11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 5 : A61K 49/00

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1 19 OFCNA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 N. de publicación: ES nt. Cl. : A61K 49/00 12 TRADUCCON DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Agentes de contraste por ultrasonidos a base de burbujas de gas y micropartículas que contienen ácidos grasos. Prioridad: DE Titular/es: Schering Atiengesellschaft Berlin und Bergamen Müllerstrasse 170/178 Postfach D-133 Berlin, DE 4 Fecha de la publicación de la mención BOP: nventor/es: Lange, Lothar; Hilmann, Jürgen; Fritzsch, Thomas y Siegert, Joachim 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: Agente: Lehmann Novo, María sabel Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). enta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRPCON El invento se refiere a agentes de contraste para el diagnóstico por ultrasonidos a partir de burbujas de gas y micropartículas, que están caracterizados porque ellos, en forma de micropartículas, contienen una mezcla de por lo menos un ácido graso con por lo menos una sustancia sólida que no es tensioactiva, en suspensión en un vehículo líquido, utilizándose, en calidad de ácido graso, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido araquidónico, y, como sustancia sólida, que no es tensioactiva, galactosa, fructosa, glucosa, lactosa y/o α-ciclodextrina. La investigación de órganos con ultrasonidos (sonografía) es un método de diagnóstico que se ha introducido y practicado bien desde hace algunos años. Las ondas de ultrasonidos en el margen de los mega-hercios (por encima de 2 megahercios con longitudes de onda entre 1 y 0,2 mm) son reflejadas en interfases de diferentes tipos de tejidos. Los ecos que se forman con ello son amplificados y hechos visibles (visualizados). En este caso, es especialmente importante la investigación del corazón con este método, que es denominada ecocardiografía (Haft, J.. et al.; Clinical echocardiography (ecocardiografía clínica), Futura, Mount Kisco, New Yor 1978; Köhler, E., Klinische Echoardiographie (ecocardiografía clínica), Ene, Stuttgart 1979; Stefan, G. et al.: Echoardiographie (ecocardiografía), Thieme, Stuttgart- New Yor 1981; G. Biamino, L. Lange: Echoardiographie, Hoechst AG, 1983). Puesto que los líquidos - también la sangre - proporcionan contrastes en la imagen B de ultrasonidos sólo cuando se presentan diferencias de densidad respecto al entorno, se han buscado posibilidades de hacer visibles la sangre y su corriente para una investigación de imágenes B de ultrasonidos, lo que también es posible mediante la adición de burbujas finísimas de gas. Si se utilizan las reflexiones débiles del ultrasonido en los glóbulos rojos de la sangre durante la investigación por ultrasonidos del corazón o de los vasos, y si se aprovecha el denominado fenómeno de Doppler, se puede representar la corriente sanguínea incluso sin agentes de contraste. No obstante, también en este método es ventajosa la adición de pequeñas burbujas de gas a la corriente sanguínea, dado que las reflexiones más fuertes en las burbujas de gas permiten un mejor tratamiento y aprovechamiento de la imagen [Z. Kardiol. 77: (1.988)]. De la bibliografía se conocen varios métodos para la preparación y estabilización de las burbujas de gas. Estas se pueden producir, por ejemplo, antes de la inyección en la corriente sanguínea, sacudiendo o agitando enérgicamente soluciones, tales como soluciones salinas, soluciones de colorantes, o una sangre previamente extraída. A pesar de que con ello se consigue una formación de contraste por ultrasonidos, estos métodos están vinculados a graves desventajas, que se exteriorizan en una mala reproducibilidad, un tamaño de las burbujas que fluctúa grande mente y - debido a una porción de grandes burbujas visibles - un cierto riesgo de embolias. Estas desventajas se solventaron parcialmente mediante otros procedimientos de producción, tales como, por ejemplo, el procedimiento descrito en el documento de patente estadounidense US , en el cual se producen burbujas con un tamaño reproducible mediante filtración o mediante utilización de un dispositivo de electrodos que está sometido a una corriente continua. A la ventaja existente en la posibilidad de poder producir burbujas de gas con un tamaño reproducible, se opone como desventaja el considerable esfuerzo técnico. En el documento de patente US se describe la producción de burbujas de gas con un tamaño definido que están rodeadas por una envoltura de gelatina que las protege de su confluencia. La conservación de las burbujas terminadas sólo se puede realizar en el estado congelado, por ejemplo, mediante conservaciónalatemperatura de un frigorífico, debiendo de ser llevadas de nuevo a la temperatura corporal para su utilización. En el documento de patente US se describen la producción y la utilización de burbujas de gas con una envoltura sólida de sacáridos, que pueden estar llenas con un gas que se encuentre bajo presión. Si éstas se encuentran bajo presión normal, se pueden emplear como agentes de contraste por ultrasonidos; en el caso de su utilización con una presión interior elevada, sirven para la medición de la presión sanguínea. A pesar de que, en este caso, la conservación de las burbujas sólidas de gas no representa ningún problema, el esfuerzo técnico en la producción es un considerable factor de costes. Los riesgos de los agentes de contraste que están a disposición según el estado de la técnica, son provocados por dos factores: el tamaño y el número tanto de las partículas de sustancia sólida como de las burbujas de gas. El estado de la técnica explicado hasta ahora permite la preparación de agentes de contraste por ultrasonidos, que poseen siempre solamente algunas de las propiedades exigidas: 1. Exclusión del riesgo de embolias - burbujas de gas (tamaño y cantidad) - partículas de sustancia sólida (tamaño y cantidad) 2. Reproducibilidad 3. Estabilidad suficientemente larga 4. Transitabilidad pulmonar, por ejemplo, para obtener el contraste por ultrasonidos de la parte izquierda del corazón. Transitabilidad capilar 6. Esterilidad y carencia de pirógenos del preparado 2

3 3 ES T Elaborabilidad sencilla con un gasto económico soportable 8. Mantenimiento de reservas sin problemas. En la solicitud de patente europea con el número de publicación 2.7 se describe ciertamente la producción de burbujas de gas que deben de poseer estas propiedades exigidas. Para su preparación se suspenden micropartículas de una sustancia cristalina sólida, tal como, por ejemplo, galactosa, en un líquido de vehículo, verificándose que el gas, que está adsorbido en la superficie de las partículas, o está encerrado en cavidades entre las partículas o en cavidades intercristalinas, forma las burbujas de gas. Las suspensión así formada, de burbujas de gas y micropartículas, es inyectada en el espacio de minutos. A pesar de que en el documento de patente europea 2.7 se afirma que la suspensión preparada según el método descrito es adecuada para aparecer, después de la inyección en una vena periférica, tanto en la parte derecha del corazón como, después de pasar por el pulmón, en la parte izquierda del corazón, y visualizar allíla sangre y su corriente durante la investigación por ultrasonidos, esta afirmación no soportó positivamente una comprobación posterior. Así, se ha comprobado que los agentes de contraste preparados según el método descrito en la solicitud de patente europea 2.7 e inyectados en una vena periféricanoproducían ningún eco de ultrasonidos en la parte izquierda del corazón. También en el documento de patente europea EP-A se describe la preparación de una mezcla líquida para su utilización como agente de contraste, que, por su parte, se compone de una mezcla de un agente tensioactivo o de una solución acuosa del agente tensioactivo y de un líquido acuoso de vehículo viscoso. En la solicitud de patente europea publicada (n de publicación ) se describe un agente reforzador del contraste por ultrasonidos, que contiene micropartículas y burbujas de gas, el cual, después de su aplicación por vía intravenosa y de pasar por los pulmones, se adecua para reforzar la formación de contraste de la parte izquierda del corazón, del miocardio, asícomode otros órganos, tales como el hígado, el bazo y los riñones. Ciertamente, en esta solicitud también se mencionan ácidos grasos ( ácidos grasos (C 4 - C ) saturados o insaturados ) como adecuados para la preparación de micropartículas, pero en los ejemplos sólo se citan a modo de ejemplos sus ésteres o sales como sustancias tensioactivas, tales como, por ejemplo, palmitato de ascorbilo o monopalmitato de sacarosa. Sin embargo, éstas tienen la desventaja de que, al formular, se descomponen con relativa rapidez ya durante el almacenamiento bajo condiciones normales (2 C) (véase la Tabla). Esto es perjudicial en atención a un preparado comercial y a sus requisitos de pureza TABLA: nvestigación de estabilidad Formulación:A galactosa + 0,134 % de palmitato de ascorbilo B galactosa + 0,1 % de ácido palmítico Estabilidad química de los aditivos en dependencia de la temperatura de almacenamiento y del tiempo Duración de Formulación almacenamiento A B % (m/m) de % (m/m) palmitato de de ácido ascorbilo palmítico comienzo 0 % 0 % 6 semanas temperatura ambiente 84,3 % no investigado C 67,9 % no investigado 0 C 33,6 % 97,7 % 12 semanas temperatura ambiente 79,8 % 98,0 % C 3,7 % 98,4 % 0 C 18,7 % 9,1 % ntensidad del contraste: Aladisminución del contenido de aditivo va unida una reducción del contraste de la parte izquierda del corazón. Por tanto, el invento tiene como misión poner a disposición agentes, así como procedimientos para su preparación, que no posean esta desventaja. Mediante la utilización de los ácidos grasos ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido araquidónico, como sustancias tensioactivas se resuelve el problema planteado por esta misión. Los agentes de contraste por ultrasonidos de acuerdo con el invento, obtenidos mediante suspensión de las micropartículas de acuerdo con el invento en un vehículo líquido, después de su aplicación por vía intravenosa, están en situación de hacer visibles para los ultrasonidos la sangre y sus condiciones de circulación, no sólo en la parte derecha del corazón, sino también, después de pasar por el lecho capilar de los pulmones, en la parte izquierda del corazón. Además, manifiestan sorprendentemente un mayor efecto de refuerzo y una mejor reproducibilidad del contraste por ultrasonidos que los agentes de contraste por ultrasonidos del estado de la técnica. La sustancia tensioactiva en las micropartículas se utiliza en una concentración de 0,01 hasta por ciento en peso, preferiblemente de 0,04 hasta 1 por ciento en peso. Las micropartículas se componen de una mezcla de por lo menos una de las sustancias ten- 6 3

4 ES T3 6 sioactivas mencionadas con por lo menos una sustancia sólida cristalina, no tensioactiva, fisiológicamente compatible, utilizándose como sustancia sólida cristalina, no tensioactiva, fisiológicamente compatible, galactosa, fructosa, lactosa y/o α- ciclodextrina. Estas se encuentran contenidas en las micropartículas en una concentración de 9 hasta 99,99 por ciento en peso. Para la preparación de las micropartículas se recristalizan las sustancias previstas para ello bajo condiciones asépticas. A continuación, éstas se desmenuzan bajo condiciones asépticas, por ejemplo, mediante molienda en un molino de chorros de aire, hasta que se haya conseguido el deseado tamaño de partículas. Se pretende un tamaño de partículas, comparable al de los eritrocitos, de < µm, preferiblemente de < 8 µm. El valor medio del material micronizado está situado en 1-3 µm. El tamaño de partículas se determina en aparatos de medición adecuados. Las micropartículas producidas se componen de una mezcla de sustancia tensioactiva y de una sustancia sólida no tensioactiva. Tanto el tamaño de las micropartículas, conseguido mediante el proceso de desmenuzamiento, como el tamaño de los burbujas de gas, contenidas en los agentes de contraste de acuerdo con el invento, garantiza un paso sin peligros por el sistema capilar y por el lecho capilar de los pulmones y excluye la formación de embolias. El gas requerido para la formación de contraste (por ejemplo, aire, nitrógeno o argón) es transportado por las micropartículas. Está absorbido parcialmente en la superficie de las micropartículas y encerrado en las cavidades entre las micropartículas o intercristalinamente. El volumen de gas transportado por las micropartículas en forma de burbujas de aire es de 0,02 hasta 0,6 ml por gramo de micropartículas. Como vehículos líquidos entran en consideración agua, soluciones acuosas de una o varias sales inorgánicas, como una solución fisiológica de cloruro de sodio y soluciones de tampón, soluciones acuosas de mono- o di-sacáridos, tales como galactosa, glucosa o lactosa, alcoholes uni- o plurivalentes, siempre y cuando sean fisiológicamente compatibles, tales como etanol, propanol, alcohol isopropílico, poli(etilenglicol), etilenglicol, glicerol, propilenglicol, propilenglicol-metil-éter o sus soluciones acuosas. Se prefieren agua y soluciones fisiológicas de electrólitos, tales como soluciones fisiológicas de cloruro de sodio, así como soluciones acuosas de azúcares, tales como, por ejemplo, galactosa, glucosa, fructosa y lactosa. Si se utilizan soluciones, la concentración de la sustancia disuelta es de 0,1 hasta por ciento en peso, preferiblemente de 0, hasta 1 por ciento en peso; se utiliza especialmente agua, una solución acuosa de cloruro de sodio al 0,9 % o una soluciónacuosa de galactosa al -6 %. El invento se refiere también a un procedimiento para la preparación del agente de acuerdo con el invento, según la reivindicación 8. Para la preparación del agente de contraste por ultrasonidos, el líquido de vehículo estéril se añade a la combinación estéril presente en forma de micropartículas, de por lo menos una de los siguientes ácidos grasos - ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido araquidónico - con por lo menos una de las siguientes sustancias que no son tensioactivas - galactosa, fructosa, glucosa, lactosa y/o α- ciclodextrina - y se agita esta mezcla hasta que se haya formado una suspensión homogénea, para lo que se necesitan hasta segundos. La suspensión que se ha formado es inyectada inmediatamente después de su preparación, como muy tarde, sin embargo, después de minutos, en forma de bolo en una vena periférica o en un catéter ya existente, aplicándose de 0,01 hasta 1 ml/g de peso corporal. Por motivos de conveniencia, los componentes requeridos para la preparación del agente de acuerdo con el invento, tales como el líquido de vehículo (A) y las micropartículas de la combinación de ácido graso y sustancia sólidanoten- sioactiv (B), se conservan, en la cantidad requerida para la investigación, estérilmente en dos recipientes. Los dos recipientes (viales) tienen unos cierres que hacen posible la extracción y la adición mediante una jeringa de inyección bajo condiciones estériles. El tamaño del recipiente B está concebido de tal manera que el contenido del recipiente A se pueda transferir mediante una jeringa de inyección al recipiente B y que los componentes reunidos puedan ser agitados. La ejecución de la investigación ecocardiográfica en un pavián de g de peso deberá ilustrar la utilización del agente de contraste de acuerdo con el invento: 8, ml de líquido de vehículo (véanse los Ejemplos de ejecución) se extraen de un vial con una jeringa de inyección y se añaden a 3 g de micropartículas, que se encuentran en un segundo vial, y se agitan durante aproximadamente hasta segundos hasta que se haya formado una suspensión homogénea. Se inyectan 2 ml de esta suspensión en una vena periférica (. jugularis, brachialis o saphena) a través de un grifo de 3 vías con una velocidad de infusión de por lo menos 1 ml/s, mejor de 2-3 ml/s. A la inyección de agente de contraste le sigue con la misma velocidad, inmediatamente después, la inyección de ml de una solución fisiológica de cloruro de sodio para que el bolo del agente de contraste se conserve tanto tiempo como sea posible. Antes, durante o después de la inyección se sujeta una sonda sonora usual en el comercio para la ecocardiografía junto al tórax del animal de ensayo, de manera que se obtiene una sección transversal típica a través de las partes derecha e izquierda del corazón. Esta disposición de ensayo corresponde al estado de la técnica y es conocida para un especialista. Cuando el agente de contraste por ultrasonidos llega a la parte derecha del corazón, se puede seguir, en la imagen de eco en dos dimensiones o en la imagen de eco en el modo M, cómo la sangre que ha sido marcada por el agente de contraste llega primero a la altura de la aurícula derecha, luego a la del ventrículo derecho y a la de la arteria pulmonar, presentándose durante un período de tiempo suficiente para la investigación diagnóstica un llenado homogéneo. Mientras que las cavidades de la parte derecha del corazón se van vaciando otra vez en la imagen 4

5 7 ES T3 8 de ultrasonidos, la sangre marcada con el agente de contraste, después de haber pasado por los pulmones, aparece de nuevo en las venas pulmonares, llena homogéneamente la aurícula izquierda, el ventrículo izquierdo y la aorta, manteniéndose el contraste durante más tiempo que en la parte derecha del corazón. Junto a la representación del flujo sanguíneo por las cavidades de la parte izquierda del corazón, se llega también a un contraste del miocardio, que refleja la irrigación sanguínea. Sin embargo, la utilización del agente de contraste por ultrasonidos de acuerdo con el invento no está limitada a la visualización de la corriente sanguínea en la parte arterial del corazón, después de la aplicación por vía venosa, sino que éste se utiliza también como agente de contraste, con gran éxito, en la investigación de la parte derecha del corazón y de otros órganos. Ejemplo 1 6- C bajo condiciones asépticas. 2 g de ácido palmítico se disuelven en 1 g de etanol, se filtran en condiciones C y 0 mbar de depresión. D 1 µm D 0 2, µm D 90 µm el granulómetro Cilas 71). realiza en viales de ml a razón de 3 Al vial de ml, que contiene 3 g de micropartículas, de inyección 8, ml de agua para fines una suspensión homogénea (- segundos) Ejemplo 2 6- C bajo condiciones asépticas. 2gdeácido mirístico se disuelven en 1 g de etanol, se filtran en condiciones C y 0 mbar de depresión. D 1 µm D 0 2, µm D 90 µm el granulómetro Cilas 71). realiza en viales de ml a razón de 3 Al vial de ml, que contiene 3 g de micropartículas, de inyección 8, ml de agua para fines una suspensión homogénea (- segundos). Ejemplo 3 6- C bajo condiciones asépticas. 2gdeácido esteárico se disuelven en 1 g de etanol, se filtran en condiciones C y 0 mbar de depresión.

6 9 ES T3 D 1 µm D 0 2, µm D 90 µm el granulómetro Cilas 71). realiza en viales de ml a razón de 3 Al vial de ml, que contiene 3 g de micropartículas, de inyección 8, ml de agua para fines una suspensión homogénea (- segundos). Ejemplo 4 6- C bajo condiciones asépticas. 1gdeácido mirístico+1gdeácido araquidónico se disuelven en 1 g de etanol, se filtran en condiciones C y 0 mbar de depresión. D 1 µm D 0 2, µm D 90 µm el granulómetro Cilas 71) realiza en viales de ml a razón de 3 Al vial de ml, que contiene 3 g de micropartículas, de inyección 8, ml de agua para fines una suspensión homogénea (- segundos). Ejemplo A) Preparación del líquido de vehículo: Se disuelven g de galactosa en agua para fines de inyección (p.i.), se completan hasta un volumen de ml, se filtran a través de un filtro de 0,2 µm, se envasan en cada caso ml de la solución filtrada en viales de ml, y se esterilizan durante 1 minutos a 121 C. 6- C bajo condiciones asépticas. 1 g de ácido palmítico + 1 g de ácido esteárico se disuelven en 1 g de etanol, se filtran en condiciones estériles yseañaden a con agitación. C y 0 mbar de depresión. D 1 µm D 0 2, µm D 90 µm el granulómetro Cilas 71). realiza en viales de ml a razón de 3 Al vial de ml, que contiene 3 g de micropartículas, se le transfieren mediante una jeringa de inyección 8, ml de una solución de galactosa A y se agita hasta que se forme una suspensión homogénea (- segundos). 6

7 11 ES T3 12 RENDCACONES 1. Agente de contraste para el diagnóstico por ultrasonidos de burbujas de gas y micropartículas, que se compone de una mezcla de por lo menos una sustancia sólida no tensioactiva y de un ácido graso, en suspensión en un vehículo líquido, caracterizado porque las micropartículas contienen como ácido graso ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido araquidónico en una concentración de 0,01 hasta por ciento en peso y, como sustancia sólida no tensioactiva contienen galactosa, fructosa, glucosa, lactosa y/o α-ciclodextrina. 2. Agente de acuerdo con la reivindicación 1, que contienen ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido araquidónico en una concentración de 0,04 hasta 1 por ciento en peso. 3. Agente de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque como vehículo líquido fisiológicamente compatible contiene agua, una solución fisiológica de un electrólito, la solución acuosa de alcoholes uni- o pluri-valentes, tales como glicerol, poli(etilenglicol) o propilenglicolmetil-éter o la solución acuosa de un mono- o disacárido Agente de acuerdo con la reivindicaciones 1 y6,caracterizado porque como vehículo líquido fisiológicamente compatible contienen agua, una solución fisiológica de cloruro de sodio o una solución acuosa de galactosa al hasta 6 %.. Agente de acuerdo con la reivindicación 1, a base de una mezcla de ácido palmítico y galactosa, en suspensión en agua. 6. Agente de acuerdo con la reivindicación 1, a base de una mezcla de ácido mirístico y galactosa, en suspensión en agua. 7. Agente de acuerdo con la reivindicación 1, de una mezcla de ácido esteárico y galactosa, en suspensión en agua. 8. Procedimiento para la preparación de un agente de contraste para el diagnóstico por ultrasonidos que contiene micropartículas y burbujas de gas, caracterizado porque se reúnen micropartículasquesecomponendeácido mirístico, palmítico, esteárico y/o araquidónico y galactosa, fructosa, glucosa, lactosa y/o α-ciclodextrina con un líquido de vehículo y se agita hasta que se forme una suspensión homogénea NOTA NFORMATA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 7