Uso del anti-hbc en el Banco de Sangre
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- José Luis González Luna
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1 Infecciones Virales Transmisibles por Vía Transfusional: Hitos, Paradigmas, Aprendizajes Uso del anti-hbc en el Banco de Sangre 14 DE NOVIEMBRE 2013 JORGE REY HOSPITAL DE CLÍNICAS UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
2 AGENDA Introducción Metodología Uso en América OBI Uso en el Banco de Sangre Conclusiones
3 AGENDA Introducción Metodología Uso en América OBI Uso en el Banco de Sangre Conclusiones
4 Anti-HBc Primer anticuerpo en aparecer en una infección por HBV Anticuerpo de mayor persistencia en el organismo(mayor que Anti-HBs y Anti-HBe) Anticuerpo no protectivo Marcador epidemiológico de contacto con el HBV
5 Anti-HBc Puede detectar una viremia persistente que no esdetectableporhbsagohbvdna. Anti-HBc puede detectar infecciones con mutantes de escape o genotipos que no son detectados por algunos kits de HBsAg o HBV DNA Screening con anti-hbc puede prevenir infecciones con HBV trasmitidas por transfusión Anti-HBc tienen impacto regulatorio: es obligatorio en algunos países.
6 Hepatitis B Aguda: PerfilSerológico Fase Aguda 2-12 semanas Infección Aguda Reciente (2-6) semanas Recuperación Años Concentración Relativa Incubación 4-12 semanas Síntomas HBsAg Ventana Anti-HBc IgM Anti-HBc total Anti-HBs Anti-HBe Tiempo HBeAg
7 INFECCIÓN AGUDA Síntomas NAT NAT Título Semanas después exposición Tiempo
8 Progresióna InfecciónCrónicaporHBV Concentración relativa Aguda (6meses) HBeAg HBV DNA HBsAg IgM Anti-HBc Crónica (Años) Total Anti-HBc Anti-HBe Límite de Detección Años Semanas después de exposición
9 INFECCIÓN CRÓNICA CON HBV Límite de detección de HBsAg días años Adaptado de JP Allain
10 Significado de un individuo Anti-HBc Positivo Infección HBV Aguda (Anti-HBc IgM Positivo) Crónica (Anti-HBc IgM Negativo) Falso Positivos Biológico asociado a otras infecciones HIV HCV Biológico no asociado a otras infecciones Fármacos Desconocido Metodológico Asignación del valor de corte Antígenos recombinantes vs. no recombinante Metodología: ELISA sandwich, competitivo, indirecto
11 AGENDA Introducción Metodología Uso en América OBI Uso en el Banco de Sangre Conclusiones
12 Anti-HBcno tiene método confirmatorio Neutralización con HBcAg Presencia de otros marcadores de HBV HBsAg, Anti-HBs, HBeAg, Anti-HBe, PCR Respuesta a una dosis Buster de vacuna Doble metodología Seguimiento serológico (seroconversión)
13 WHO Anti-HBcCollaborative Study Summary of test kits characteristics Assay Code Product name Manufacturer. Assay procedure Test format Antigen Conjugate Ig-class Measuring Pretreatment 1. ADVIA Centaur HBcT Siemens Med. Solutions 1) Centaur Sandwich rhbcag rhbcag IgG/IgM ECL No 2. Architect Anti-HBc Abbott GmbH Co. KG Architect Indirect rhbcag Anti-human IgG/IgM CMIA No IgG/IgM 3. AxSYM Core 2.0 Abbott GmbH Co. KG AxSYM Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM MEIA DTT 4. Bioelisa anti-hbc Biokit S.A. Manually Competitive rhbcag PAb rhbcag IgG/IgM ELISA No 5. Corzyme Abbott Diagnostics Manually Competitive rhbcag PAb rhbcag IgG/IgM ELISA No 6. Elecsys Anti-HBc Roche Diagnostics GmbH Elecsys Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM ECL DTT 7. Enzygnost Anti-HBc Siemens Med. Solutions 2) BEPII/III Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM ELISA No monoclonal BEP Genedia Anti-HBc ELISA Plus Green Cross Corp. Manually Competitive rhbcag Human anti-hbc IgG/IgM ELISA No 9. Hepanostika anti-hbc Uniform biomérieux SA Manually Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM ELISA No 10. Immulite 2000 anti-hbc Siemens Med. Solutions 3) Immulite Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM CLEIA No 11. Immuncomb II HBc IgG Orgenics Ltd. Rapid Indirect rhbcag Anti-human IgG IgG EIA No 12. IMx Core Abbott GmbH Co. KG IMx Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM MEIA DTT 13. Anti-HBc EIA Shanghai Kehua Co. Ltd. Manually Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM EIA No 14. Lumipuls Presto HBc Ab-N Fujirebio Diagnostics Inc. Lumipuls Presto Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM CLEIA No 15. Monolisa anti-hbc Plus Bio-Rad Laboratories Manually Indirect rhbcag MAb anti-human IgG/IgM ELISA No IgG+IgM 16. Murex anti-hbc Abbott/Murex Biotech Ltd. Manually Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM ELISA No 17. Ortho anti-hbc Ortho Clinical Diagnostics Manually Indirect rhbcag MAb anti-human IgG/IgM ELISA No IgG+IgM 18. PRISM HBCore Abbott GmbH Co. KG PRISM Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM ChLIA Cysteine 19. ST AIA-Pack HBcAb Tosoh Bioscience Tosoh Competitive rhbcag MAb rhbcag IgG/IgM EIA No 20. Architect Anti-HBc II (ex- US)/Core (US) 4) Abbott Diagnostics Architect Indirect rhbcag Mab anti-human IgG/IgM IgG/IgM CMIA Reductant 13
14 ENSAYOS INDIRECTOS
15 Anti-HBcen el Laboratorio: Metodología RIA vs. ELISA: ELISA presenta mayor cantidad de positivos que RIA (66-75% de los ELISAs+ son RIA+) HBcAg recombinante vs viral? Menor correlación en ELISAs positivos cercanos al Cut-off 0.8% de los ELISA+/RIA- positivizaron el RIA 30% de los ELISA+/RIA- negativizaron el ELISA La gran mayoría de los donantes ELISA+/RIA+ presentan HBsAg, Anti-HBs y/o Anti-HBe La gran mayoría de los donantes ELISA+/RIA+ poseen un valor de positividad muy grande Caspari y Cols. JCM 1989; 27: Hanson y Cols. Transfusion 1987; 27: Schmidt y Cols. Transfusion 1988; 28:
16 Resultados Falso Reactivos Elsa Tynell, Rut Norda, Bengt Ekermo et al; TRANSFUSION 2007;47:80-89.
17 Anti-HBc aislado: Características Anti-HBc+ con valores bajos (MEIA 0.45): Aparición: % Pobre asociación con memoria inmune Respuesta a dosis buster de vacuna <10% Pobre asociación con factores de riesgo Mayor probabilidad de ser falsos positivos Anti-HBc+ con valores altos (MEIA<0.45): Aparición: 40-75% Están asociados con memoria inmune Respuesta a dosis buster de vacuna >53% Asociados a factores de riesgo Mayor probabilidad de ser verdaderos positivos
18 Correlaciónentre los nivelesde anti HBcy anti HBs en donantes e infección HBV en receptores J.W. MOSLEYC,.E. STEVENSR,. D. AACH et al. TRANSFUSION 1995;35:512.
19 Algoritmo de las pruebas usadas para confirmación de los resultadosde anti HBc JUHL ET AL. TRANSFUSION 2011;51:
20 Algoritmo de reingreso. (cont) JUHL ET AL. TRANSFUSION 2011;51:
21 Algoritmo de reingreso. (cont) JUHL ET AL. TRANSFUSION 2011;51:
22 Resultadosde algoritmoconfirmatorio de anti HBc JUHL ET AL. TRANSFUSION 2011;51:
23 Resultadosde algoritmoconfirmatorio de anti HBc JUHL ET AL. TRANSFUSION 2011;51:
24 (A) S/CO values, measured by CMIA (Abbott ARCHITECT), of the different groups. All samples were measured in triplicate. Results are given as median and 25% to 75% quartiles of the S/CO ratio. (B) S/CO values, measured by MEIA (Abbott AxSYM), of the different groups. Results are given as medianand25%to75%quartilesofthes/coratio. JUHL ET AL. TRANSFUSION 2011;51:
25 AGENDA Introducción Metodología Uso en América OBI Uso en el Banco de Sangre Conclusiones
26 Prevalencia de Anti-HBcen donantes de Sangre Argentina: 2.5% (1.2% a >9%) México: 2,0% (1,0-4,8%) Paraguay: 3.35% Brasil: 3.49 a >57% Perú: 5% Chile: 4.5% España: 4 a 12% Alemania: 1 a 10% EEUU: 0.55 a 6.38% Grecia: 15.8 a 20.0%
27 Datos 13ª Reunión de Unidades Centinela Prevalencia regional de Anti-HBcy HBsAgen donantes de Sangre Región % Anti-HBc + % HBsAg + Jujuy Litoral Buenos Aires NOA Misiones Neuquén Cuyo Centro NEA Patagonia Pampeana TOTAL
28 Anti HBc en comunidades aborígenes León P et al; RevPanamSalud Públicavol.5n.3WashingtonMar.1999
29 PREVALENCIA DE ANTI-HBcHC-UBA ANTI-HBc+ PROMEDIO: 1,34%
30 Anti HBc obligatoriedad en Banco de Sangre
31 AGENDA Introducción Metodología Uso en América OBI Uso en el Banco de Sangre Conclusiones
32 VIREMIA E HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN FASE AGUDA: a) BAJA CONCENTRACIÓN INICIAL. LENTA REPLICACIÓN. HBsAg NEGATIVO b) PICO DE DNA A LOS 127±47 DÍAS, PUEDE ALCANZAR NIVELES DEL ORDEN DE cp/ml COINCIDENTE CON HBsAg+. FASE DE INMUNOTOLERANCIA: HBV DNA FASE DE INMUNO ELIMINACIÓN: HBV DNA Y FLUCTUANTE FASE DE LATENCIA CLÍNICA: HBV DNA O NO DETECTABLE FASE DE REACTIVACIÓN: HBV DNA Pawlotzky JM. J Hepatol, 2003;39:
33 ETAPAS HBsAgNEGATIVAS CON HBV DNA POSITIVO PERÍODODEVENTANASEROLÓGICA VENTANADELANTI-HBc MUTANTESDELHBsAg OBI(InfecciónOcultaporHBV)
34 DEFINICIÓN DE OBI PRESENCIA DE HBV DNA, EN SUERO O EN TEJIDOS, CONAUSENCIADEHBsAgENSANGRE: CON O SIN ANTI-HBs CON O SIN ANTI-HBc FUERA DEL PERÍODO DE VENTANA SEROLÓGICA Allain JP. Vox Sanguinis,2004; 86:83-91
35 DIFERENTES FORMAS CLÍNICAS DE OBI Recuperación de una infección definida por la presencia de anti-hbs. Hepatitis Crónica, relacionada a la presencia de mutantes del HBsAgno reconocido por el ensayo en uso. Hepatitis crónica, en estadíode portación sana asociada a la presencia de anti-hbccon o sin anti-hbe Hepatitis crónica o portador sano, sin ningún otro marcador del HBV salvo el DNA HBV Allain JP. Vox Sanguinis,2004; 86:83-91
36 QUÉ MUESTRAS SON REALMENTE OBI? Depende de la eficacia de los métodos utilizados en los diferentes marcadores MARCADORES SEROLÓGICOS: SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD: Expresión de resultados en UI o en muestra/cut off(hollinger FB; Transfusion 2008;48: Test de neutralización para HBsAg: 4.1% (2935) fueron sólo HBsAg positivas,57% m/co cerca de 1 (Kleinman S;Transfusion 1998;38(suppl):925 Especificidad anti-hbc(cheng Y; J Immunol Methods 1999;230:29-35)
37 0,7 0,6 HBsAg estimado(ng/ml) en el Cutoff de diferentes Tests de HBsAg Rango ng/ml CBER Lot Release Panel 0,63 HBsAg (ng/ml) 0,5 0,4 0,3 0,27 0,46 0,2 0,1 0,09 0,10 0,15 0,18 0 ( ) Unlicensed tests (B) (A) D (E) C F G HBsAg Tests Biswas et al. FDA/REDS HBV Study
38 CargaViral Estimadaen el Cutoff de los Tests para HBsAg según Standard WHO HBV DNA Range 88-1,114 IU/mL (350-4,500 copies/ml) IU/mL ( ) Unlicensed tests HBsAg Tests Biswas et al. FDA/REDS HBV Study
39 Comparativa de Metodologías Pruebas nuevas Reduccción PV (días) Rendimiento 10 7 donaciones para HBsAg MP NAT ID NAT Biswas et al. FDA/REDS HBV Study
40 REACTIVIDAD PARA HBsAg Y CARGA VIRAL DE HBV HBV DNA HBsAg (CLIA) A HBsAg (EIA) B Copies / ml C No. Neg (%) Reactive Neg (%) Reactive (%) (%) < (93) 1 (7) 14 (100) 0 (0) (86) 4 (14.4) 25 (89) 3 (11) D (56) 26 (44) 47 (80) 12 (20) > (7.5) 74 (92.5) 10 (12.5) 70 (87.5) Total (42) 105 (58) 96 (53) 85 (47) Minegishi K, et al. Vox Sang 84:287-91, 2003
41 HBsAg /HBV DNA+ EVIDENCIA DE INFECCIÓN CON HBV RESUELTA: 18% (14/80) HBV DNA + 86% (12/14) VARIANTES DE S SIN EVIDENCIA SEROLÓGICA : 8,1% (33/407) HBV DNA + 52 %(17/33) VARIANTES DE S QV: < 10 5 copias/ml MINUK GY, SUN DF, UHANOVA J.J Hepatol,2005;42(4):480-5
42 HEPATITIS B VIRUS DNA IN BLOOD DONORS WITH ANTI-HBcAS POSSIBLE INDICATOR OF ACTIVE HEPATITIS B VIRUS INFECTION IN YUCATAN, MEXICO García Montalvo BM, Farfan Ale JA, Acosta Viana KY, Puerto Manzano FI Transfusion Medicine, 2005; 15: TOTAL DONANTES ESTUDIADOS: PREVALENCIA TOTAL DE ANTI-HBc: 4,42% n Marcadores % en DS % en anti-hbc + 22 HBsAg+ a-hbc+ a-hbs- 0,19 4, HBsAg- a-hbc+ a-hbs- 1,93 43, HBsAg- a-hbc* a-hbs+ 2,28 51,71
43 HEPATITIS B VIRUS DNA IN BLOOD DONORS WITH ANTI-HBcAS POSSIBLE INDICATOR OF ACTIVE HEPATITIS B VIRUS INFECTION IN YUCATAN, MEXICO García Montalvo BM, Farfan Ale JA, Acosta Viana KY, Puerto Manzano FI Transfusion Medicine, 2005; 15: TOTAL DONANTES ESTUDIADOS: PREVALENCIA TOTAL DE ANTI-HBc: 4,42% n Marcadores % en DS % en anti-hbc + 22 HBsAg+ a-hbc+ a-hbs- 0,19 4, HBsAg- a-hbc+ a-hbs- 1,93 43, HBsAg- a-hbc* a-hbs+ 2,28 51,71 13/158 : HBV DNA + (8,23%)
44 AGENDA Introducción Metodología Uso en América OBI Uso en el Banco de Sangre Conclusiones
45 Anti-HBcen Banco de Sangre Marcador de infección HBV con HBsAg no detectable Ventana del Core Marcador Subrogante Hepatitis NoA-NoB HCV HIV
46 Presencia de otros marcadores de infección por HBV en individuos Anti-HBc+ Marcador % de aparición HBsAg 2-20% Anti-HBs 15-80% Anti-HBe 11-33% Ninguno (Anti-HBc aislado) 5-68%
47 Presencia de otros marcadores en individuos Anti-HBc+/HBsAg- Marcador % de aparición HBV-DNA 0-90% Anti-HCV 1-38% Anti-HIV 1-15%
48 Otros marcadores asociados a HBV-NAT+/HBsAg-/Anti-HBc+ Anti-HBs aislado: 1.6% Anti-HBe aislado: % Anti-HBc aislado: 0-38% 395 Donantes Anti-HBc+/HBsAg- 6 (1.5%) fueron DNA+ 4 (67%) fueron Anti-HBc aislado 2 (33%) no presentaron marcadores positivos
49 Presencia de otros marcadores en individuos Anti-HBc+ aislado Marcador % de aparición HBV-DNA 0-25% Respuesta a 1 dosis Buster de vacuna Historia de factores de riesgo 16%-49% 0.02%
50 Correlaciónentre los nivelesde anti HBcy anti HBs en donantes e infección HBV en receptores J.W. MOSLEYC,.E. STEVENSR,. D. AACH et al. TRANSFUSION 1995;35:512.
51 Porcentajeestimadode exclusiónde donantesusando3 sets de valoresde anti HBcy anti HBs asociadosa menudo con transmisión transfusional de HBV J.W. MOSLEYC,.E. STEVENSR,. D. AACH et al. TRANSFUSION 1995;35:512.
52 PREVALENCIA DE OBI EN DONANTES DE SANGRE BST-Cataluña ID-NAT 668, / 10,500 CMN LA RAZA MÉXICO / SRCTC-Madrid ID-NAT 128, / 14,246
53 Perfil de los donantes en periodo ventana VHB (Pre-& Post-) BST-Cataluña (Enero 2007-Diciembre 2009) Caso Sexo Edad DNA IU/mL tipo donante prewp-1 varón 33 a. 100 regular prewp-2 varón 59 a regular postwp- 3 varón 30 a. <50 1ª vez postwp-4 varón 29 a. <50 1ª vez postwp-5 varón 39 a. 60 regular postwp-6 varón 30 a. <50 1ª vez prewp-7 varón 36 a. <50 1ª vez postwp-8 varón 39 a. 10,000 regular prewp-9 varón 44 a. 10,000 regular postwp-10 varón 41 a. 100 regular prewp-11 mujer 52 a. 100 regular postwp-12 varón 30 a. <60 regular prewp-13 varón 35 a regular Sílvia Sauleda. Laboratorio de Seguridad Transfusional, Banc de Sang i Teixits. Cataluña, España.
54 INFECCIÓN OCULTA POR VIRUS DE LA HEPATITIS B (HBV) EN HEMODONANTES :DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN GENÓMICA PARCIAL Trinks J; Gambino G;Toledano A et al
55 110 muestras Ac anticore Pos 3 Muestras Ultrio Pos DISCIMINATORIO HBV Pos DISCRIMINATORIO HBV Pos DISCRIMINATORIO HBV Neg
56 GEN S (Lindh) Neg GEN S (Zeng) Neg PRE-C/C Pos GENOMA COMPLETO Pos CV < 50 UI/ml GEN S (Lindh) Neg GEN S (Zeng) Neg PRE-C/C Pos GENOMA COMPLETO Pos CV < 50 UI/ml GEN S (Lindh) Neg GEN S (Zeng) Neg PRE-C/C Neg GENOMA COMPLETO Neg SECUENCIACIÓN PRE- C/C GENOTIPO E HBV
57 ARGENTINA GENOTIPO F DIFIERE SEGÚN LOCALIZACION GEOGRÁFICA REGIÓN METROPOLITANA GENOTIPO D REGIÓN NORTE GENOTIPO F GUALEGUAY GENOTIPO A MBAYED Y COLS PIÑEIRO Y LEONE Y COLS
58 GENOTIPOS HBV EN HEMODONATES GENOTIPO F 64% GENOTIPO D 17,3% GENOTIPO A 17,3% GENOTIPO C 1,3% FRANCA Y COLS 2004
59 HEMODONANTE CON INFECCION POR HBV OCULTA GENOTIPO E MAYOR CIRCULACION EN ÁFRICA ANTECEDENTE DOS HERMANAS CON LINAJE MITOCONDRIAL AFRICANO MATHET Y COLS. ALTA IMPLICANCIA POR SU EXCEPCIONAL CIRCULACIÓN ALTA RELACIÓN CON EVENTOS DE IRRUPCIÓN VIRAL (BREAKTHROUGH) MAIMUNA Y COLS
60 CONCLUSIONES Documentación de la infección oculta por HBV en donantes de sangre Prevalencia de DNA HBV positivo en hemodonantes con niveles detectables de Acsanti HBcy niveles indetectables de HBsAg encontrada fue de 1,82% La carga viral de HBV en ambos pacientes fue menor de 50 UI/ml
61 CONCLUSIONES Genotipo E mayor divergencia en el determinante a con respecto al Genotipo A, lo que implica posibilidad de NO detección por algunos ensayos serológicos. La tecnología NAT permite la detección de portadores del HBV con una mayor sensibilidad El uso de anti HBc permitió detectar individuos HBsAg neg, HBV DNA pos, aumentando por lo tanto la seguridad transfusional.
62 Algoritmo de la FDA para los donantes Anti-HBc aislado Frente a una extracción repetidamente reactiva: Se descarta la unidad de sangre y se espera a su próxima donación (8 semanas) Anti-HBcrepetidamente reactivo en la siguiente donación (8 semanas): Se descarta la unidad, el donante es rechazado indefinidamente y se guarda una alícuota para estudiar futuras metodologías y actitudes a tomar.
63 AGENDA Introducción Metodología Uso en América OBI Uso en el Banco de Sangre Conclusiones
64 Utilidad de Anti-HBcen Banco de Sangre No es útil Se descartan anualmente unidades. (Kline y Cols Transfusion 1987; 27(1): ) Solo se transmitió hepatitis postransfusionalen 1/2877 donaciones Anti-HBc positivas. (Hanson y Cols Transfusion 1987; 27(1): 107-8). El 98% (la gran mayoría) de los Anti-HBcpositivos débiles son falsos positivos y no responden a la dosis Busterde vacuna. (Aokiy ColsTransfusion1993; 33(5): Schiffmany Cols. Arch. Intern. Med. 1993; 153(19): ). Ninguno de los donantes Anti-HBc aisado presentó NAT+. (Zervou y Cols. Transfusion 2001; 41(5): Tseliou. Haematologia(Budap). 2000; 30(3): ). Más del 80% de los Anti-HBcaislado no presentaron contacto previo al HBV. La mayoría negativizaronla prueba durante el seguimiento. (Hardler y Cols. JCM 1984; 19(4): 521-5).
65 Utilidad de Anti-HBcen Banco de Sangre Es útil El 99% de los Anti-HBcaislado fueron neutralizados por HBcAg. (Lee y Cols. Transfusion 1987; 27(1): 103-6). Descripción de casos de transmisión de hepatitis postransfusionalen donantes Anti-HBcaislado. (Groby Cols. J Med Virol 2000; 62(4): 450-5). Anti-HBcaislado fuertemente reactivos están asociados a factores de riesgo. (Molijny Cols. Vox Sang1997; 72(4): ). Viremia detectable (NAT) en donantes Anti-HBc aislado: 0.96% Alemania (Roth y Cols. Transfusion 2002; 42 (7): ). 1% EEUU (Kleinman y Cols. Transfusion 2003; 43(6): ). 1.25% Arabia Saudita (Zekri y Cols. Dis. Markers 2002; 18(3): ). 25% India (Chandhurri y Cols. Transfusion 2003; 43(10): ). 38% Japón (Yotsuyanagi y Cols(Transfusion 2001; 41(): ).
66 Anti-HBcaislado Conclusiones: Especificidad No existe aún método confirmatorio alguno. Un porcentaje considerable son falsos-positivos (fundamentalmente los positivos débiles). Discordancia de resultados según las diferentes metodologías y kits de un mismo método. El aumento de la especificidad afecta a la sensibilidad enmayoromenorgrado. Al igual que con ALT, se incrementa el número de unidades descartadas.
67 Anti-HBcaislado Conclusiones: Sensibilidad Casos documentados de viremiadetectable en individuos Anti-HBc positivos En ausencia y presencia de Anti-HBsy Anti-HBe En Anti-HBc positivos fuertes y débiles La prevalencia de viremia en individuos Anti-HBc aislado es proporcional a la endemicidadde la región La prevalencia de viremia en individuos Anti-HBc aislado es proporcional a la sensibilidad del NAT empleado
68 BLOOD TRANSFUSION IS LIKE MARRIAGE: IT SHOULD NOT BE ENTERED UPON LIGHTLY, UNADVISEDLY OR WANT ONLY OR MORE OFTEN THAN IS ABSOLUTLY NECESSARY BEAL: Aust NZ J Surg 1776 " LA TRANSFUSIÓN DE SANGRE SE PARECE AL MATRIMONIO: NO DEBERÍA TOMARSE A LA LIGERA, IMPRUDENTE O GRATUITAMENTE O MÁS A MENUDO QUE LO ABSOLUTAMENTE NECESARIO "
69 Muchas gracias!!!!!
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