio 3 Fe Villavicencio V/Vp 13 Villavicencio V/Vp 22 Villavicencio V/Vp 19 Villavicencio

7 Aislamiento y Patogenicidad

8 Identificación del Patógeno Extracción de ADN. Phythopthora sp. (788 pb) PCR con cebadores específicos A2/I2 Enzimas de restricción HpaII, RsaI y TaqI. Secuenciación (Iowa State University). Cebadores específicos A2/I2 (Drenth et al 2006)

9 Identificación de P. palmivora Mediante PCR-RFLP HpaII RsaI TaqI Enzima Tamaño de las bandas (pb) HpaII 467, 321 RsaI 359, 314, 105, 10 TaqI 283, 235, 147, 59, 57

10 Identificación de P. palmivora Mediante PCR-RFLP Virtual P. cactorum P. cambivora P. cinnamomi P. citricola P. infestans P. palmivora P. palmivora(p1) Pythium aphanidermatum pdraw

11 Secuenciación de la Región ITS1-2 y el Gen 5.8S del RNA Ribosomal

12 Análisis Filogenético Identificación de P. palmivora mediante secuenciación de la región ITS

13 Cebadores Específicos y Molecular Beacon Edición secuencias: ChromasPro, versión 1.49 beta. Alineamiento de las secuencias: MEGA 4.0 Diseño Sonda y cebadores específicos: software Beacon Desinger (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA). Imagen tomada del video demostrativo del software Beacon Design

14 Beacon Design

15 SNP 482 Posición SNP. Longitud (pb). P. cinnamomi P. megasperma Secuencia (sense y anti-sense). Tm ( C). P. palmivora %GC. Dímeros. P. trifolii P. phaseoli Accesiones Gen Bank: Drenth et al 2006

16 Cebadores y Molecular Beacon P-Phyto-PR P-Phyto-PF P-Phyto-PB-1 Sintetizados por Integrated DNA Technologies IDT

17 Especificidad Muestra Ct (dr) Tejido afectado (7) P. palmivora Ralstonia solanacearum No Ct Stratagene P. cinnamomi No Ct M. fijiensis No Ct Tejido Sano (4) No Ct Negativo No Ct

18 Sensibilidad Dilución Ct DNA (ng) Ct SD ,36E ,36E ,36E ,36E ,36E No Ct 2,36E-04 No Ct 10-7 No Ct 2,36E-05 No Ct 10-8 No Ct 2,36E-06 No Ct R 2 : 0.987; Eficiencia: 86.3 %

19

20 PCR Convencional MP MP qpcr 100 veces más sensible Dilució n DNA (ng) qpc R PCR ,36E ,36E ,36E ,36E ,36E Diluciones seriadas P. palmivora: PCR con cebadores específicos A2I2

21 Evaluación de Muestras con PC Muestra Ct (dr) Tumaco Palmar de Oriente Tumaco Tumaco Tumaco Tumaco Tumaco Tumaco Palmar de Oriente Inoculación Inoculación Inoculación P. palmivora 16.98

22 Amplification Plots Diagnóstico de P. palmivora en muestras palmas de sicarare Las primeras 6 amplificaciones corresponden a los controles positivos de P. palmivora

23 Potencial de la Metodología Diagnóstico oportuno, sensible y específico del patógeno en plantas de vivero asintomáticas, sustratos, agua y posibles vectores. Estudios de distribución de propágulos en suelo y biología del patógeno. Este nuevo método aporta herramientas confiables para la toma de decisiones en el manejo integrado de la enfermedad.

24 Agradecimientos ANCUPA A ustedes por su atención!

25 Evaluación de Inductores de Resistencia para el Control de Pudrición del Cogollo de Palma de Aceite E. Alvarez; G. Llano; M. C. Feris; M. L. Hernández y S. M. Rodríguez UNIPALMA PALMAS DE CASANARE

26 Importancia de la Enfermedad ha afectadas en América Latina Plantaciones devastadas por PC US $23.3 millones en pérdidas y costos en Colombia (1998) No hay medidas de control eficientes

27 Sintomatología Enfermedad causada por especies de Phytophthora Destruye tejidos jóvenes Amarillamiento de hojas jóvenes Pudrición de flecha y hojas de la corona Los racimos no se afectan Ataca plantaciones de cualquier edad

28 Objetivos Evaluar dos inductores de resistencia en el control de PC en palma de aceite Comparar dos métodos de aplicación de los inductores de resistencia

29 Metodología Palmas Elaeis guineensis de 3 y 5 años Diseño: Parcelas Divididas, 3 rep Inductores: H 3 PO 4 (Acido fosfórico) : 25 y 40% Nutri-Phite : H 3 PO 3 (Acido fosforoso) + KOH

30 Metodología Inyección y sonda al estipe 20 cc/palma/mes Debajo del meristemo Entre hojas # 17 a 25 Profundidad: 15 cm Absorción por raíces 2 raíces. 20cc/palma/mes 1.4 m del estipe cm de profundidad

31 Evaluación Escala de 1 a 4 Palmas sanas Palmas afectadas

32 Progreso de PC en Palma de Aceite Tratada con P y K Estipe Raíz Estipe Raíz Afectadas Sanas Tejido tratado 0 H 25% H 40% NF DMS: 0.7

33 Efecto de Inductores en la Producción de Racimos Estipe Raíz Estipe Raíz Afectadas Sanas Tejido tratado 0 H 25% H 40% NF DMS: 3.2

34 Conclusiones No se observaron diferencias entre aplicación al estipe y absorción radicular La PC puede manejarse con inductores de resistencia, como parte de MIPE H 3 PO 4 al 25% y NF fueron los mejores tratamientos

35 Conclusiones Con H 3 PO 4 se aumentó la producción de racimos en 37% en plantas sanas y 23% en enfermas

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