MANUAL DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS

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1 MANUAL DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS PROGRAMA DE TRANSFERENCIA DE TECNOLOGIA EN APLICACIÓN DE TECNICAS ASISTIDAS PARA OVINOS EN EL TROPICO MC. JOSE BERNARDO SANCHEZ MUÑOZ DR. OCTAVIO MEJIA VILLANUEVA DR ALBERTO MANZUR CRUZ Noviembre de 2014

2 FUNDACIÓN PRODUCE CHIAPAS A.C. Consejo directivo Mvz. David Corzo Castillejos Presidente Ejecutivo Ing. Guillermo De Jesús Moguel Gómez Secretario C.P. María Araceli Ramírez Martínez Tesorera Ing. Filiberto Gómez Martínez Gerente General ASOCIACIÓN GANADERA DE OVINOCULTORES DE CHIAPAS SPR DE RL DE C.V Ing. Francisco Cano Gutiérrez Presidente Ing. Francisco Genovés Balbuena Secretario UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS Mtro.. Jaime Valls Esponda Rector Mtro. Hugo Armando Aguilar Aguilar Secretario General Mtro. Luis Iván Camacho Morales Secretario Académico Mtro. Miguel Ángel Cigarroa Torres Secretario Administrativo Dr. Lorenzo Franco Escamirosa Montalvo Director General e Investigación Y Posgrado Lic. Victor Fabián Rumaya Farrera Director General de Extensión Universitaria MC. Alfredo Castellanos Coutiño Director de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

3 CONTENIDO I. INTRODUCCIÓN... 1 II. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES Ventajas de la transferencia de embriones Selección de Donadoras y Receptoras Inducción-sincronización del celo mediante tratamientos hormonales Superovulación Factores que afectan la respuesta superovulatoria Detección de celo Servicio en hembras donadoras Inseminación pericervical Inseminación artificial intrauterina por laparoscopía Colecta de embriones Técnica quirúrgica Técnica no quirúrgica Evaluación y clasificación de embriones Transferencia de embriones Congelación de embriones Aspectos básicos CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA

4 I. INTRODUCCIÓN La transferencia de embriones (TE) es un método de reproducción artificial que consiste en la obtención de varios embriones producidos por una hembra donadora sobresaliente, y que serán posteriormente transferidos a hembras receptoras. El objetivo fundamental de esta técnica es tener la oportunidad de multiplicar su potencial reproductivo, utilizando como receptoras los vientres de la misma especie pero de escaso valor genético. Los primeros transplantes de embriones en ovinos se realizaron hace 50 años. A partir de los años 60 se realizaron trabajos en Australia (Moore y Rowson, 1960) y en Nueva Zelanda (Tervit y Havick, 1976), que contribuyeron a precisar las condiciones y las posibilidades del desarrollo de la TE. Esta técnica ha sido empleada durante los últimos 10 años en Australia y Nueva Zelanda, con el objetivo de incorporar material genético. En México actualmente se emplea en programas de mejoramiento genético de razas ovinas productoras de carne y lana corta y recientemente se ha comenzado con la producción de embriones congelados de ovinos dorper. En las condiciones tradicionales de cría ovina, el número de descendientes producidos por hembra y por año es de una o dos crías, por lo tanto durante su vida reproductiva se obtienen entre 6 a 8 crías. El potencial natural reproductivo de cada especie y de cada raza, es una limitante a la rapidez de difusión del progreso genético. El objetivo de la TE es incrementar el número de crías de las hembras de alto valor genético. Esta técnica, permite lograr un mayor aprovechamiento de la gran cantidad de ovocitos que existen en el ovario de una hembra. Consiste en realizar una estimulación de los ovarios mediante tratamientos hormonales, para que se produzca una ovulación múltiple. De esta manera, los valores medios alcanzan a ser 10 veces superiores a la tasa ovulatoria promedio de la raza. 1

5 Con la TE es posible acortar el intervalo generacional, y en consecuencia incrementar el avance genético. A su vez, la inseminación artificial y la TE son excelentes herramientas para el mejoramiento genético de rebaños ovinos con imposibilidades de comprar vientres puros de alto costo. El objetivo de este manual es proporcionar a los técnicos y Productores de forma sistemática, los conceptos que deben ser considerados para establecer un programa de transferencia de embriones. 2

6 II. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES 2.1 Ventajas de la transferencia de embriones La finalidad de la aplicación de esta técnica en los animales domésticos tiene fundamentos de orden genético, comercial, sanitario y de conservación de especies. Permite lograr los siguientes objetivos: 1.- Aumentar el progreso genético en la producción, a través del incremento de la intensidad de selección de las madres destinadas a la producción de machos superiores, al disponer de un mayor número de crías por hembra. Por consiguiente se puede incrementar la ganancia genética al poder realizar una mayor presión de selección. 2.- Aumentar la eficiencia de los programas de núcleos de producción de leche, carne o lana, ya que es posible realizar una estimación del valor genético de las hembras, evaluando la producción de las hermanas, y medio hermanas. A su vez se puede evaluar información complementaria o de alguna característica de producción en particular (Ej. valores de grasa o proteína de la leche). 3.- Introducir y difundir rápidamente nuevas razas o genotipos de alto valor productivo. Se reducen los altos costos de producción que se presentan con animales de baja eficiencia productiva. Las características deseables y de alta heredabilidad pueden ser rápidamente multiplicadas. 4.- Incrementar la tasa de mellizos (gemelos idénticos). Al realizar la partición de embriones se logran individuos genéticamente iguales, siendo 3

7 entonces posible probar la adaptación de los genotipos idénticos, en situaciones ambientales o de manejo diferentes. 5.- Acortar el intervalo generacional. La posibilidad de incrementar rápidamente la descendencia de las borregas permite una reducción del intervalo generacional, con mayor beneficio cuando se emplea semen de animales jóvenes de probados 6.- Apoyar las técnicas reproductivas en las que interviene la micro manipulación de embriones (determinación del sexo, fecundación in vitro, vitrificacion, entre otros). 7.- Conservar razas o especies. La conservación de material genético (embriones congelados) permite el reaseguro en bancos de genes que de otra manera desaparecerían con la especie. 8.- Difundir material genético de alto valor comercial con facilidad de adaptación ambiental de las crías a diferentes sistemas de producción y manejo. 9.- Reducir riesgos en la transmisión de enfermedades, debido a que en los primeros estadios de su desarrollo los embriones presentan una protección natural contra los agentes infecciosos. (León et al., 2009; International Embryo Transfer Society 1987 ) 2.2 Selección de Donadoras y Receptoras El elemento fundamental en que se basa la elección de una donadora es su valor genético conforme a criterios apropiados de aptitudes zootécnicas investigadas en la raza en cuestión. En cambio, no se tiene en cuenta ninguna exigencia a este tipo en la selección de receptoras. En todo caso, donadoras y 4

8 receptoras deberán satisfacer los criterios fisiológicos y patológicos que condicionan el éxito del programa: Figura 1 selección de donadoras Todas las hembras seleccionadas como donadoras deben haber tenido un parto en la temporada reproductiva anterior y deberá haber transcurrido como mínimo de 2 a 5 meses antes de iniciar los tratamientos según la raza. La puesta en reproducción precoz con relación al parto anterior determina con frecuencia una escasa fertilidad (Ramón 2003). Los animales deberán encontrarse Clínicamente sanos y rechazarse los ani males que presenten líquidos vaginales que puedan revelar infecciones del tracto reproductor.. 5

9 La edad de la oveja es un factor a considerar, ya que se ha observado mejor respuesta en hembras de 2 partos o mas que en las primalas, esto fundamentalmente porque ya existe una madurez sexual y probada fertilidad y prolificidad. Por lo que respecta a las hembras donantes, la selección puede basarse en una excelente condición corporal lo que reflejara una mejor respuesta. Cuando se trate de hembras nulíparas, éstas deben presentar un desarrollo corporal representativo de al menos el 60% del peso vivo adulto y tener una edad mínima de 8-10 meses. Antes de la selección de donantes y receptoras serán sometidas a varios ensayos serológicos para detectar posibles enfermedades contagiosas. La selección de receptoras deberán de cubrir los mismos requisitos que las donadoras excepto el valor genético ya que de preferencia serán animales cruzados con alta resistencia y vigor hibrido, buen instinto materno y producción de leche, pues de ellas dependerá la sobrevivencia del cordero Inducción-sincronización del celo mediante tratamientos hormonales Los tratamientos hormonales en hembras donadoras y receptoras, se utilizan para la inducción del estro y la ovulación múltiple (hembras donantes), o la ovulación (hembras receptoras) y la sincronización del estro entre ambas El objetivo es disponer de un similar estado fisiológico sexual entre donadora y receptora, al momento de realizar la TE. ( Forcada 2003). Hafes y Hafes ( 2006) mencionan que el tratamiento hormonal consiste en simular ciertos acontecimientos endocrinos que controlan el ciclo sexual, a fin de inducir el celo y la ovulación en un momento determinado. 6

10 La sincronización del celo se logra induciendo la regresión del cuerpo lúteo a través del uso de prostaglandinas durante la fase lútea (7 a 11 días del ciclo en la borregas) o bien mediante la inducción de una fase lútea artificial mediante La colocación de una esponja vaginal impregnada de un análogo de la progesterona o progestágeno (FGA,MGA) o colocación de un dispositivo intravaginal (CIDR) lo que simula la fase lútea del ciclo sexual durante la cual las elevadas concentraciones de progesterona inhiben la secreción pulsátil de GNRH por parte del hipotálamo, bloqueando de este modo la ovulación hasta la luteolisis siguiente ( Galina y Valencia 2009). La administración de ecg que presenta actividad FSH y LH 48 horas antes o al retiro de la esponja vaginal, permiten estimular el crecimiento folicular. La inyección en el mismo momento de un análogo de las prostaglandinas F2a, provoca la luteólisis en las hembras que presentaban un cuerpo lúteo todavía funcional al final del tratamiento. La técnica consiste en limpiar y desinfectar la vulva, colocar la esponja con el aplicador vía vaginal la cual se coloca al fondo de la vagina quedando colgando solo en hilo para su posterior retiro 9 a 12 días después figura 2. 7

11 Figura 2. Colocación ovinos y retiro de esponjas para la sincronización del estro en Rubianes et al,. (1999) mencionan que La retirada de la esponja, provoca una caída en las concentraciones de FGA en la circulación general, provocando la desaparición de la inhibición del eje hipotálamo-hipofisario y el comienzo de los acontecimientos endocrino que inducen el celo y la ovulación. La dosis de FGA que se encuentra en una esponja vaginal es de 40 mg en multíparas en la estación reproductiva y de 45 (esponjas utilizadas en corderas) para los animales que no han parido. 8

12 Inicialmente, la duración del tratamiento progestativo era de 18 a 21 días, es decir, la duración de un ciclo sexual. Sin embargo la duración del tratamiento en la especie se redujo a una duración de 9 a 11 ± 1 días. Esta reducción del tratamiento ha permitido mejorar la fertilidad tras IA (tratamiento de 11 días: 61% vs. tratamiento de días: 57%). La sincronización del estro se logra controlando la vida media del cuerpo lúteo, induciendo su regresión mediante la aplicación de prostaglandinas F2alfa a sus análogos, durante el diestro entre el día 7 al 13 del ciclo estral.aunque en forma práctica es poco usado. Cuando el tratamiento hormonal se aplica fuera de la época de actividad reproductiva, un cierto número de animales puede presentar actividad ovulatoria. La duración del tratamiento progestativo (11 días) es inferior a la de la duración de una fase luteal (16 días), lo que hace que la salida en celo y la ovulación se retarden o incluso se bloqueen, por unos niveles de progesterona en sangre elevados debido a la presencia del cuerpo lúteo todavía funcional tras la finalización del tratamiento progestativo. En el momento de la estimulación del ovario mediante la inyección de PMSG o ecg, se debe realizar una inyección intramuscular de prostaglandina para provocar la luteolisis. Se han probado distintas dosis, y la que mejores tasas de fertilidad en el momento de la IA han obtenido ha sido una inyección de 50 m g. Debido a que en las hembras donadoras el celo se presenta anticipado respecto a las hembras receptoras, en estas últimas se deben retirar las esponjas 12 horas antes. En los ovinos, la PMSG (valores indicativos: 200 a 400 UI) se aplica al momento de retirar las esponjas, y el retiro se adelanta 12 horas con respecto a las hembras donadoras (Brackett and Zuelke 1993). 9

13 Figura 3. Esquema para la sincronización del estro en receptoras 3. Superovulación La estimulación del crecimiento folicular por medio de la inducción a la superovulación o de la ovulación (receptoras) tiene lugar normalmente al final del tratamiento progestativo y se realiza mediante inyección intramuscular de hormonas hipofisarias (FSH), y de gonadotropinas coriónicas (PMSG, ecg) (Ginther and Kot 1994) 10

14 Figura 4. Protocolo de sincronización y superovulación en donadoras y receptoras La hormona folículoestimulante (FSH) favorece el crecimiento y la maduración de los folículos y ovocitos; induce en el folículo la aparición de receptores de la hormona luteinizante (LH) y mantiene la secreción de estrógenos. La secreción de FSH es más o menos continua pero presenta dos picos: Simultáneamente al pico preovulatorio de LH. Dos o tres días más tarde (segundo pico de intensidad mucho más débil). La LH no es secretada de forma continua sino periódica, su concentración plasmática se eleva durante un corto periodo de tiempo (pulso) para después descender progresivamente hasta el nivel basal donde permanece hasta el pulso siguiente. La frecuencia de los pulsos varía según la estimulación de las células hipofisarias por la GnRH. Durante la fase preovulatoria, el aumento de la 11

15 concentración de estrógenos secretados por los folículos ejerce un retrocontrol positivo sobre el eje hipotálamo-hipofisario. Esta estimulación aumenta la frecuencia de los pulsos de LH provocando de esta manera un incremento importante de su concentración plasmática, llamada pico preovulatorio de LH. La LH junto con la FSH intervienen en la maduración final del folículo, después de lo cual el aumento masivo de su concentración produce la liberación del boicot y la transformación del folículo en cuerpo lúteo. Después de la ovulación la LH estimula el desarrollo del cuerpo lúteo y seguidamente la síntesis de progesterona. Los preparados de FSH de origen porcino u ovino, proceden de extractos hipofisarios parcialmente purificados cuya actividad FSH varía según los grupos. Además, el contenido de LH de estos preparados es igualmente variable según el origen comercial, así como según el lote de fabricación. Por otra parte, a menudo no se indica al usuario la relación FSH/LH de los preparados comerciales. Si bien sea conveniente la adición de LH al preparado inicial, la ausencia de esta información no permite una utilización óptima de los preparados (Alberio et al., 1993). Figura 5. Productos hormonales utilizados en la superovulación 12

16 Dosis utilizadas de FSH La dosis total eficaz varía ampliamente según el preparado hormonal utilizado y el genotipo de la donante, por lo que debería determinarse previamente por medio de una curva de dosis-respuesta. Las dosis totales de FSH más generalizadas en las ovejas y cabra están comprendidas entre 180 y 250 mg, Número de inyecciones Debido a la escasa duración de la FSH (3-4 horas), es necesario repartir la dosis en varias inyecciones para inducir la superovulación. De 4 a 8 inyecciones a intervalos de 12 horas cada una, se suministran generalmente durante los 4 últimos días del tratamiento progestativo. (Armstrong et al 1982). Reparto de la dosis La cantidad total de FSH administrada durante el tratamiento se suele repartir en general en dosis decrecientes, durante cuatro días dividida en ocho aplicaciones, una cada doce horas, la respuesta ovulatoria obtenida con este método es más elevada que con la inyección de dosis constantes. Con este método, el número medio de ovulaciones y de embriones transferibles son más elevadas que con un aporte constante de FSH y LH durante el tratamiento. Gonadotropina coriónica equina (ecg) La inyección intramuscular de ecg permite un mayor crecimiento folicular con lo que la tasa de ovulación es mayor, así como la duración del celo y adelanta el momento de comienzo de éste. En cuanto al momento de realización de la inyección, se ha observado que la fertilidad tras IA es más elevada cuando la inyección de ecg se realiza 48 horas antes de la retirada de la esponja, que cuando se realiza en el momento de la retirada de la esponja. En el caso de 13

17 realizarse en época de actividad reproductiva el tratamiento, la inyección de ecg se debe efectuar en el momento de la retirada de la esponja. La dosis de ecg se determina para cada borrega, teniendo en cuenta el momento de tratamiento, número de parto En la borrega primípara o multípara, la dosis más normal es de 300 a 400 U.I. de ecg.. En resumen debemos tener presente los siguientes conceptos: La ovulación múltiple debe realizarse al final de un tratamiento progestacional de sincronización de estros. La duración de la estimulación es semejante al crecimiento folicular terminal (3 días). Se recomienda el empleo de dosis decrecientes de FSH (Baldasarre, et al., 1992). 4.0 Factores que afectan la respuesta superovulatoria El factor intrínseco de cada animal juega un rol primario en la respuesta al tratamiento de ovulación múltiple. Estudios realizados en ovinos demostraron que solamente el 68% de las hembras respondió con embriones transferibles. El 32% restante incluía a las hembras sin respuesta a la estimulación ovárica, sin recuperación de embriones u ovocitos, o con recuperación de embriones no transferibles (Donaldson, 1982). Por consiguiente siempre se debe tener presente que un porcentaje de hembras no responderá al tratamiento hormonal de ovulación múltiple. La variabilidad individual a la respuesta hormonal de ovulación múltiple está condicionada por el estado fisiológico del ovario y por el número de pequeños folículos (1 a 2 mm) en el momento de comenzar el tratamiento hormonal con FSH (Brebion et al., 1992). 14

18 En la selección de las hembras donantes se debe tener presente la alta variabilidad individual en la respuesta ovulatoria múltiple. Para evitar un gasto innecesario de tiempo y dinero, es posible realizar una predeterminación de la respuesta ovulatoria. La respuesta individual de cada hembra donante está correlacionada positivamente (r= +0.7) con el número de folículos presente al momento de iniciar el tratamiento hormonal de ovulación múltiple. La raza es otro factor de variación, presentándose en las más prolíficas una mayor respuesta a la ovulación múltiple, embriones transferibles y crías nacidas (Cognie 1999). La estación sexual también influye sobre el número medio de ovulaciones por hembra ovina, siendo superior en la estación reproductiva con respecto al período de anestro. (Nellenschulte y Niemann 1992) La alimentación juega un rol muy importante en la respuesta a los tratamientos hormonales de ovulación múltiple, debido a que se ha demostrado que no solamente afecta la respuesta ovulatoria sino que es posible que se presenten luteólisis prematuras, tanto en estación como en contraestación sexual (Baril y col, 1989; Baril, G.Vallet, J.C.1990a). 4.1 Detección de celo La detección del celo tanto en donadoras como receptoras así como el momento del servicio en donadoras es determinante para la colecta de los embriones, este se apoya generalmente en el criterio de receptividad sexual de la hembra que finalmente es cubierta por el macho. En efecto es la inmovilidad de la hembra la que permite la cubrición y la deposición del semen del macho en las vías genitales de la hembra. Existen diferentes métodos para la detección del celo tanto en ovinos como en caprinos. Las condiciones de utilización de estos métodos dependen del comportamiento de los animales, del tiempo disponible y del tamaño del rebaño. Complementando a estos métodos, la observación directa y atenta de los animales por personas habituadas y que están en contacto directo con los mismo 15

19 también es muy útil. Las modificaciones del comportamiento de las hembras en el momento de celo, son a veces espectaculares. El método más comúnmente empleado es la exposición de la hembra o grupo de hembras a un macho entero normalmente se le coloca un mandil para evitar que cubra a las hembras que están en celo y deben estar habituados a llevarlo, si bien una utilización repetida puede llegar a provocar una inhibición sexual, y algún tipo de inflamación de prepucio (Figura 6). Figura 6. Detección de celo en donadoras con macho entero provisto de mandil 16

20 5.- Servicio en hembras donadoras La fecundación en las hembras donadoras puede realizarse mediante monta natural (MN), o mediante inseminación artificial (IA), con semen fresco o congelado. La MN se realiza cada 12 horas, desde el comienzo del celo y hasta su finalización. Figura 7. Monta directa de la donadora de embriones utilizando semental En el caso de emplearse la IA, ya sea con semen fresco o congelado, se recomienda el empleo de la técnica laparoscópica, debido a que la deposición del semen en los cuernos uterinos y en proximidad del sitio de fertilización, permite aumentar las tasas de fertilización, así como reducir las dosis de inseminación. La inseminación artificial de las ovejas como se menciono anteriormente, puede realizarse a través de dos técnicas: la inseminación pericervical, que es la más empleada normalmente en programas de inseminación artificial en ovinos 17

21 utilizando semen diluido fresco o refrigerado, y la inseminación intrauterina por laparoscopia, con semen fresco o congelado, utilizada para dar el servicio a hembras donadoras de embriones Inseminación pericervical Para la inseminación cervical las hembras se colocan con los miembros posteriores levantados apoyados sobre potros de servicio, pacas o barras de apoyo. La vulva de la hembra se limpia con algodón. Los genitales externos suelen estar limpios, pero de todas maneras la introducción del espectáculo será más sencilla si el animal carece de pelo o lana en la región. Si se utiliza un especulo pico de pato, se debe introducir en la vagina con las valvas cerradas y paralelo a los labios de la vulva. No se debe intentar introducir el espectáculo a la fuerza, ya que esto puede ocasionar lesiones en los tejidos. Después de insertados de 10 a 13 cm, el especulo puede rotar unos 90 (hacia arriba o hacia abajo) o abrir sus valvas. Se emplea una fuente de luz (lámpara), dirigiendo la luz hacia la vagina anterior, a través del especulo, hacia los lados. Para identificar la entrada del cérvix. La inseminación por este método puede realizarse con pipetas de inseminación de plástico o cristal con uno de los extremos estirados al calor que terminen en punta roma lo mas delgada posible. La dosis empleada es de.25 a.50 ml con una concentración entre 80 y 100 millones de espermatozoides. El inseminador intentara introducir la pipeta lo más profundo posible dentro del cérvix, pero sin utilizar la fuerza. Si la pipeta penetra el cérvix, el semen puede depositarse dentro del útero al empujar el embolo de la jeringa retirada del espectáculo permite el cierre de la vagina anterior, lo que impide el reflujo del semen. Después de depositado el semen se retiran primero la pipeta y luego el especulo. Se ha demostrado que cuando más profundo se deposite el semen, mayor será el índice de fertilidad. En la oveja, con frecuencia solo es posible practicar la deposición de semen no más de 1 cm de profundidad en el canal cervical debido 18

22 a la estructura atómica del cérvix. Con esta técnica se logran porcentajes de fertilidad entre el 30 al 60% dependiendo el sitio de deposito del semen y la habilidad del técnico para llevar a cabo la inseminación. Figura 8. Procedimiento para la inseminación peri cervical en ovinos. 5.2 Inseminación artificial intrauterina por laparoscopía La inseminación artificial intrauterina por laparoscopia (IAL), es una inseminación efectuada por medio de una pequeña operación quirúrgica. Las ovejas tienen que mantenerse en ayunas 24 h anteriores a la intervención y se les suministra un sedante (xilacina y ketamina) antes de la cirugía. Se le coloca en una camilla que se eleva en un ángulo aproximado de 30. El abdomen de la oveja se esquila y rasura, se desinfecta y se hacen de dos a tres incisiones pequeñas a 5cm por debajo de la ubre y a los lados de la línea media con el bisturí y se introducen, a través de estas incisiones, los trocares y cánulas (instrumentos quirúrgicos) entre la pared del cuerpo y la cavidad peritoneal de la oveja (Figura 9) La cavidad del cuerpo se insufla con CO2 (Dióxido de carbono) o aire con el uso de una bomba domestica para poder observar mejor el útero El técnico observa a través de laparoscopía, la ubicación del aparato reproductor de la oveja. una vez 19

23 localizados los cuernos se introduce a través de uno de los orificios el aplicador de I.A provisto de un azpic el cual tiene en la punta que penetra el cuerno llegando hasta la luz lugar donde se deposita la mitad de la dosis de semen, repitiéndose esto en el otro cuerno. El volumen total de semen depositado es de.25 ml con una concentración de 15 a 20 millones de espermatozoides. La tasa de preñez alcanzada con este método es de 70 a 85%. Se requiere de instrumental especial y un técnico especializado para su manejo. Es también un procedimiento costoso. La técnica de inseminación intrauterina es más eficiente que la inseminación cervical, debido a la menor cantidad de espermatozoides necesarios para conseguir un nivel aceptable de fertilidad, lo que equivale a aproximadamente de 10 a 20 veces menos que en el caso de la inseminación tradicional. Figura 9. Técnica de inseminación artificial intrauterina por laparoscopia en ovinos 20

24 Equipo para la inseminación artificial El equipo básico para la inseminación cervical consiste de una lámpara de cabeza, un espectáculo y una pipeta o aplicador de Inseminación Artificial. El espectáculo tipo pico de pato es preferible al tipo tubular, ya que permite una mejor visibilidad y localización de cérvix y es más fácil de limpiar (por dentro y por fuera). Algunos espéculos llevan una lámpara incorporada. Sin embargo, es mas practico utilizar una lámpara que se coloca en la cabeza del técnico y que funciona con una batería de 6 voltios. Para la inseminación cervical se utilizan varios tipos de pipetas o pistolas de inseminación, pero las mas populares son las pipetas de plástico de un solo uso que son fabricadas de plástico robusto interno de 2.5 mm, mientras que el extremo es de 5.5mm para utilizar en las ovejas; la punta de 1cm esta ligeramente doblada en un ángulo de 30. Estas pipetas también se pueden utilizar en cabras, aunque la penetración en cérvix suele ser más fácil si no están dobladas por la punta. El extremo opuesto se conecta a una jeringa hipodérmica de 10 ml y cada vez que se acciona solo puede liberar una dosis. Para la aplicación de semen contenido en pajillas (en forma líquida o congelada) se utiliza un aparato llamado pistola de inseminación o aplicador para inseminación artificial en ovinos.. Equipo para inseminación artificial intrauterina Está formado por un telescopio, dos equipos de trocar-cánula, uno para el telescopio con una conducción de aire o gas y llave de dos vías, una para este y otro para la pipeta de inseminación, de 5mm; una fuente de luz y cable de fibra óptica; una bomba de gas (dióxido de carbono o aire) con regulador, y una línea de conducción de ese aire o gas. (Figura 11). El aplicador o pistola de inseminación esta provisto de áspic y de capacidad de.25 a.50 ml. 21

25 F Figura 10 Equipo e instrumental para I.A intrauterina en ovinos Dosis de inseminación Las siguientes son dosis de inseminación de referencia para la IA con semen fresco (en millones de espermatozoides): cervical: 800 (ovinos). laparoscópica: 80 (ovinos) (Baril y col, 1989; La dosis seminal empleada en la IA laparoscópica con semen congelado en ovinos, es de 100 millones de espermatozoides. Momento óptimo de realización de la IA En ovinos, es recomendable realizar la IA laparoscópica con semen fresco a las 32 horas de iniciado el celo (Brebion y col, 1992). En el caso de utilizarse semen congelado es conveniente realizarla entre las 40 a 44 horas del fin del tratamiento (Evans y col, 1986). han obtenido una tasa de fertilidad del 70-80% al realizar la IA indistintamente a las 42 o 55 horas. 22

26 Tasa de fertilización En ovinos, mediante IA con semen fresco, se han obtenido tasas de fertilización del 77% y 93% en la IA cervical y laparoscópica, respectivamente (Brebion y Col, 1988). 6.- Colecta de embriones Los embriones se recogen mediante lavados sucesivos de los cuernos uterinos. Para ello se inyecta una solución fisiológica (PBS: Phosphate buffered saline) en un extremo de los cuernos y el flujo generado empuja los embriones al extremo opuesto del cuerno, donde se recuperan mediante un catéter colector. La metodología empleada para la colecta de embriones consiste en inyectar un medio líquido para producir una corriente de arrastre (lavado o flushing) a través de los cuernos uterinos. El medio que se utiliza es el PBS (Solución Buffer Fosfato) enriquecida con 4% de Albúmina sérica bovina (BSA fracción V) o 10% de suero fetal bovino. En general, la colecta de embriones se realiza entre los días 6º a 7º, posterior al día de inicio del celo (día cero). La razón de estos tiempos se debe a los siguientes fundamentos: - Los embriones están en el tercio superior de los cuernos uterinos. - Presentan la membrana pelúcida, necesaria como barrera sanitaria. - La congelación se realiza en estado de mórula compacta o blastocisto (Romo 1993). Las técnicas para la colecta de embriones en los rumiantes menores son: Técnica quirúrgica -laparotomía media. Técnica no quirúrgica -laparoscopía. - transcervical( Elsden, & Seidel 1986). Estas intervenciones se llevan a cabo bajo anestesia general. Es indispensable que los animales no reciban alimento ni agua, en las 24 horas previas a la operación. Se utiliza un tranquilizante y un anestésico, es posible realizar una combinación de Xilazina (0,11 mg/kg) y Clorhidrato de ketamina (5.5 mg/kg), suministrando esta última a los 10 minutos de la primera. (Martínez 1999) 23

27 6.1 Técnica quirúrgica abajo). La hembra se ubica en un plano inclinado en una camilla (cabeza hacia Figura 8. Sitio de realización de la laparoscopia para la transferencia de embriones Se rasura y se desinfecta el campo operatorio. Se realiza una laparotomía media de 5 a 7 cm, y a 3 cm por delante de la ubre. Antes de comenzar con la recuperación embrionaria se realiza la exteriorización de los ovarios, para determinar la respuesta ovulatoria (número de cuerpos lúteos). La intervención consiste en la colocación de una sonda Se realiza una punción en la unión útero tubárica con aguja roma numero 18 o catéter intravenoso o bien con la punta de una pinza de mosquito y se coloca la sonda en el interior de la luz del cuerno uterino (1 cm),. Aproximadamente a un par de cm de la bifurcación de los cuernos uterinos, se realiza una segunda punción, para la inyección de 20 cc de medio de colecta a 37 C. De esta manera se produce una corriente de arrastre que fluye hacia el oviducto y que sale por la sonda (No 8) hasta un filtro em com de colecta. 24

28 Figura 9. Técnica para la colecta de embriones en ovinos Finalizada la recuperación embrionaria, se realiza la sutura de los planos quirúrgicos y se administran antibióticos. Se procede de igual manera con el otro cuerno uterino. También es posible ubicar una sonda de Foley en la bifurcación de los cuernos uterinos, recuperando el líquido de colecta por la misma sonda. El medio recuperado es vaciado en cajas de Petri cuadriculadas para proceder a la búsqueda de embriones bajo un microscopio estereoscopico con lente 10X. Esta técnica permite una recuperación del 70% de los embriones. El inconveniente que presenta es la formación de adherencias post quirúrgicas que reducen la eficiencia de posteriores recuperaciones embrionarias ( León et al., 2009). 6.2 Técnica no quirúrgica La técnica no quirúrgica o por laparoscopía, fue desarrollada por Mc Kelvey y col. (1986) en ovinos, se realizan tres punciones (con trócares) en la cavidad abdominal. La primera punción permite introducir el laparoscopio; la segunda, una sonda de tres vías (cada vía corresponde a: 1) entrada del PBS, 2) salida del PBS e 3) insuflación del balón); y la tercera, una pinza no traumática. Esta pinza permite la manipulación del tracto reproductivo, a fin de hacer avanzar la sonda por la luz uterina, y fijar la unión útero tubárica durante el flujo del PBS. Esta técnica requiere un muy buen entrenamiento y su costo es elevado debido a 25

29 la necesidad de disponer de un laparoscopio. Presenta una menor eficiencia en la recuperación de embriones (60%). La obstrucción de la sonda por coágulos o mucus representa a veces una gran dificultad; pero su ventaja es que no crea adherencias y por lo tanto no se disminuye el porcentaje de recuperación embrionaria en intervenciones sucesivas. El tiempo medio para realizar una recuperación de embriones es de aproximadamente 15 a 20 minutos (quirúrgica) y 20 a 30 minutos (por laparoscopía) por hembra (Nellenschulte y Niemann 1992). La recuperación embrionaria transcervical no ha alcanzado amplio desarrollo, debido a que es una técnica cuya eficiencia es muy variable. Independientemente de la técnica de recuperación embrionaria utilizada, se debe administrar prostaglandinas PF2 alfa al final de las intervenciones, para estar seguros que las hembras no han quedado preñadas. (Bessoudo et al., 1988). 7.- Evaluación y clasificación de embriones El medio colectado con embriones es vertido en una placa de búsqueda de embriones. La búsqueda se realiza bajo lente 10x con sumo cuidado. Se recomienda efectuar siempre una segunda lectura de la placa. A medida que se identifican los embriones, los mismos son aspirados mediante micropipetas, puntas o capilares y colocados en una caja de Petri con medio para transferencia enriquecido, Una vez finalizada la búsqueda, se procede a la clasificación de los embriones. Se recomienda trabajar en condiciones estrictas de esterilidad (International Embryo Transfer Society. 1987). Figura 10. Búsqueda y evaluación de embriones 26

30 La clasificación de los embriones se realiza en base a sus aspectos morfológicos, se debe observar la integridad de la membrana pelúcida y su esfericidad. El embrión debe tener un desarrollo acorde con el día de colecta; se tolera hasta un máximo de 48 horas de retraso. En el día 6to o 7mo, se deben descartar los embriones de menos de 32 células. Las células deben ser claras y de contorno regular, siendo la opacidad signo de degeneración. En algunos embriones, se puede observar desprendimiento parcial de células en el espacio perivitelino. Esta característica es tolerable si el resto conforma una masa celular uniforme y sin opacidad. Cuando los embriones son dudosos, se recomienda realizar una segunda observación a las dos horas. Este tipo de examen morfológico no constituye un test absoluto de la viabilidad embrionaria. Sin embargo se presentan diferencias significativas en el porcentaje de preñez cuando se transfieren embriones de calidad media o mediocre respecto a la calidad buena o excelente Esta diferencia es mayor cuando se procede a la siembra de embriones que fueron congelados en nitrógeno líquido. Grados de clasificación de embriones Grado I: Excelente, embrión ideal, esférico, simétrico, con células de tamaño, color y textura uniforme. El desarrollo embrionario corresponde al día de la recolección. No existen defectos visibles. Los blastómeros son claramente visibles y la zona pelúcida está intacta. Grado II: Bueno, hay algunas imperfecciones triviales, el embrión tiene muy pocos blastómeros desprendidos de la masa celular y/o posee una pequeña cantidad de vesículas. Su forma puede ser ligeramente irregular. Grado III: Regular, el embrión posee defectos definidos: detritus celulares, forma irregular, color muy oscuro o muy claro y/o ligero agrietamiento de la zona pelúcida. Pocas células degeneradas, vesículas y presencia de blastómeros desprendidos. Grado IV: Malo, el embrión posee severos defectos: los correspondientes al grado III más desarrollo retardado, seria ruptura de la zona pelúcida -el embrión puede estar parcialmente fuera de la misma-, forma muy asimétrica, tendencia a la desintegración con granulación y vacuolización de los blastómeros. Incluye a los 27

31 estados hasta 8 células y la degeneración. Esta categoría de embriones no es transferible. Una vez evaluados los embriones, algunos pueden ser transferidos en fresco y otros pueden ser congelados para su posterior transferencia. Cuadro 1. Clasificación de los embriones de acuerdo a su calidad y características morfológicas Según su estadio código Según su calidad código Ovulo 1 Excelente 1 Mórula de 2 a 16 células 2 Bueno 2 Mórula temprana 3 Regular 3 Mórula compacta 4 No transferible 4 Blastocito temprano 5 Blastocito maduro 6 Blastocito expandido 7 Blastocito en eclosión Transferencia de embriones Se recomienda que el tiempo transcurrido entre la recuperación de los embriones y su transferencia, no supere las 2 horas. Si se trata de embriones previamente congelados, el tiempo entre descongelamiento y transferencia se reduce a 20 o 30 minutos. El sitio habitual de transferencia de los embriones es el cuerno ipsilateral del ovario con cuerpo lúteo. Los 2 métodos más utilizados en la transferencia de embriones son el quirúrgico, o no quirúrgico por laparoscopía (González y col, 1991a). 28

32 En ambos casos se procede a realizar una punción en la cara dorsal del cuerno uterino y en su tercio superior. Mediante una micropipeta, se deposita el embrión en la luz uterina (acondicionado en 10 µl de medio de transferencia). Existe una técnica combinada en la cual se identifica por laparoscopía el ovario que tiene el cuerpo luteo de la receptora, y el cuerno uterino ipsilateral y se realiza una pequeña incisión de 3cm en la línea media abdominal, y mediante una pinza, se exterioriza el cuerno uterino para realizar la transferencia embrionaria. Se colocan dos o un embrión, sin embargo en ovinos la eficiencia global (corderos logrados/embriones transferidos) es mayor cuando se transfiere un embrión por hembra receptora (Cseh y Seregi, 1993). Figura 11 exteriorización de cuerno y transferencia del embrión en ovinos. 9.- Congelación de embriones La congelación de las células embrionarias se logra mediante un complejo de procedimientos físico-químicos de transporte de calor y agua entre las células y el medio que la rodea, por la incorporación de sustancias crioprotectoras (polialcoholes) que son capaces de penetrar en las células por difusión simple y que tienen la función de retardar la formación de cristales de hielo (Niemann 1991). 29

33 El principio biológico de la crioconservación de embriones está caracterizado por la capacidad de disminuir todos los procesos metabólicos de forma reversible, interrumpiendo la embriogénesis por periodos prolongados sin afectar su viabilidad. (McGinnis et al., 1993) Entre los más utilizados se encuentra el etilenglicol, el glicerol, el dimetilsulfóxido (DMSO) y la sucrosa. Para la crioconservación de embriones de los pequeños rumiantes se utiliza por elección el etilenglicol como crio protector y en la congelación se utiliza un congelador programable bajando la temperatura de 20 C a 7 C a razón de 5 C por minuto, la deshidratación celular de 7 c(temperatura a la que se realiza la inducción del hielo (seeding) a 35 C debe ser muy lenta a razón de 0,3 C/min. Para limitar al máximo la cristalización del agua de las células. Al finalizar la programación del descenso de la temperatura las pajuelas son sumergidas en nitrógeno líquido a 196 C, con el fin de no llevar la deshidratación de las células más allá de lo permitido. 9.1 Aspectos básicos La congelación controlada, también conocida como criopreservación, es una técnica que actualmente está bien establecida y cada día se usa más. Mediante este procedimiento los embriones sufren un proceso de deshidratación al enfriarse lentamente en una solución que contiene una substancia crioprotectora, es decir, que protege contra las bajas temperaturas. 30

34 Figura 12. Congeladora automática de embriones ovinos La descongelación puede ser lenta o rápida, dependiendo del nivel de deshidratación que haya alcanzado el embrión. Cada paso, desde la preparación de la solución crioprotectora hasta la evaluación del embrión después de la descongelación, tiene que ser controlado con precisión y llevado a cabo con cuidado. Esto requiere de considerable habilidad y experiencia (Leibo 1988). Recientemente se ha visto un aumento significativo en la facilidad con que se pueden congelar y descongelar los embriones del ganado ovino; asimismo, los porcentajes de supervivencia de embriones congelados mejoran continuamente sin embargo, los resultados pueden variar considerablemente entre donadoras y entre técnicos. La eficiencia de la congelación de embriones (CE) ha mejorado enormemente, hasta el punto en que los porcentajes de preñez de embriones congelados deben de ser solamente 5 o 10% menores que los obtenidos con 31

35 embriones frescos. Publicaciones recientes, indican que la mayoría de los porcentajes de preñez que se obtienen en condiciones de campo con frecuencia están por debajo del 50%, y que los embriones de algunas donadoras sobreviven mejor que los de otras. Un mercado de exportación de embriones congelado puede tener gran éxito si factores como la calidad de los embriones, la selección de receptoras y la sincronización entre donadoras y receptoras se mantienen dentro de límites razonables. 32

36 15.- CONCLUSIONES La TE puede incrementar el número de crías de una hembra genéticamente superior, permitiendo obtener en promedio 4 crías por tratamiento de ovulación múltiple. La transferencia de embriones sin lugar a dudas sigue siendo una de las biotecnologías que mayor futuro tiene sobre todo en nuestro país y puede contribuir a lograr altos niveles de respuesta genética. Sin embargo, se necesita más investigación para mejorar la eficiencia de dichas técnicas. Si se mejora la eficiencia, se pueden reducir los costos, haciendo que estos procedimientos sean competitivos y redituables, lo que permitirá cambios más rápidos y dramáticos en la ganadería. Hace falta mucho todavía en el estudio de los efectos del medio ambiente bajo condiciones tropicales y sobre todo en las diferentes épocas del año. El congelamiento y la vitrificación de embriones a pesar que han demostrado ser una herramienta importante para el mejoramiento genético, su uso y difusión es limitado entre otras causas por su alto costo, necesidades de equipo e infraestructura así como de técnicos especializados. Sin embargo, solo aplicando estas herramientas biotecnológicas, en esta época de grandes cambios y adelantos científicos permitirá la superioridad genética que la ovino cultura merece y necesita. 33

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