Agrobiotecnología Curso Clonación y transgénesis animal

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1 Curso 2009 Clonación y transgénesis animal Lino Barañao Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

2 Sumario Clonación Clonación en distintas especies Recombinación homóloga Aplicaciones Referencias

3 Clonación

4 La clonación consiste en la producción de individuos genéticamente idénticos En los animales, la clonación se basa en el uso de la técnica de transplante nuclear. Mediante esta técnica, una célula donante. del individuo a clonar se transfiere a un. ovocito previamente enucleado. célula donante ovocito embrión sintético Enucleación Electrofusión TRANSPLANTE NUCLEAR

5 Clonación reproductiva de bovinos Para la clonación de bovinos suele partirse de células fetales como donantes del material genético. Los ovocitos pueden provenir de animales sacrificados para consumo ya que sólo aportan el ADN mitocondrial. El embrión obtenido en cultivo debe ser luego transferido a una hembra receptora para completar su desarrollo.

6 Células donantes Células adultas - La vida media es de 20 divisiones celulares. - La tasa de divisiones de 0,8 divisiones por día. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - Se desarrollan en menor proporción. Células fetales - La vida media es de 35 divisiones celulares. Ello permite su manipulación genética. - La tasa de divisiones de 1,3 divisiones por día. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - Se desarrollan en mayor proporción. cortar el tejido explanto

7 Ovocito recipiente 24 hs Expansión de las células del cúmulus OVOCITOS INMADUROS OVOCITOS MADUROS Primer cuerpo polar Los ovocitos obtenidos de ovarios de animales sacrificados para consumo deben ser madurados in vitro. La maduración consiste en el avance de la división meiótica hasta la metafase II. En este estadío se observa la extrusión del primer cuerpo polar.

8 Transplante nuclear Para implementar la técnica de transplante nuclear se requiere disponer de micromanipuladores y de un microscopio con accesorios para visualizar fluorescencia. Gentileza de Biosidus S.A.

9 Transplante nuclear Gentileza de Biosidus S.A. Ovocito en MII Enucleación Célula donante Transplante nuclear

10 Fusión celular Gentileza de Biosidus S.A.

11 Activación Post-fusión Post-activación Desarrollo embrionario y preñez

12 Aplicaciones de la clonación La clonación reproductiva tiene distintas aplicaciones en biotecnología animal. - Clonado con fines agropecuarios - Clonado de animales de zoológicos y mascotas - Clonado para introducir modificaciones genéticas La clonación terapéutica se aplica en medicina humana.

13 Clonación en distintas especies

14 Clonación en ovinos El primer mamífero clonado a partir de una célula somática fue una oveja, la ahora mundialmente conocida Dolly. Tomado de:

15 Clonación de bovinos Uno de los primeros bovinos clonados fue Second chance Tomado de: Hill et al., Biol. Reprod., 2000.

16 Clonación de bovinos Pampa fue la primera ternera nacida por clonación a partir de fibroblastos fetales en Argentina Gentileza de Biosidus S.A.

17 Clonación de mascotas A pesar de que su dueño invirtió más de 3 millones de dólares en ello, Missy murió en 2002 sin haber sido clonada.

18 Clonación de mascotas Clon de Little Gizmo Clon de Rainbow

19 Cerdos clonados obtenidos por transferencia nuclear de células somáticas de un animal adulto El clonado de cerdos requirió modificar la técnica habitual de transplante nuclear. Tomado de: Poleiaeva et al., Nature, 2000.

20 Clonación de primates Neti y Ditto Tomado de: Meng et al., Biol. Reprod.,1997.

21 Clonación de humanos? La clonación reproductiva carece de justificación médica. Su aplicación masiva es totalmente improbable en las condiciones actuales

22 Clonación terapéutica La denominada clonación terapéutica permite generar tejidos de reemplazo a partir de células del paciente. Autotransplante Tejido normal (ej. fibroblastos) Transplante nuclear Factores de crecimiento Matriz extracelular Ovocito (donado) Embrión (?) sintético Células embrionarias (pluri o totipotenciales) Células precursoras del tejido dañado

23

24 Un animal transgénico es aquel que tiene una porción de ADN foráneo en su genoma. - Los primeros animales producidos fueron. ratones, obtenidos mediante microinyección de cigotas Macho fértil X Hembra superovulada Colecta de embriones Inyección con ADN foráneo Promotor Implantación de los embriones en hembras seudopreñadas Crías Extracción del ADN y detección de la presencia del transgen

25 Elementos requeridos en una construcción genética ADN genómico ARN mensajero Promotor original del gen a expresar exones intrones ADN copia Gen recombinante Promotor regulable o tejido específico intrón

26 La técnica de microinyección de cigotas resulta muy poco eficiente en bovinos Microinyección de cigotas bovinos Eficiencia en la la producción de animales Transgénicos por microinyección Cigotas microinyectadas Sobreviven la microinyección Embriones transferidos a receptoras 250 Preñeces 50 Terneros 1

27 Clonación y transgénesis La introducción de genes por transfección y posterior selección de células totipotenciales permite producir animales con muy alta eficiencia. Gentileza de Biosidus S.A.

28 Recombinación homóloga

29 Recombinación homóloga promotor gen endógeno exones contrucción conteniendo un gen de resistencia a antibiótico flanqueado por secuencias homólogas al exón a eliminar secuencias homólogas Neo intrones gen de resistencia a antibiotico Neo recombinación Neo el alelo en el que se ha producido la recombinación homologa no produce proteína activa

30 Recombinación homóloga La recombinación homóloga elimina un alelo por vez. Los animales resultantes son heterocigotas. recombinación homóloga linea celular de partida Neo se ha eliminado uno de los alelos del gen transferencia nuclear el animal resultante posee todavía una copia activa del gen

31 Recombinación homóloga Para obtener homocigotas (que no expresen la proteína) es necesario el cruzamiento de machos y hembras genéticamente modificados. Neo X Neo Neo Neo Neo Neo Homocigota

32 Recombinación homóloga Cupido y Diana, primeros corderos producidos por la técnica de gene targeting Tomado de: McCreath et al., Nature, 2000.

33 Estrategias alternativas para la supresión de una proteína Proteína a suprimir Traducción Silenciamiento por RNAi X ARNm Recombinación homóloga X Transcripción ADN

34 Silenciamiento génico La introducción de secuencias cortas (22pb) de ARNs homólogos de doble cadena desencadena un proceso que degrada al ARNm blanco y conduce a la supresión de la proteína respectiva Degradación del ARNm ARN doble cadena Transcripción ADN

35 Características de los métodos usados para suprimir proteínas Recombinación homóloga - Afecta al ADN (suprime el gen) - Requiere dos generaciones para obtener el fenotipo deseado - La supresión es total - Proteínas candidatas: PrP, lactoglobulina Silenciamiento por ARNi - Afecta al ARN (suprime al mensajero) - El fenotipo deseado se obtiene en la primera generación - Pueden obtenerse niveles intermedios - Proteínas candidatas: lactoglobulina, proteínas de la leche, miostatina

36 Aplicaciones

37 Aplicaciones Producción de alimentos: - Incremento en en la la velocidad de de crecimiento y/o y/o masa muscular en en cerdos y peces - Introducción de de genes de de resistencia a enfermedades Producción de órganos para xenotransplante: - Producción proteínas humanas que que bloquean la la acción del del complemento en en cerdos (ejemplo, CD59) - Transplantes temporaríos de de corazón o hígado hasta la la obtener donantes compatibles Fines ornamentales: - Peces que que expresan proteinas fluorescentes Producción de fármacos ( molecular pharming ) - Producción de de proteínas recombinantes humanas en en leche y suero Modelos animales para patologías humanas - Efectos de de sobreexpresión de de genes - Eliminación de de genes ( knock out ) out )

38 Transgénesis en bovinos. Producción de alimentos Cambios cualitativos en la producción de leche: - Producción de lactoferrina en leche bovina - Producción de leches humanizadas - Modificación de las caseínas para la producción de. quesos especiales Cambios cualitativos en la producción de carne: - Producción de carne bovina libre de riesgo de BSE - Modificaciones cualitativas

39 Transgénesis en bovinos. Producción de alimentos Bovinos genéticamente modificados para mejorar la producción láctea

40 Transgénesis en peces. Producción de alimentos La introducción de copias extra del gen de hormona de crecimiento aumenta notablemente la velocidad de desarrollo de truchas y salmones. Tomado de: Devlin et al., Nature, 2001.

41 Transgénesis en peces. Fines ornamentales Expresión de proteínas fluorescentes en peces cebra

42 Transgénesis en peces. Modelos experimentales El uso de promotores específicos permite detectar patrones de expresión durante el desarrollo Tomado de: Wittbrodt et al., Nat. Rev. Genet., 2002.

43 Transgénesis en insectos: transformación de gusanos de seda Tomado de: Tomita et al., Nat. Biotechnol., 2003.

44 Transgénesis en insectos: mosquitos Se está intentando producir mosquitos resistentes al parásito de la malaria. Tomado de: Catteruccia et al., Nature, Larvas de mosquitos (izquierde y centro) que expresan el gen de la proteína GFP. Panel de la izquierda: luz UV; panel de la derecha: luz blanca

45 Transgénesis en aves La expresión de proteínas en la clara de huevo tiene un enorme potencial. La transgénesis en aves se enfrenta todavía con notables dificultades técnicas derivadas de los problemas del aislamiento de ovocitos y cigotas y el posterior cultivo embrionario. Se ha logrado expresar enzimas en la clara del huevo y se obtuvieron quimeras que expresan genes marcadores. La heredabilidad de estos caracteres es baja.

46 Transgénesis en cabras La empresa Nexia (Canadá) ha logrado producir cabras que expresan fibroína (proteína de la tela de araña) en su leche. Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., 2001.

47 Transgénesis en cerdos Se han transformado cerdos con el gen de la Green Fluorescent Protein mediante transfección de células somáticas en cultivo y posterior clonado. Xenotransplante: - La eliminación de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa permitiría obtener cerdos que no posean el residuo galactosa en su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al rechazo agudo. Universidad de Missouri-Colombia Immerge BioTherapeutics Inc

48 Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes humanas en la leche animal Capacidad de producción de proteínas recombinantes en la leche en distintas especies Cerdo Cabra Oveja Vaca Litros/año Proteína

49 Aplicaciones. Producción de fármacos Volumen del mercado mundial en proteínas humanas: - U$S millones Ejemplos: - Antitrombina 3: 3: U$S 200 millones - Albúmina sérica: U$S millones Requerimientos mundiales de proteínas humanas y número de animales necesarios para satisfacerlo Factor VIII 120 g 2 vacas ovejas Alfa-1-antitripsina kg ovejas cabras Factor IX 2 kg 13 ovejas 22 cerdos Albúmina sérica 1000 kg 300 vacas cabras Activador tisular del plasminógeno 75 kg 600 cabras

50 Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes humanas en la leche animal 1 huevo de oro (1,3 kg) por día U$S /día Vaca transgénica 2 g/l htpa U$S/g 30 L por día U$S /día

51 Aplicaciones El uso de animales como bioreactores permitiría suplir la demanda de proteínas recombinantes, en particular de aquellas que requieren producción masiva. Demanda de capacidad productiva instalada (datos a nivel mundial)

52 Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes en leche de animales : Productividad de 1 animal transgénico: 1,5 kg de proteína terapéutica/año = equivalente a L de fermentación o sea 1 animal transgénico = 4 fermentadores de 500 L Demanda anual de hormona de crecimiento (hgh): - Mercado latinoamericano: producción de 2 animales - Mercado mundial: producción de 40 animales

53 Referencias 1. Palma, G.A. Biotecnología de la Reproducción. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Argentina), Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo, J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang, S.K., Kim, S.J., Ahn, C., Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, S.Y. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science, 303: , Cristophides, G.K. Transgenic mosquitoes and malaria transmission. Cellular Microbiology, 7: , Wilmut, I. Cloning for Medicine. Scientific American, 279:58-63, Sitios relacionados con clonación animal:

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