Fermentación in vitro del extracto de Agave fourcroydes (henequén) por bacterias ácido lácticas

Transcripción

1 Revist Cun de Cieni Agríol, Tomo 46, Número 2, Fermentión in vitro del extrto de Agve fourroydes (henequén) por teris áido látis Ynelys Grí 1, Meredes G. López 2, R. Boourt 1, Zory Rodríguez 1, Judith Uris-Silvs 2 y Mgli Herrer 1 1 Deprtmento de Cienis Biofisiológis. Instituto de Cieni Animl, Aprtdo Postl 24,Sn José de ls Ljs, Myeque, Cu 2 Deprtmento de Biotenologí y Bioquími. Centro de Investigiones y Estudios de Avnzds del IPN, Cmpus Gunjuto. Aprtdo Postl 629, Irputo, Gunjuto, Méxio Correo eletrónio: ygri@ i.o.u Pr determinr l pidd de reimiento y fermentión de Ltoillus spp. y Bifidoterium spp. en preseni del extrto seo de Agve fourroydes (henequén) en ondiiones in vitro, se seleionron tres eps de Bifidoterium (B. dolesentes, B. ifidum, B. reve) y tres de Ltoillus (L. idophilus, L. sei, L. prsei). Se utilizó omo fuente energéti los preiótios omeriles Rftilos P95, Rftiline HP y el extrto seo de A. fourroydes, rio en oligosáridos de frutnos. Se usó el medio MRS sin gluos, omo ontrol. En los sos neesrios se diionó isteín. Se otuvo en todos los grupos de teris myor reimiento miroino (P < 0.001) y disminuión del ph del medio (P < 0.001) en preseni del extrto seo de A. fourroydes. Este fue superior l de ls fuentes de frutnos omeriles utilizds, on lt produión de áidos orgánios. Ls teris áido látis fermentron efiientemente el extrto seo de A. fourroydes, por lo que es un uen ndidto preiótio pr ser empledo en l limentión niml. Estos resultdos podrín generr trjos futuros on l finlidd de otener nuevos limentos funionles, omo los simiótios, on lo que se potenirín sus efetos. Plrs lve: frutnos, preiótio, ltoilos, ifidoteris, Agve fourroydes. L pliión de preiótios, omo ditivos promotores del reimiento en l limentión niml, onstituye un lterntiv efiiente y segur pr los sistems de produión intensiv, por los efetos enefiiosos que ejeren en l slud y el omportmiento produtivo de los nimles que están sometidos diversos ftores de estrés (Chunli et l y Jnssens y vn Loo 2006). L úsqued de nuevs fuentes de preiótios es de grn tulidd, pues están poo disponiles en el merdo internionl y ls produiones no stisfen ls neesiddes tules, lo que provo que sus preios se mntengn elevdos (Crro y Rnill 2002). El Instituto de Cieni Animl, en Cu, otuvo un extrto seo de A. fourroydes, rio en oligosárido de frutnos (Grí 2010) que se puede utilizr omo fuente energéti por teris áido látis. En el trto gstrointestinl, los Ltoillus spp. y Bifidoterium spp. son miroorgnismos enefiiosos que se relionn on funiones nutriionles, metólis y de proteión en el omplejo eosistem miroino y en el hospedero (Guo et l. 2004). Por tnto, es neesrio fvoreer su desrrollo pr mntener l euiosis intestinl. Diferentes investigiones ientífis reveln l pidd de estos miroorgnismos de utilizr los preiótios, entre ellos los frutnos, on elevd espeifiidd (Grí et l y Roerfroid 2007). Esto onstituye un herrmient importnte pr vlorr el efeto de estos rohidrtos y sus poteniliddes de uso in vivo omo preiótio en l limentión niml. El ojetivo de este trjo fue determinr l pidd de reimiento y fermentión de Ltoillus spp. y Bifidoterium spp. en el extrto seo de Agve fourroydes en ondiiones in vitro. Mteriles y Métodos Miroorgnismos y medios de ultivo. Se utilizron tres eps de Bifidoterium: Bifidoterium dolesentes ATCC 460 (BA), Bifidoterium ifidum ATCC (BBF) y Bifidoterium reve ATCC (BBR). Además, tres de Ltoillus: Ltoillus idophilus ATCC 250 (LA), Ltoillus sei ATCC 393 (LC) y Ltoillus prsei ATCC (LPC). Tods provenientes del no de ep internionl del Centro de Investigiones y Estudios de Avnzds, Unidd Irputo, Méxio. Como medio de ultivo se empleó el MRS (de Mnn et l. 1960) sin preseni de gluos y on l sustituión de gluos por tres fuentes de frutnos: extrto seo de A. fourroydes (rio en oligosárido de frutno) (Grí 2010) y los preiótios omeriles Rftilose P95 y Rftiline HP, de l firm ORAFTI. Ls sustituiones se relizron independientemente, onentrión de 20 g L -1. El ph iniil de los medios se justó 6,20. Pr el ultivo de ls ifidoteris, se diionó isteín hidrolóri (0. 05 %) omo gente redutor. Los medios de ultivo, sin l fuente de rono, se esterilizron 121 ºC durnte 15 min. Pr l preprión del medio MRS-frutno, se siguió l metodologí desrit por Urís-Silvs (2008). Proedimiento experimentl. L tivión de ls eps de ltoilos y ifidoteris se relizó en medio MRS líquido. Se inuron 37 ºC durnte 48 h.

2 204 Se tomron líuots de 1 ml de los tuos de ultivo de d ep evlur y se semrron en todos los medios de ultivo. L relión de inoulión fue de 1/10 (v/v). L inuión se relizó en tmósfer de CO 2, durnte 24 h, 37 ºC. Al finl del experimento, se determinó l pidd de reimiento miroino por estimión de densidd ópti medinte un espetrofotómetro UV-Visile, longitud de ond de 630 nm. En los medios on ultivo, el ph se luló on l utilizión del ph-metro digitl (Srtorius Meter PP-25) y l onentrión de áidos orgánios, medinte l romtogrfí líquid de lt resoluión, según Al-Tmimi et l. (2006). Análisis estdístio. Se utilizó diseño ompletmente letorizdo, on tres trtmientos y tres repetiiones por d ep. Pr el proesmiento de los dtos se relizó nálisis de vrinz. Pr hllr diferenis signifitivs se plió l prue de omprión de Dunn (1955), en los sos neesrios. Se empleó el pquete estdístio INFOSTAT versión 1 (Blzrini et l. 2001). Resultdos y Disusión Ls eps de Ltoillus spp. y Bifidoterium spp. no reieron en el medio sin gluos. Sin emrgo, ls teris en estudio, en medios de ultivo on frutnos, sí tuvieron reimiento (figurs 1y 2), lo que indi que fueron pes de utilizrlos omo fuente energéti. Los géneros Ltoillus spp. y Bifidoterium spp. presentn enzims frutosilfurnosidss, pes de degrdr los enles β presentes en ls estruturs químis de los frutnos (Proert y Gison 2002 y Ehrmnn et l. 2003). Est rterísti permite que se logren reimientos en los medios donde se utilizn estos rohidrtos omo fuente energéti. Revist Cun de Cieni Agríol, Tomo 46, Número 2, Al omprr ls tres fuentes de frutnos, el myor reimiento de ls eps fue en el medio on extrto seo de A. fourroydes (P < 0.001), mientrs que en los medios on Rftiline HP, frutnos de lto grdo de polimerizión, los reimientos fueron los más jos. Esto se pudier soir l omposiión quími del extrto seo y l diversidd estruturl presente en sus frutnos, sí omo l longitud de ls dens que, l estr onstituids por oligosáridos, son de más fáil degrdión por prte de ls teris áido látis, on respeto los polisáridos (vn den Broek et l. 2008). Diversos estudios demostrron que l preseni de oligofrutnos on estruturs heterogénes y diferentes tipos de enles, similres los enontrdos en los frutnos de A. fourroydes, induen l síntesis de myor número de enzims involurds en l degrdión de estos rohidrtos (vn der Meulen et l y vn den Broek et l. 2008). Sin emrgo, l preseni de monosáridos y disáridos en el extrto seo tmién pudier ontriuir l estimulión del reimiento terino (Grí 2010). Los resultdos nteriores oiniden on ls investigiones de Wng y Gison (1993) y Vn der Meulen et l. (2004), l otener inrementos del reimiento de ifidoteris en preseni de mezls de oligofrutnos, on respeto inulins y monosários de gluos y frutos. Tmién son similres los estudios de Urís-Silvs y López (2004), quienes utilizron diferentes extrtos de plnts de l fmili Agvee. Estos utores otuvieron myores reimientos de Bifidoterium reve, Ltoillus sei y Ltoillus prsei on extrtos que ontenín oligofrutnos proedentes de Dsylirium. Sin emrgo, on los que inluín frutnos de lto grdo de polimerizión, extrídos de Agve tequiln, Creimiento miroino (DO) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 Rftilose Rftiline Henequén 0,2 0 LA LC LPC Miroorgnismos,, Columns on letrs diferentes difieren pr P < 0.05 (Dunn 1955) Ltoillus idophilus (LA) P < 0.001, EE ± 0,02; Ltoillus sei (LC) P < 0.001, EE ± y Ltoillus prsei (LPC) P < 0.001, EE ± 0.01 Figur 1. Cpidd de reimiento de Ltoillus spp. ls 24 h en medio MRS on Rftilose P95, Rftiline HP y extrto seo de A. fourroydes omo fuente energéti.

3 Revist Cun de Cieni Agríol, Tomo 46, Número 2, Creimiento miroino (DO) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Rftilose Rftiline Henequén 0 BA BBF BBR Miroorgnismos,, Columns on letrs diferentes difieren pr P < 0.05 (Dunn 1955) Bifidoterium dolesentes (BA) P < 0.001, EE ± 0.01; Bifidoterium ifidum (BBF) P < 0.001, EE± 0.01 y Bifidoterium reve (BBR) P < 0.001, EE ± 0.02 Figur 2. Cpidd de reimiento de Bifidoterium spp. ls 24 h en medio MRS on Rftilose P95, Rftiline HP y el extrto seo de A. fourroydes omo fuente energéti. el reimiento fue menor. En el metolismo de los frutnos intervienen enzims induiles intr y extrelulres (Lmertus et l. 2008). Ventur y Turroni (2008) refieren que los géneros de ltoilos y ifidoteris produen myor número de enzims intrelulres y demás, presentn vrios sistems de trnsporte que filitn l entrd de los oligos l interior de l élul. Por ests rzones, es más rápid l degrdión de los oligosáridos, y que l utilizión de polisáridos inluye l hidrólisis enzimáti extern oligosáridos. Estos penetrn l interior de l élul y posteriormente son metolizdos, lo que retrd l fermentión de los mismos. En l tl 1 se presentn los resultdos orrespondientes l omportmiento del ph del medio ls 24 h, on ls eps de Ltoillus spp. y Bifidoterium spp., respetivmente. En todos los sos, los ultivos on extrto seo de A. fourroydes mostrron ph más jos, on respeto Rftilose P95 y Rftiline HP (P < 0,01). Ryroft et l. (2001) plnten que vlores de ph jos indin myor tividd metóli idogéni de ls eps en el medio de ultivo. Ls vriiones en los vlores de ph del medio ls 24 h en todos los trtmientos se relionn on ls onentriones de áidos orgánios. Vrios utores enontrron orrespondeni entre estos indidores undo se emplen preiótios, pues estos ompuestos onstituyen l fuente energéti de teris áido látis, que en sus proesos fermenttivos produen, priniplmente, áidos que disminuyen el ph (Kneifel et l y vn der Meulen et l. 2006). El áido látio fue el prinipl produto de l fermentión pr Ltoillus idophilus (figur 3) y el responsle de ls diferenis que se enontrron Tl 1. Efeto de l fuente energéti en los vlores de ph del medio ls 24 h en los ultivos de Ltoillus spp. y Bifidoterium spp.. Miroorgnismos MRS-Rftilose P95 MRS-Rftiline HP Medios de ultivo MRS- A. fourroydes EE ± L. idophilus *** L. sei *** L. prsei *** B. dolesentes *** B. ifidum *** B. reve ***,, Medis on letrs diferentes en l mism olumn difieren P < 0.05 (Dunn 1955). ***P <

4 206 entre los medios pr est ep, superior en el extrto seo de Agve fourroydes (P < 0,01), mientrs que pr los restntes miroorgnismos ls diferenis estuvieron determinds por ls produiones de áido látio y Revist Cun de Cieni Agríol, Tomo 46, Número 2, étio (P < 0. 05) (figurs 3 y 4). Ls diferenis en ls onentriones de áidos orgánios entre ls eps se pudo deer l tipo de fermentión, pues L. idophilus es homofermenttivo, () Conentrión (mmol L -1 ),, Columns on letrs diferentes difieren pr P < 0.05 (Dunn 1955) Áido látio P < 0.01 EE ± 1.45 ) Conentrión (mmol L -1 ) Rftilose Rftiline A four látio étio propiónio utírio,, Columns on letrs diferentes difieren pr P < 0.05 (Dunn 1955) Áido látio P < 0.05 EE ± 0.52; áido étio P < 0.05 EE ± 0.40 () Conentrión (mmol L -1 ),, Columns on letrs diferentes difieren pr P < 0.05 (Dunn 1955) Áido látio P < 0.05 EE ± 0.75; áido étio P < 0.05 EE ± 0.35 Figur 3. Produión de áidos orgánios por Ltoillus idophilus (), Ltoillus sei () y Ltoillus prsei () en medio MRS on Rftilose P95, Rftiline HP y el extrto seo de Agve fourroydes

5 Revist Cun de Cieni Agríol, Tomo 46, Número 2, () Conentrión (mmol.l -1 ),, Columns on letrs diferentes difieren pr P < (Dunn 1955) Áido látio P < 0.05 EE ± 0.50; áido étio P < EE ± 0.24 ) Conentrión (mmol.l -1 ),, Columns on letrs diferentes difieren pr P < 0.05 (Dunn 1955) Áido látio P < 0.05, EE ± 0.67; áido étio P < 0.05, EE ± 0.35 () Conentrión (mmol.l -1 ),, Columns on letrs diferentes difieren pr P < 0.05 (Dunn 1955) Áido látio P < 0.05 EE ± 0.22; áido étio P < 0.05 EE ± 0.18 Figur 4. Produión de áidos orgánios por Bifidoterium dolesentes (), Bifidoterium ifidum () y Bifidoterium reve () en medio MRS on Rftilose P95, Rftiline HP y el extrto seo de Agve fourroydes.

6 208 mientrs que el resto de ls teris que se evluron son heterofermenttivs (Kndler y Weiss 1986). Los ptrones de fermentión de los rohidrtos son espeífios pr d miroorgnismo (Poolmn 1993 y Sghir et l. 1998). Ls myores produiones de áidos en el medio on el extrto seo de A. fourroydes pudiern soirse ls diferenis químis y estruturles que existen entre ls fuentes de frutnos utilizds. Esto propiió que el extrto, l presentr un mezl de estruturs, se utilizr mejor omo fuente energéti, pues logró myor reimiento miroino y tividd fermenttiv. Mrx et l. (2000) enontrron inrementos en áido látio y étio, l fermentr oligofrutnos por diferentes espeies de ifidoteris. Sin emrgo, vn der Mulen et l. (2004), l evlur l ep de Bifidoterium nimlus DN , solo onsttron inrementos de áido étio en el medio on oligofrutnos, y no hllron reimiento en preseni de inulin, on lto grdo de polimerizión. Kneifel et l. (2000) y Crittenden et l. (2002) demostrron que existen diferenis en los ptrones de fermentión de preiótios que dependen, fundmentlmente, de l estrutur y omposiión de los rohidrtos, sí omo de l espeie miroin utilizd en el estudio. Según Lyons (1997), ls onentriones de áidos orgánios pudiern fvoreer los proesos de digestión y sorión de nutrientes, sí omo l leuiosis del eosistem miroino intestinl (Lyons1997). Es determinnte que ls fuentes que se seleionen omo preiótios provoquen en ls teris enefiioss lt pidd de produión de áidos orgánios, pues se reduirí el ph intestinl. Esto, unido otros ftores, osion l inhiiión del desrrollo de enteroptógenos omo Slmonell ssp. (Adms 2000 y Chveerh et l. 2002). El empleo del extrto seo de A. fourroydes estimul el reimiento y l fermentión miroin de ltoilos y ifidoteris, por lo que es un uen ndidto preiótio pr utilizrse en l limentión niml. Además, se podrín generr trjos futuros en l otenión de nuevos limentos funionles, omo los simiótios, donde se potenirín sus efetos. Agrdeimientos Se grdee l Centro de Investigiones y Estudios de Avnzds del IPN, Cmpus Gunjuto, por ofreer sus instliones pr desrrollr los experimentos Referenis Adms, C Asisteni on Resisteni. Aviultur y áidos en l diet. Rev. de Alimentos Blnedos pr Animles. mrzo-ril. p. 14 Al-Tmimi, M., Plfrmn, R., Cooper, J.M., Gison, G. & Rstll, R In vitro fermenttion of sugr eet rinn nd rinooligoshrides y the humn gut miroflor. J. Appl. Miroiol. 100: 407 Belzrini, M.G., Csnoves, F., Di Rienzo, J., González, L. & Revist Cun de Cieni Agríol, Tomo 46, Número 2, Roledo, C INFOSTAT, Versión 1.0. Universidd Nionl de Córdo. Argentin Crro, M.D. & Rnill, M.J Aditivos ntiiótios promotores de reimiento de los nimles: Situión tul y posiles lterntivs. Exopol. Cirulr 90, 7 pp. Chveerh, P., Keuzenkmp, D., Lipmn, L. & vn Knpen, F Effet of orgni ids in drinking wter for young roilers on Cmpyloter infetion, voltile ftty id prodution, gut miroflor nd histologil ell hnges. Poult. 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