GUIA DEL EXPERIMENTO DE CAMPO PARA EL SEMESTRE Susana Gómez Posada

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1 GUIA DEL EXPERIMENTO DE CAMPO PARA EL SEMESTRE I. IDENTIFICACION DE LA PRÁCTICA DE CAMPO Nombre de curso MICROBIOLOGIA DEL SUELO Código de curso Nombre Director curso del del Nombre de la practica Objetivos de la práctica de campo Justificación Mecanismo mediante el cual se evaluará la práctica: Valor asignado a la Guía de práctica: Susana Gómez Posada CICLOS BIOGEOQUÍMICOS E INTERACCIONES MICROBIANAS Verificar la influencia de los microorganismos en la mineralización de materia orgánica y en la producción de sustancias estimulantes de crecimiento para las plantas, la forma en que los microorganismos intervienen en los ciclos biogeoquímicos y por tanto son responsables del ciclaje de nutrientes y la fertilidad del suelo. Identificar los factores que afectan las interacciones a nivel de rizòsfera y sus repercusiones en el desarrollo de las plantas. El estudiante Deberá identificar claramente como diferentes tipos de microorganismos, con diferentes tipos de metabolismo, intervienen en cada una de las etapas de cada ciclo biogeoquímico y como la actividad microbiana influye en todos los procesos edáficos y pedogeneticos. El estudiante podrá evidenciar la forma en que ocurren algunos de los mecanismos de interacción entre las raíces de las plantas y la biota del suelo, la forma como los factores ambientales inciden en esos procesos de interacción y la forma en que el desarrollo y salud de la planta depende en gran parte de esas interacciones. Documento escrito según lo solicitado en esta guía y rubrica de evaluación 50/500 El tutor del CEAD calificará 30 de 50 puntos El tutor virtual calificará 20 de 50 puntos

2 NOTA IMPORTANTE PARA TENER EN CUENTA: La practica con el tutor del CEAD NO EXIME al estudiante de presentar en el foro detrabajo colaborativo 3, el ARTICULO CIENTIFICO resultante del análisis y discusión de resultados del experimento. El montaje del EXPERIMENTO, no requiere de la presencia de un tutor. Se trata de un ensayo sencillo, que en caso de que el tutor de práctica aun no haya sido contratado, podrá hacer sin ningún problema siguiendo paso a paso las instrucciones de ésta guía. Posteriormente, cuando el tutor esté contratado, usted ya debe tener el experimento montado y debe estar recogiendo información cuya interpretación luego podrá discutir con el tutor. Así, aunque la contratación de los tutores acompañantes se demore, el estudiante está en la obligación de hacer el montaje del ensayo desde el mes de febrero, a fin de poder observar resultados y la directora de curso y los tutores virtuales, estarán atentos a solucionar sus inquietudes si las publica a tiempo por mensajería interna o por vía telefónica. Las actividades de practica son las descritas en ésta guía y por ningún motivo deben ser cambiadas a criterio del tutor del CEAD. Tampoco deberán utilizar guías de semestres anteriores.

3 II. METODOLOGIA OBJETIVO DE LA PRACTICA : A partir de un experimento sencillo, el estudiante deberá reconocer la influencia de la actividad microbiana sobre el ciclaje de nutrientes y los procesos de crecimiento, desarrollo y salud de las plantas. III. ACTIVIDADES A DESARROLLAR ACTIVIDAD 1. ENSAYO DE RIZÓSFERA Y CICLOS BIOGEOQUÍMICOS MARCO TEORICO Las raíces al tiempo que se desarrollan, producen diferentes tipos de sustancias que cumplen funciones específicas y que permiten a la planta adaptarse al medio y sobrevivir. En términos generales se ha denominado rizodeposiciòn a los compuestos de carbono producidos por la raíz (lisados, excreciones y secreciones). Las rizodeposiciones modifican el suelo rizosférico al generar cambios geoquímicos de transformación de minerales y materia orgánica así como modificaciones de los contenidos de humedad disponible, ph, disponibilidad y/o agotamiento de nutrientes, ciclaje de nutrientes de las fases cambiable y no cambiable y potencial redox. La rizósfera no es un continuum sino que sufre variaciones a lo largo del eje radical dependiendo de las condiciones del suelo circundante y de las necesidades especificas de la raíz. Las plantas de acuerdo a las características fisiológicas propias de cada especie, desarrollan mecanismos de adaptación que les permiten sobrevivir en condiciones ambientales adversas. Algunas son más exitosas que otras, pero todas modifican el suelo rizosférico generando efectos de diferente índole según necesidades específicas de adquisición de agua y nutrientes, mecanismos de defensa o promoción de interacciones benéficas como asociaciones con micorrizas o simbiosis con Rhizobium. Aunque la investigación en torno a Rizósfera se ha desarrollado fuertemente durante el último siglo, aun siguen sin ser dilucidados muchos de los mecanismos,

4 procesos y naturaleza de los compuestos que hacen parte del efecto rizosférico de plantas. De otro lado, los cambios generados por la influencia de la raíz en las propiedades físicas, químicas y biológicas, son complejos e involucran cambios sustanciales a nivel de ultraestructura y geoquímica del suelo, cambios que no pueden delimitarse en un espacio preciso para ser cuantificados, pues el efecto rizosférico es diferencial a lo largo del eje radical y depende de las condiciones agroecológicas circundantes. Sin embargo, es posible tener un acercamiento al efecto rizosférico en relación al ambiente mediante observaciones del desarrollo fenológico de las plantas, tomando como indicadores variables de crecimiento, balance entre el desarrollo parte aérea /parte radical y colonización por microorganismos simbiontes, parámetros que permiten evaluar el desarrollo de la planta en términos de fijación de carbono en materia seca, o gasto del mismo en mecanismos de sobrevivencia a expensas de los rendimientos y desarrollo general de la planta. Así, tendremos en cuenta que las dinámicas microbianas en la rizósfera de las plantas son de doble vía, por un lado están influidas por las condiciones ambientales, los contenidos de materia orgánica y la salud del suelo. Al mismo tiempo, la actividad y metabolismo microbiano al tiempo que participa de la mineralización de la materia orgánica, activa los ciclos biogeoquímicos y libera a la rizósfera no solo nutrientes sino enzimas y metabolitos que actúan como estimulantes del crecimiento vegetal y reguladores de crecimiento microbiano. Este ensayo pretende evaluar el efecto de diferentes sustratos de siembra y de la fertilización química y orgánica sobre el desarrollo de plantas, el establecimiento de simbiosis y las modificaciones en la arquitectura radical como estrategias de la planta para asegurar su supervivencia. El establecimiento de cualquier tipo de simbiosis ocurre siempre a expensas de un costo de Carbono 1 y por ello, son catalogadas como relaciones de parasitismo, cuyos efectos negativos en la merma de acumulación de Carbono por la planta son evidentes en los estados iniciales de la simbiosis. Con éste ensayo también podremos evidenciar los efectos de los microorganismos celulolíticos sobre la mineralización de la materia orgánica, la liberación de elementos a la solución del suelo y los efectos de antibiosis y estimulación de crecimiento que provocan en la planta. 1 El costo de carbono se refiere a la cantidad de C que se gasta para hacer la simbiosis y que de no haberla, sería transformado en biomasa.

5 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION Objetivo General Reconocer la influencia de los factores ambientales sobre las interacciones Rizosfericas y la manera en que dichas interacciones inciden en el desarrollo y salud de la planta. Objetivos específicos: Evaluar el efecto de la calidad del suelo y la fertilización química y orgánica en el establecimiento de relaciones simbióticas. Evaluar el efecto de la simbiosis sobre el desarrollo de la planta y los cambios en la arquitectura de la raíz. MATERIALES Y METODOS Para realizar esta actividad usted necesitará: Bolsas plásticas negras de almácigo o macetas de plástico con capacidad para una libra de suelo. Profundidad mínima del recipiente 18 cms. 8 kilos de suelo pobre o de horizonte B con bajo contenido de MO, 4 kilos de suelo de capote rico en materia orgánica. Materia orgánica compostada 4 kilos. Debe describir claramente el tipo de materia orgánica utilizada ya que todas son diferentes dependiendo de su composición y proceso de compostaje. Micorrizas 60 gramos de micorriza comercial fresca (fecha de procesamiento no mayor a 3 meses). Si no puede conseguir micorriza comercial, podrá obtenerla así: Ubique un cultivo de maíz o sorgo que esté rodillero, en estado vegetativo, arranque unas 40 plantas, separe la raíz de las plantas, triture la raíz de las plantas finamente hasta casi obtener polvo. Revuelva las raíces pulverizadas con unos 30 gramos de suelo rizosférico

6 de donde arrancó esas plantas. El producto obtenido contiene micorrizas activas e inoculo de Trichoderma harzianum. Otra forma de obtener micorrizas es dirigirse a un cultivo de Pinos e identificar los sitios en donde se encuentran sombrillitas de hongos. En el lugar en donde se ubiquen esos hongos bastará con escarbar a unos 10 cms de profundidad y extraer tierra de mantillo 2 que tendrá una gran cantidad de inoculo de micorrizas. De cualquiera de las dos opciones anteriores necesitara 300 gramos. Semillas de maíz. EM bio activador de mineralización de materia orgánica ( 50 cc), Bacthon o similares. METODOLOGIA 2 El mantillo de bosque es un sustrato rico en microorganismos y micorrizas. Muchos de los hongos en forma de sombrilla que se ven junto a los árboles son las estructuras aéreas de hongos micorrizicos. Igualmente, el maíz es una planta que facialmente hace simbiosis con micorrizas y es utilizado para la producción masiva de estas. Las micorrizas comerciales son generalmente una mezcla de tierra o arena y raíces molidas de plantas de maíz que han sido previamente inoculadas con varias cepas de micorrizas. El mejor momento para recolectar las raíces inoculadas con micorrizas es cuando el maíz está rodillero.

7 Se establecerá un experimento con un diseño Completamente al azar con 5 tratamientos y cada tratamiento con TRES repeticiones para un total de plantas sembradas. Tres repeticiones para cada tratamiento TRATAMIENTOS T1. Maíz sin inocular en suelo de capote (fértil) T2. Maíz sin inocular en suelo pobre (Horizonte B) T3. Maíz sin inocular en suelo pobre + 1 gramo de fertilizante químico (urea o triple 15) T4. Maíz en suelo pobre, inoculado con Micorrizas 5 gramos por bolsa T5. Maíz en suelo pobre + compost 3 + Micorriza 5 gramos por bolsa + EM Inicialmente deberá sembrar tres semillas por bolsa. Una vez aparezcan las hojas verdaderas deberá dejar una sola planta por bolsa, dejando la más vigorosa. b) Precisará la información climática presente en el sitio del ensayo: temperatura promedio, precipitación promedio, altura sobre el nivel del mar, humedad relativa. c) Asegurará que las plantas estén en condiciones óptimas, es decir que controlará las condiciones del experimento minimizando al máximo el error experimental. Por ningún motivo la perdida de plantas por falta de cuidado será excusa para no hacer el análisis de resultados. d) Llevará registros semanales durante 6 a 8 semanas del desarrollo de las plantas. Tomará datos semanales para las siguientes variables PARA CADA REPETICION Y TRATAMIENTO: A manera de ejemplo se presenta la tabla para la primera semana. 3 Para los tratamientos suelo pobre + compost: Mezclar 2/3 de suelo + 1/3 de compost. Esta será la mezcla con que llenará las bolsas

8 SEMANA N 1 TRATAMIENTO VARIABLE de respuesta 1 Altura + cm Nº hojas totales 2 Altura + cm Nº hojas totales 3 Altura + cm Nº hojas totales 4 Altura + cm Nº hojas totales 5 Altura + cm Nº hojas totales REPETICIONES R1 R2 R3 Promedio por tratamiento El dato final de cada variable corresponde al promedio de las tres repeticiones. Al finalizar el seguimiento, tendrá 6 o 7 tablas diligenciadas, una para cada semana. e) En la última semana de seguimiento (mínimo 6, máximo 8), o en el momento en que se perciban los primeros síntomas de deficiencias nutricionales, se cosechan las plantas (las deficiencias indican que la raíz ha agotado los nutrientes disponibles en el volumen de suelo de la bolsa). En cualquier caso, las plantas deben permanecer como mínimo 6 semanas en las bolsas o macetas. f) Al momento de cosechar las plantas se toman datos de todas las variables.

9 Luego, se separa parte aérea y raíces de cada planta. Con ayuda de una gramera, tomará peso fresco de raíz y peso fresco de parte aérea. Recuerde que tienen tres datos por cada variable tratamiento y que el dato final de cada variable es el promedio de las tres repeticiones. g) Para medir el volumen final de raíces y de parte aérea, deberá conseguir una probeta graduada de 200 ml o más. Se llena la probeta con 100 cc de agua, se introducen las raíces de la planta (bien lavadas, sin arena o suelo) y se mide el volumen de agua desplazado que será equivalente al volumen de raíz. Igual para la parte aérea, cortará las hojas en tozos que pueda acomodar dentro de la probeta para medir el volumen de la parte aérea. h) Si en su CEAD tienen acceso a laboratorio de microbiología, podrán hacer determinación de porcentaje de colonización de micorrizas para cada tratamiento y repetición por el método de tinción de raíces (OPCIONAL). Así, obtendrá las siguientes mediciones: SEMANA 8. TRATAMIENTO COSECHA DE PLANTAS VARIABLE de respuesta 1 Altura final parte aérea cm Nº hojas TOTAL Peso fresco raíz en gramos raíz en cm 3 Peso fresco parte aérea en gramos parte aérea en cm 3 Porcentaje de colonización de raíces(opcional) REPETICIONES R1 R2 R3 Promedio por tratamiento ++ para cada variable.

10 2 Altura parte aérea cm Nº hojas TOTAL Peso fresco raíz en gramos raíz en cm 3 Peso fresco parte aérea en gramos parte aérea en cm 3 3 Altura parte aérea cm Nº hojas TOTAL Peso fresco raíz en gramos raíz en cm 3 Peso fresco parte aérea en gramos parte aérea en cm 3 4 Altura parte aérea cm Nº hojas TOTAL Peso fresco raíz en gramos raíz en cm 3 Peso fresco parte aérea en gramos parte aérea en

11 cm 3 5 Altura parte aérea cm Nº hojas TOTAL Peso fresco raíz en gramos raíz en cm 3 Peso fresco parte aérea en gramos parte aérea en cm 3 ANALISIS y DISCUSION De RESULTADOS TRATAMIENTO DE DATOS: Parámetros estadísticos de tendencia central A. Con los datos semanales y finales de altura, sacarán valores promedio y desviación estándar para cada tratamiento. Con los valores promedio, construirán la grafica de crecimiento, comparando los tratamientos. Deberán analizar los resultados en términos biológicos de cómo las interacciones microbianas afectaron la curva de desarrollo de las plantas en cada tratamiento ya que se debieron las diferencias. En la misma grafica deben comparar las 5 curvas de crecimiento Obtendrá graficas como esta:

12 B. Usted obtendrá datos de crecimiento diferencial entre parte aérea y raíz que deberá graficar y analizar en términos del efecto rizosférico que se haya logrado en cada tratamiento. Ej: Peso fresco Peso fresco parte aérea Peso fresco raíz T1 T2 T3 Tratamientos De igual manera grafique los datos para volumen de parte aérea y volumen de raíz. Saque sus conclusiones desde el análisis de las interacciones microbianas y procesos microbiológicos que se sucedieron y afectaron el crecimiento de la planta. Tenga en cuenta que aquí se están sucediendo procesos de: Mineralización de materia orgánica, ciclaje de nutrientes, efecto promotor de crecimiento, competencia por Carbono en los estadios iniciales de la simbiosis, simbiosis como estrategia de sobrevivencia en ambientes adversos, factores que afectan las simbiosis. Por tanto, la primera pregunta que usted debe contestarse, es que tipo de relaciones Rizosféricas fueron recreadas en cada uno de los tratamientos y como se manifestaron en la planta. Luego podrá interpretar los resultados obtenidos. Deberá tener claro que el promedio de una medida se interpreta en términos de las unidades en que cada variable fue medida mientras que la desviación estándar y la varianza no tienen unidades y dan cuenta de que tanto se aleja una medición del promedio de la población. Deben tener muy claros sus conceptos de probabilidad, estadística y diseño experimental para poder interpretar los resultados. Al comparar promedios de cada variable en cada semana, debería poder ver diferencias de crecimiento en la primera medición entre tratamientos y posiblemente pueda ver un menor crecimiento INICIAL en las plantas micorrizadas el cual usted deberá explicar. C. ANALISIS DE VARIANZA

13 Realizará el análisis de Varianza ANAVA para el diseño Completamente al Azar del experimento con los valores FINALES obtenidos en la última semana y discutirá los resultados en términos de diferencias significativas o no significativas entre tratamientos. Si no ha cursado Diseño experimental o si ya lo hizo pero no tiene la competencia, busque asesoría con el tutor del CEAD para que hagan un ejercicio de entrenamiento. Cuando se realiza un diseño experimental, se plantean una serie de hipótesis de investigación relacionadas con las variables de respuesta a observar y a las que deberá darse comprobación y respuesta a través de la experimentación y el análisis de datos. El ANAVA para cada variable de respuesta permitirá responder a la Hipótesis de si hay o no diferencias significativas entre los tratamientos. Las variables para las que realizará ANAVA son: altura total, Peso fresco de parte aérea y peso fresco de raíz. Ejemplo: ANAVA para la variable Altura de Planta Fuente de GL SC CM Fc Ft variación Tratamientos Error Total Significancia En este ejemplo, tomaremos los datos finales de altura de planta para cada repetición, realizaremos el ANAVA y podremos refutar o confirmar la Hipótesis nula que en este caso se ha planteado así: H0: Para la variable altura de planta, no existe diferencia significativa entre los tratamientos. En términos biológicos se correspondería con: H0: La aplicación de compost, micorrizas y microorganismos eficientes, no tienen ningún efecto sobre el desarrollo de la planta en términos de altura, por tanto, no ofrecen ninguna ventaja competitiva en términos de disponibilidad de nutrientes. Si el ANAVA, NO arroja diferencias significativas entre tratamientos, diremos que no hubo ningún efecto rizosférico y que todas las plantas acumularon igual cantidad de C y se desarrollaron de igual forma en las diferentes condiciones ambientales.

14 Por el contrario, si el ANAVA arroja diferencias significativas entre tratamientos, habremos confirmado que las condiciones especificas de suelo, ambientales, contenido de MO y simbiosis, sí ejercen un efecto diferencial sobre el desarrollo de la planta, específicamente sobre la variable ALTURA. En caso de obtener diferencias significativas entre tratamientos, es necesario saber cuáles son los tratamientos que resultan diferentes entre sí y para ello debe hacer la prueba de Diferencia Mínima Significativa DMS, para saber cuáles tratamientos fueron diferentes y poder así interpretar los resultados. Puede consultar para mayor información sobre el ANAVA o ANOVA. En los ANEXOS DEL Documento FINAL, deben aparecer las tablas con los datos completos de seguimiento del experimento por semana y final. En el cuerpo del documento y en el artículo científico, solo deben parecer: 1. La tabla de parámetros estadísticos: promedio y varianza para cada variable de respuesta y cada tratamiento 2. Las tablas de ANAVA para cada variable de respuesta con su respectiva prueba DMS en caso de haber obtenido diferencias significativas. 3. Las gráficas 4. La discusión y explicación de esos resultados en términos biológicos de los procesos que se están estudiando. D. DISCUSION DE RESULTADOS Analizaran los resultados estadísticos y las graficas y sacarán sus conclusiones acerca de la influencia de las características del suelo, microbiota asociada y condiciones climáticas sobre la acumulación total de biomasa, la acumulación diferencial de biomasa en parte aérea y raíz, Área foliar fotosintéticamente activa, área de exploración de raíces y absorción de agua y nutrientes. Recuerde que cada una de las variables se convierte en un indicador de acumulación o gasto de carbono, de desbalances de crecimiento entre parte aérea y raíz o en indicador de un crecimiento deficiente o satisfactorio. A través de las variables de mediación, usted debe dar respuesta a los objetivos de investigación y demostrar como las relaciones rizosfèricas y el medio ambiente, influyen en el desarrollo de las plantas y como las plantas crean estrategias para hacer frente a condiciones adversas del medio.

15 Evidenciaran con base en resultados si las simbiosis ofrecen ventajas competitivas para las plantas en condiciones adversas. Evidenciarán si las condiciones físicas o químicas del suelo, limitan, impiden o favorecen que se lleve a cabo determinados tipos de simbiosis entre raízmicroorganismo. Revise nuevamente los artículos científicos que se analizaron en los trabajos colaborativos y el modulo, en donde encontrará el sustento científico para la discusión de sus resultados. Deberán hacer la discusión de resultados apoyados en literatura científica. Realizarán una mesa redonda de discusión con el tutor acompañante y compañeros. Sacarán conclusiones relevantes acerca de la naturaleza de las interacciones microbianas y rizosféricas y las implicaciones metabólicas que estas conllevan en gasto de carbono, acumulación de biomasa, salud de la planta, generación de suelos supresivos. Analizaran los resultados a la luz de la literatura científica y sacaran conclusiones acordes a los objetivos propuestos para la investigación.

16 ACTIVIDAD 2. ELABORACION DE INFORME PARA EL TUTOR DEL CEAD PARA CALIFICACIÓN DE PRÁCTICA DE CAMPO En grupo de CEAD o de forma individual, como prefieran, elaborarán un informe que entregarán al Tutor de PRACTICA del CEAD servirá para que él (o ella), les asigne la nota de práctica de campo. OJO: EL TUTOR DEL CEAD CALIFICARÁ 60 DE 100 PUNTOS. El documento se editará así: INTERACCIONES MICROBIANAS- PRACTICA DE CAMPO Participante 1, Participante 2, Participante n CEAD Nombre del Tutor acompañante de práctica: INTRODUCCION Objetivos e Hipótesis de investigación Materiales y Métodos Materiales Diseño experimental: Diseño, Tratamientos, variables de respuesta, análisis estadísticos, tipos de pruebas (ANAVA, DMS, Promedios, Varianza) Discusión de Resultados Conclusiones Referencias bibliográficas Anexos Anexo1. Tablas de datos semanales Anexo 2: Fotografías seguimiento ensayo y cosecha de plantas

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