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1 ScanGel NEUTRAL Tarjetas Tarjetas GEL NEUTRO Grupo sérico, screening de Ac irregulares, pruebas cruzadas IVD Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad se hallan bajo un sistema de garantía de calidad desde la recepción de las materias primas hasta la comercialización de los productos finales. Cada lote de producto final se somete a un control de calidad y sólo se comercializa si está en conformidad con los criterios de aceptación. El fabricante conserva la documentación referente a la producción y al control de cada lote. 21

2 I - UTILIZACIÓN Y PRINCIPIO DE LA PRUEBA Esta tarjeta está estrictamente reservada para uso profesional e in vitro. Designada a la realización de la prueba sérica del tipaje ABO, para el estudio (detección e identificación) de los anticuerpos irregulares antieritrocitarios, para la prueba de compatibilidad, el test combina los principios de aglutinación y filtración en gel. La reacción se obtiene y se lee tras la centrifugación de unos microtubos especialmente diseñados, rellenos de gel neutro. La suspensión de glóbulos rojos y el suero o el plasma a ensayar se depositan en el pocillo de los microtubos que se centrifugan tras un periodo de incubación. Los glóbulos rojos no aglutinados se depositan en el fondo del microtubo, mientras que los aglutinados se retienen por todo el gel en función de su tamaño. Su posición en el gel determina la intensidad de la reacción II - CARACTERÍSTICAS DE LOS REACTIVOS Los microtubos de la tarjeta ScanGel Monoclonal NEUTRAL contienen gel neutro. Este reactivo contiene azida sódica (< 0,1 %) como conservante. El código del producto y el número de tarjetas por caja se indican en la etiqueta de la caja. III - CADUCIDAD Y CONSERVACIÓN La fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento se indican en la caja. Las tajetas deben conservarse a temperatura ambiente, de +15 C a +25 C. Las tarjetas deberán almacenarse verticalmente, protegidas de las fuentes de calor, en un local con escasas variaciones de temperatura e higrométricas. IV - PRECAUCIONES La calidad de los resultados depende del respeto de las buenas prácticas de laboratorio siguientes : No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. No utilizar tarjetas que muestren signos de desecación o burbujas, o si la lengüeta de sellado muestra signos de deterioro o está parcialente retirada. 22

3 Es indispensable tomar las precauciones necesarias para no provocar contaminaciones inter-microtubos, especialmente en las etapas de distribución. Utilizar una punta de pipeta para cada muestra y para cada glóbulos rojos-test. Comprobar la precisión y el correcto funcionamiento de las pipetas y de los otros equipos. Llevar guantes y gafas de protección durante la manipulación de los reactivos y de las muestras. No pipetear directamente con la boca. Evitar las salpicaduras. En caso de salpicaduras, limpiar las superficies manchadas con lejía de 12 Cl diluida al 10% y secar con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá ser desechado en un contenedor especial para residuos contaminados. Producto y fungible que hayan estado en contacto con muestras o reactivos que contenga material de origen humano deben ser descartados una vez descontaminados. Las fichas de seguridad están disponibles bajo petición. V - RECOGIDA Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS La sangre debe obtenerse en condiciones de asepsia en un tubo sin o con anticoagulante (EDTA, CPD). Tras la obtención, la prueba debe realizarse lo antes posible. Las muestras que no puedan analizarse rápidamente deberán conservarse entre +2 C y +8 C para ser sometidas a prueba en las 48 horas siguientes. En ningún caso debe observarse hemólisis. No calentar las muestras. VI - TÉCNICAS Material suministrado Tarjetas ScanGel NEUTRAL Material necesario pero no suministrado Incubador : ScanGel Incubator IH QC : Control de serología de grupos sanguíneos IH QC 4 x 6 ml Centrífuga : ScanGel Centrifuge Pipetas automáticas o semiautomáticas Puntas de pipetas Tubos de un solo uso Contenedor especial para residuos con riesgo biológico Lejía 23

4 Guantes de látex Papel absorbente Gafas de protección Controles Se recomienda efectuar en paralelo un autocontrol para cada prueba (suero o plasma y glóbulos rojos del paciente) para la detección e identificación de anticuerpos irregulares. Controles positivo (suero conocido que contenga al menos un anticuerpo) y negativo (suero conocido que no contenga ningún anticuerpo). IH QC : Control de serología de grupos sanguíneos. Procedimiento Seguir estrictamente el protocolo propuesto. Antes de su utilización, llevar todos los reactivos a temperatura ambiente. Por centrifugación (2000 g x 2 minutos), separar el suero o el plasma de los glóbulos rojos de la muestra a probar. Cuando la obtención se sangre se realiza en tubo seco, el suero se debe volver a centrifugar a 1500 g durante 10 minutos. 1 - Prueba sérica del tipaje ABO Reactivo necesario pero no suministrado ReverScan A1, A2, B y O : Hematíes para grupo sérico del grupaje ABO ReverScan A1, B x 5 ml ReverScan A1, A2, B, O x 5 ml Técnica Utilizar los glóbulos rojos-test listos para usar ReverScan A1, A2, B u O. 1. Identificar cada tarjeta o la parte de la tarjeta (según el número de glóbulos rojos test utilizados para la muestra) con el nombre o el número de muestra correspondiente; en cada microtubo, identificar el glóbulo rojo test que se distribuirá. Retirar completamente la lengüeta de aluminio de las tarjetas. Resuspender los hematíes antes de usar. 2. Distribuir 50 µl de cada suspensión de glóbulos rojos tests en el pocillo de los microtubos apropiados. 3. Añadir 50 µl de suero o de plasma a ensayar en el pocillo de todos los microtubos correspondientes a la muestra ensayada. 4. Incubar 15 minutos a temperatura ambiente (+15 C C). 5. Centrifugar 10 minutos en ScanGel Centriguge. 6. Leer las reacciones. 24

5 2 - Detección e identificación de los anticuerpos irregulares antieritrocitarios con técnica enzimática en 2 tiempos Reactivo necesario pero no suministrado Papaína Bio-Rad Papaína 2 ml ScanSol : medio de suspensión de los glóbulos rojos ScanSol 100 ml ScanSol 500 ml ScanCell P, ScanPanel P : glóbulos rojos listos para usar pretratados con papaína, para la detección e identificación de anticuerpos irregulares antieritrocitarios con la técnica enzimática en 2 tiempos ScanCell P 3 x 10 ml ScanPanel P 10 x 3 ml a) Adición de papaína y preparación de una suspensión de glóbulos rojos cuando éstos no están listos para usar (autocontrol) Lavar 3 veces los glóbulos rojos con solución salina isotónica. Añadir volumen a volumen la papaína reconstituida y el precipitado globular. Mezclar. Incubar 7 minutos a +37 C en baño maría. Es importante respetar estrictamente este tiempo de contacto entre los hematíes y la papaína. Lavar 3 veces con solución salina isotónica. Distribuir 1 ml de ScanSol en un tubo de uso único identificado. Añadir 10 µl del precipitado globular con papaína y lavado. Mezclar. La suspensión de glóbulos rojos puede utilizarse durante una semana. Debe conservarse entre +2 C y +8 C. b) Técnica 1. Identificar cada tarjeta o la parte de la tarjeta (según el número de glóbulos rojos test utilizados para la muestra) con el nombre o el número de muestra correspondiente; en cada microtubo, identificar el glóbulo rojo test que se distribuirá. Retirar completamente la lengüeta de aluminio de las tarjetas. Resuspender los hematíes antes de usar. 2. Distribuir 50 µl de cada suspensión de glóbulos rojos tests listos para usar ScanCell P o ScanPanel P o de la suspensión de glóbulos rojos preparada en 2- a) en el pocillo de los microtubos apropiados. 3. Añadir inmediatamente 25 µl de suero o de plasma a ensayar en el pocillo de los microtubos correspondiente a la muestra ensayada. En ningún caso el periodo de tiempo entre la distribución de los glóbulos rojos y la del plasma o suero debe exceder los 10 minutos. 25

6 4. Incubar 15 minutos a +37 C en el ScanGel Incubator. 5. Centrifugar 10 minutos en ScanGel Centriguge. 6. Leer las reacciones. 3 - Prueba de compatibilidad A. Técnica enzimática en 2 tiempos Reactivo necesario pero no suministrado Papaína Bio-Rad Papaína 2 ml ScanSol : medio de suspensión de los glóbulos rojos ScanSol 100 ml ScanSol 500 ml a) Adición de papaína y preparación de la (de las) suspensión(ones) de glóbulos rojos (donante(s)) Para cada donante : Lavar 3 veces los glóbulos rojos a ensayar con solución salina isotónica. Añadir volumen a volumen la papaína reconstituida y el precipitado globular (glóbulos rojos del donante). Mezclar. Incubar 7 minutos a +37 C en baño maría. Es importante respetar estrictamente este tiempo de contacto entre los hematíes y la papaína. Lavar 3 veces con solución salina isotónica. Distribuir 1 ml de ScanSol en un tubo de uso único identificado. Añadir 10 µl del precipitado globular con papaína y lavado. Mezclar. La suspensión de glóbulos rojos está lista para su uso. b) Técnica 1. Identificar cada tarjeta o la parte de la tarjeta con el nombre o el número del receptor y el número del o de los donantes correspondientes. Retirar completamente la lengüeta de aluminio. Resuspender los hematíes antes de usar. 2. Distribuir 50 µl de cada suspensión de glóbulos rojos preparada en 3-A. a) en el pocillo de los microtubos adecuados. 3. Añadir inmediatamente 25 µl de suero o de plasma del receptor en el pocillo de los microtubos correspondientes. En ningún caso el periodo de tiempo entre la distribución de la suspensión de glóbulos rojos y la del suero o plasma debe exceder los 10 minutos. 4. Incubar 15 minutos a +37 C en el ScanGel Incubator. 5. Centrifugar 10 minutos en ScanGel Centrifuge. 6. Leer las reacciones. 26

7 B. Técnica enzimática en 1 tiempo Reactivo necesario pero no suministrado ScanLiss : medio de suspensión de los glóbulos rojos ScanLiss 100 ml ScanLiss 500 ml ScanBrom : Bromelaína lista para usar ScanBrom 12 ml a) Preparación de la (de las) suspensión(ones) de glóbulos rojos (donante(s)) Para cada donante : Poner 1 ml de ScanLiss en un tubo de un solo uso identificado. Añadir 10 µl del precipitado globular (glóbulos rojos del donante). Mezclar. La suspensión de glóbulos rojos está lista para su uso. b) Técnica 1. Identificar cada tarjeta o la parte de la tarjeta con el nombre o el número del receptor y el número del o de los donantes correspondientes. Retirar completamente la lengüeta de aluminio. Resuspender los hematíes anted de usar. 2. Distribuir 50 µl de cada suspensión de glóbulos rojos preparada en 3-B. a) en el pocillo de los microtubos adecuados. 3. Añadir inmediatamente 25 µl de suero o de plasma del receptor en el pocillo de los microtubos correspondientes. En ningún caso el periodo de tiempo entre la distribución de la suspensión de glóbulos rojos y la del suero o plasma debe exceder los 10 minutos. 4. Añadir 25 µl de ScanBrom en el pocillo de cada microtubo. 5. Incubar inmediatamente 15 minutos a +37 C en el ScanGel Incubator. 6. Centrifugar inmediatamente 10 minutos en ScanGel Centrifuge. En ningún caso el periodo de tiempo entre el final de la incubación y el inicio de la centrifugación debe exceder los 10 minutos. 7. Leer las reacciones. VII - INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La presencia de aglutinados (en la superficie o dispersos en el gel) o de hemólisis en un microtubo corresponde a un resultado positivo que indica que la muestra ensayada contiene al menos un anticuerpo correspondiente a los antígenos presentes en la superficie de los glóbulos rojos ensayados. 27

8 Un sedimento de glóbulos rojos y la ausencia de hemólisis en el fondo del microtubo corresponde a un resultado negativo que indica que la muestra ensayada no contiene anticuerpos correspondientes a los antígenos presentes en la superficie de los glóbulos rojos ensayados y detectables con la técnica utilizada. Los resultados sólo son válidos si los controles positivo y negativo dan los resultados esperados. 1 - Prueba sérica del tipaje ABO Un grupo ABO completo conlleva 2 pruebas complementarias : la prueba globular realizada con los reactivos anti-abo1 (A), anti-abo2 (B) y si es necesario anti-abo3 y la prueba sérica realizada con los glóbulos rojos problema A1, B y si es necesario A2 y O. En la tabla siguiente se muestran los perfiles de las reacciones esperadas con los reactivos anti-abo1 (A), anti-abo2 (B), anti-abo3 (AB) y los glóbulos rojos problema A1, A2, B, O así como sus interpretaciones : GRUPOS PRUEBA SÉRICA : GLÓBULOS PRUEBA GLOBULAR : REACTIVOS ROJOS PROBL. Anti-ABO1 (A) Anti-ABO2 (B) Anti-ABO3 (AB) A1 A2 B O A B AB O La prueba globular y la prueba sérica deben dar resultados concordantes. Cualquier divergencia entre ambas pruebas deberá resolverse antes de dar un resultado de agrupamiento ABO. Cada vez que se observe una divergencia entre las pruebas globular y sérica, habrá que realizar pruebas complementarias con los controles adecuados. 2 - Detección e identificación de los anticuerpos irregulares antieritrocitarios con técnica enzimática 2 en tiempos Un resultado negativo (ausencia de aglutinación y de hemólisis) en todos los microtubos utilizados significa que el suero o el plasma ensayado no contiene anticuerpos, correspondientes a los antígenos presentes en los glóbulos rojos test, que se detecten con la técnica utilizada. Un resultado positivo (aglutinación o hemólisis) en uno de los microtubos utilizados prueba, por el contrario, la presencia de uno o varios anticuerpos en el suero o en el plasma. Entonces se debe realizar la identificación de ese o esos anticuerpos. Un resultado positivo en el microtubo autocontrol puede indicar la presencia de auto-anticuerpos. Si además del autocontrol, al menos uno de 28

9 los glóbulos rojos test está aglutinado, debe sospecharse de una mezcla auto-anticuerpos /alo-anticuerpos. Sólo pueden detectarse los anticuerpos correspondientes a los antígenos presentes en los glóbulos rojos test. En el marco de una identificación, el análisis comparado entre las reacciones positivas y las reacciones negativas observadas con cada uno de los glóbulos rojos test del panel utilizado permite caracterizar, con la ficha de análisis adjunta al panel, la o las especificidad(es) de los anticuerpos presentes en el suero (o plasma) ensayado. 3 - Prueba de compatibilidad Un resultado positivo (aglutinación o hemólisis) muestra la existencia de una incompatibilidad entre el suero o el plasma del receptor y los glóbulos rojos del donante. VIII - COMPORTAMIENTO 1 - Prueba sérica del tipaje ABO Los hematíes ReverScan (A1, A2, B, O) se han evaluado en un panel de 1132 muestras. Cada resultado se ha comparado con el obtenido en la técnica de placa, microplache o por filtración sobre gel. En el conjunto de las muestras, han dado resultados conforme a lo esperado y 2 han presentado discordancias, con uno de los métodos utilizados en paralelo, que han podido eliminarse tras la comparación con la prueba globular. Los hematíes ReverScan asociados a la tarjeta ScanGel NEUTRAL presentan una buena reproducibilidad tanto intra como interensayo, sea cual sea la muestra probada. 2 - Detección e identificación de los anticuerpos irregulares antieritrocitarios con técnica enzimática en 2 tiempos La evaluación de las especificaciones realizada con 2517 muestras (1783 pacientes et 734 donantes) ha demostrado una reacción equilibrada entre sensibilidad y especificidad. Cada resultado ha sido comparado con el obtenido en técnica de immunoadherencia o filtración de gel. El porcentaje de pacientes sin seleccionar que resultan positivos en el estudio de anticuerpos irregulares (detecciones positivas que desembocan en la identificación de uno o varios alo y/o auto-anticuerpos) es del 3,8%. La especificidad sobre un muestreo de pacientes sin seleccionar es del 98,8%. Ciertos antígenos como MNS1(M), MNS2(N), MNS3(S), FY1(Fy a ), FY2(Fy b ) y XG1(Xg a ) se destruyen o se alteran cuando los glóbulos rojos se tratan con enzimas proteolíticas, por tanto, la técnica enzimática no puede 29

10 utilizarse como única técnica para el estudio de anticuerpos irregulares antieritrocitarios. Se ha ensayado la reproducibilidad de la aplicación y ha demostrado unas buenas especificaciones tanto intra como interensayo. 3 - Prueba de compatibilidad La evaluación de las especificaciones ha dado resultados concordantes con el reactivo utilizado como referencia. Cada resultado ha sido comparado con el obtenido en técnica de filtración de gel. Algunas incompatibilidades no se han podido demostrar realizando únicamente esta prueba pero, por el contrario, sí se han observado con la prueba indirecta de la antiglobulina utilizando la técnica ScanGel. Además, ciertos antígenos como MNS1(M), MNS2(N), MNS3(S), FY1(Fy a ), FY2(Fy b ) y XG1(Xg a ) se destruyen o se alteran cuando los glóbulos rojos se tratan con enzimas proteolíticas. Por tanto, la técnica enzimática no puede utilizarse como única técnica para la prueba de compatibilidad. Se ha ensayado la reproducibilidad de la aplicación y ha demostrado unas buenas especificaciones tanto intra como interensayo. LÍMITES Los resultados anormales pueden ser consecuencia de : una contaminación bacteriana o química del suero, del plasma, de los glóbulos rojos o del material. una medicación o un estado patológico del paciente que provoque una reacción cruzada. el uso de un medio de suspensión para los glóbulos rojos diferente al recomendado. una preparación de los glóbulos rojos diferente a la recomendada. una resuspensión incompleta de los glóbulos rojos. una hemólisis de las muestras o de los glóbulos rojos problema. la presencia de fibrina (imagen de un sedimento celular compacto en el fondo de un microtubo acompañado de una fina banda rosada en la zona superior del gel correspondiente a los glóbulos rojos retenidos por los residuos de fibrina). una degradación de la actividad enzimática de la bromelina o de la papaína para las técnicas enzimáticas (no respetar las normas de conservación). contaminación entre microtubos. uso de otro procedimeinto del descrito anteriormente. Con la licencia de DIAMED, S.A., 1785 Cressier-sur-Morat, Suiza. 30

11

12 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2007 Fax.: Code:

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