ÍNDICE DE CONTENIDOS

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1 ÍNDICE DE CONTENIDOS 1. INTRODUCCIÓN Antecedentes generales Antecedentes bibliográficos La vida en ambientes extremos Enzimas activas a bajas temperaturas Aplicaciones biotecnológicas de enzimas activas a bajas temperaturas Enzimas Proteolíticas; proteasas Serina proteasas Aplicaciones industriales de las proteasas Industria de alimentos Industria del cuero Usos médicos Industria del detergente Producción de proteínas recombinantes Expresión recombinante de proteínas criofílicas Descripción del proyecto y justificación Objetivos Objetivo General Objetivos específicos METODOLOGIA Materiales Cepas bacterianas Reactivos Enzimas de restricción Métodos Búsqueda de la secuencia 5 del gen t7 mediante la técnica de Genome Walking Diseño de partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia 5 del gen t Digestión del DNA genómico y elongación Construcción del oligo-adaptador Construcción de la genoteca-adaptador Amplificación del extremo 5 del gen t Secuenciación y análisis del extremos 5 del gen t Diseño de partidores para el clonamiento del gen t7 en los vectores de expresión Amplificación de DNA mediante PCR Purificación de fragmentos amplificados de DNA desde geles de agarosa Ligación en el vector de clonamiento pgem-t Easy Transformación de células electrocompetentes DH5α Digestión de DNA plasmidial y linearización de los vectores de expresión Ligación de los insertos en los vectores de expresión Clonamiento de los constructos en células DH5α... 21

2 Clonamiento de los plasmidios recombinantes en células de E. coli BL21(DE3) y TB Pruebas de actividad proteasa extracelular Expresión recombinante de la proteasa T7 en E. coli Purificación de la proteína recombinante T Electroforesis de proteínas SDS-PAGE Zimograma de proteasas Ensayo de actividad en medio líquido con sustrato específico S-AAPF-pNa Ensayo de actividad en medio líquido con sustrato específico TNBSA RESULTADOS Y DISCUSIÓN Expresión de la proteasa T Búsqueda de la secuencia 5 del gen t7 mediante el método Genome Walking Diseño de partidores para la obtención de la secuencia 5 del gen t Digestión de DNA genómico de la cepa p9/ Construcción del oligo-adaptador y de la genoteca-adaptador Amplificación del extremo 5 del gen que codifica para la proteasa T Análisis de la secuencia aminoacídica de la proteasa T Construcción de plasmidios recombinantes con el gen t Diseño de partidores para el clonamiento del gen t7 en los vectores de expresión Clonamiento del gen t7 en los plasmidios pet22b(+), pmalc2e y pmalp2e Clonamiento de plasmidios recombinantes en células de E. coli BL21(DE3) y TB Pruebas de actividad proteasa extracelular Producción de la proteasa recombinante T7 en E. coli CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS A. Electroforesis de DNA en geles de agarosa B. Purificación de DNA a partir de geles de agarosa C. Ligación en el vector de clonamiento pgem-t Easy D. Transformación de células electrocompetentes E. Minipreparación de DNA plasmidial F. Amplificación de DNA mediante PCR con Elongasa G. PCR de Colonias H. Agar Luria Bertani (100mL) I. Medio Luria Bertani (100mL) J. TB (1000 ml) K. Kphosphate (1000 ml) L. IPTG 0,1 M M. XGal 50 mg/ml N. Carbenicilina 100 mg/ml O. Tampón Binding 10X (1000 ml) P. Tampón de lavado 1X (250 ml)... 59

3 Q. Tampón de elución 1X (100 ml)... 59

4 INDICE DE TABLAS Tabla 1: Reactivos utilizados durante el trabajo de tesis...14 Tabla 2. Enzimas de restricción utilizadas durante el trabajo de tesis...14 Tabla 3: Partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia 5 del gen t Tabla 4: Partidores utilizados para el clonamiento del gen codificante para proteasa INDICE DE FIGURAS Figura 1: Mecanismo general de acción de las serina proteasas...6 Figura 2: Región de clonamiento del vector de expresión pet22b(+)...18 Figura 3: Mapa de restricción del vector de expresión pmal Figura 4: Esquema con las regiones funcionales de T4 y T Figura 5: Análisis electroforético de la expresión de la proteasa T4 en...28 Figura 6: Partidores para la amplificación de la secuencia 5 del gen t Figura 7: Digestión de DNA genómico de la cepa p9/ Figura 8: Adapt-total...32 Figura 9: Diagrama de técnica de genome walking empleada para la obtención de la secuencia 5 del gen t Figura 10: Análisis electroforético de los productos de PCR para la obtención del extremo 5 de t7 utilizando la técnica de genome walking Figura 11: Secuencia aminoacídica de la proteasa T Figura 12: Vectores de clonamiento y expresión...39 Figura 13: Introducción de sitios de restricción en los extremos del gen t Figura 14: PCR de colonias...43 Figura 15: Electroforesis de digestiones de DNA plasmidial con distintas concentraciones de DNA y linearización de vectores de expresión Figura 16: Digestión de plasmidios recombinantes Figura 17: Identificación de clones activos en los sobrenadantes mediante zimograma Figura 18: Ensayo de actividad proteolítica in situ para la proteasa T7...49

5 LISTA DE ABREVIATURAS 1Kpb Marcador de peso molecular 1Kbp Amp Ampicilina DNA Ácido desoxirribonucleico dntps Deoxiribonucleótidos trifosfato DO Densidad óptica E. coli Escherichia coli EDTA Etilendiaminotetraacetato ácido g Fuerza de gravedad gr Gramo gen t7 Gen codificante para la proteína tipo subtilisina T7 h Hora IPTG Isopropil tio-β-d-galactósido kda Kilodalton LB Medio Luria-Bertani M Molar MBP Proteína de unión a Maltosa min Minutos ml Mililitros mm Milimolar ORF Marco de lectura abierto PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida. pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa ph Potencial hidrógeno Proteasa T7 Proteína tipo subtilisina T7 rpm Revoluciones por minuto s Segundos SDS Dodecil sulfato de sodio TEMED N, N, N, N -tetrametiletilendiamina Tris Tris-(hidroximetil)-aminoetano U Unidad enzimática µf Microfaradios UV Radiación ultravioleta V Voltio X-GAL 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido

6 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Antecedentes generales Las principales áreas industriales que tradicionalmente han utilizado enzimas en sus procesos o productos finales son: las empresas de alimentos (alimentos para animales, producción de cervezas, procesamiento de carnes, panadería, quesos, etc.), empresas textiles, empresas de cuero y de detergentes [1]. En general, las nuevas industrias han incorporado el uso de enzimas dentro de sus procesos de producción, puesto que éstas les permiten obtener una mayor eficiencia en el proceso debido a la reducción del consumo de agua, de la emisión de compuestos tóxicos y al ahorro de energía. Esto implica una disminución de costos y del impacto ambiental [2, 3], además de un aumento en la rentabilidad. Las enzimas también se utilizan como componentes de nuevos productos. Por esta misma razón, el mercado para la venta de enzimas con aplicaciones industriales y el desarrollo e investigación de nuevas enzimas, ha crecido enormemente en los últimos años. Una importante aplicación corresponde al uso de enzimas en detergentes, las cuales remueven selectivamente manchas de la ropa de diversos orígenes, reemplazando a los compuestos sintéticos. Sin embargo las enzimas mesófilas utilizadas tienen temperatura óptima de catálisis de alrededor de los 60 C, implicando que esta aplicación requiere de altas temperaturas de lavado para lograr una limpieza óptima [4]. Entre las enzimas manejadas, se encuentran las proteasas, que catalizan la degradación de compuestos de origen proteico, tales como sangre, huevo, cacao o leche. Un tipo de proteasas importante en este ámbito son las subtilisinas, que pertenecen a la familia de las serina proteasas. Teniendo una vasta variedad de nichos y posibles nuevos biocatalizadores, para poder resolver las necesidades específicas del proceso industrial o aplicación, se debe definir el lugar de la naturaleza donde buscar las nuevas enzimas. Obviamente, el nicho específico está determinado por las condiciones definidas por la aplicación industrial. Para el caso de las proteasas activas a baja temperatura con aplicación en detergentes, un buen nicho de búsqueda son los microorganismos encontrados en mares de la Antártica, donde además las condiciones ambientales obligarían a obtener proteasas eficientes a baja temperatura tolerantes a las altas concentraciones salinas [5]. 1

7 Con el objetivo de optimizar el proceso de lavado, se ha invertido en proyectos de investigación en ingeniería genética, para el desarrollo de nuevos detergentes que permitan el lavado eficiente a bajas temperaturas, con el consecuente ahorro energético que esto implica. Para purificar y estudiar proteínas, se requiere aislar células u organismos productores. Estos pueden ser extraídos directamente desde su hábitat o cosechados a partir de cultivos artificiales generados por el hombre, para luego ser procesados y transformados en un producto comercial. Actualmente se está estudiando el comportamiento, función y actividad de proteínas extraídas de microorganismos extremófilos, para posibles usos en productos que resulten ser más eficientes. Hoy en día, la expresión recombinante representa un paso esencial en la producción de enzimas industriales. Mediante este método es posible producir enzimas de microorganismos de forma eficiente en bioreactores, de manera que el espectro de posibles biocatalizadores para la utilización en la industria se amplía gracias a la tecnología de DNA recombinante Antecedentes bibliográficos La vida en ambientes extremos A pesar de que existen numerosas enzimas capaces de catalizar diferentes reacciones, pocas se adecuan a las condiciones presentes en la industria. Es por esto que los microorganismos que viven en condiciones extremas (extremófilos) han despertado gran interés como posibles fuentes de nuevas enzimas que funcionen bajo las condiciones requeridas. En especial, se tiene interés por los organismos extremófilos psicrófilos. Estos habitan los ambientes más fríos de la Tierra, que incluyen las regiones polares, altas montañas, glaciares, profundidades oceánicas, superficies de sistemas subterráneos (cuevas), atmósfera alta, electrodomésticos refrigerados y superficies de animales y plantas que viven en ambientes fríos, donde las temperaturas nunca exceden los 5 C [6,7] Enzimas activas a bajas temperaturas La temperatura es uno de los factores medio ambientales más importantes para la vida, ya que ésta influencia directamente los procesos celulares. 2

8 Vivir a temperaturas cercanas a los 0 ºC requiere de múltiples adaptaciones cruciales, que incluyen arreglos bioquímicos a nivel molecular (síntesis de moléculas especiales), subcelular (regulación de canales iónicos) y de la fisiología completa del organismo (vías metabólicas). Entre las adaptaciones se encuentra la necesidad de preservar la estabilidad y la permeabilidad de la membrana y de mantener las actividades enzimáticas a niveles apropiados. Debido a esto, los organismos psicrófilos han desarrollado mecanismos adaptativos para llevar a cabo sus funciones metabólicas a bajas temperaturas incorporando características únicas en sus proteínas y membranas [7,8]. Las enzimas adaptadas a bajas temperaturas se caracterizan por tener una alta actividad específica a bajas temperaturas y, como consecuencia, una rápida inactivación a temperaturas moderadamente altas [9]. Las bajas temperaturas inhiben fuertemente la velocidad de las reacciones químicas, cualquier disminución en la temperatura inducirá una reducción exponencial en la velocidad de la reacción. A pesar de esto, los organismos psicrófilos son capaces de mantener una apropiada velocidad de sus reacciones bioquímicas debido a flexibilidad estructural de sus enzimas. El aumento en la flexibilidad estructural probablemente facilitaría los cambios conformacionales, resultando en una disminución de la energía requerida para la catálisis a bajas temperaturas, proveyendo así una mayor eficiencia enzimática [6,8]. Una consecuencia esperada del aumento de la flexibilidad es la reducción en la estabilidad térmica [10] Aplicaciones biotecnológicas de enzimas activas a bajas temperaturas La capacidad de las enzimas psicrófilas para catalizar reacciones a bajas o moderadas temperaturas, ofrece un gran potencial para ciertas aplicaciones industriales y biotecnológicas [6,8]. Uno de los principales intereses en estas enzimas consiste en su uso como parte la composición de detergentes. Esto debido a que se hace innecesaria la aplicación de energía calórica para lograr niveles de actividad suficientes para efectuar el proceso de lavado eficientemente, lo que trae como consecuencia beneficios económicos debido al ahorro energético. Algunos ejemplos de estos beneficios biotecnológicos se dan en la industria alimenticia, donde el uso de enzimas adaptadas a bajas temperaturas permitiría la obtención de productos a temperaturas donde el crecimiento microbiano es mínimo y su uso entregaría mejores alternativas en la fermentación, manufactura de quesos, panaderías y ablandamiento de carnes. Por otro lado, los organismos adaptados al frío tienen un gran potencial en la aplicación de procesos de biorremediación, como por ejemplo, en el compostaje y la biodegradación de aceites o xenobióticos [9,10]. 3

9 Enzimas Proteolíticas; proteasas Los microorganismos tienen una amplia gama de proteasas, tanto intra como extracelulares. Las intracelulares participan en diversos procesos celulares y metabólicos, como por ejemplo: esporulación, diferenciación, recambio de proteínas, maduración de enzimas y hormonas. Las proteasas extracelulares son importantes para la hidrólisis de proteínas en el medio externo, de esta manera las células pueden absorber y utilizar los productos de las hidrólisis como nutrientes. En relación a los sustratos proteolíticos, las proteasas se clasifican en dos tipos: endopeptidasas, que hidrolizan enlaces peptídicos a lo largo de la toda la cadena y exopeptidasas, las que tienen preferencia por los extremos amino- (aminopeptidasas) o carboxilo- (carboxipeptidasas). La clasificación de las proteasas se hace en base a los aminoácidos presentes en el sitio activo, el cual determina el mecanismo químico de la reacción enzimática [11]. Estas clases son: a) Serina proteasas (Asp, Ser, His): El grupo más representativo de estas proteasas microbianas son las subtilisinas. Esta clase se caracteriza por tener una serina como el aminoácido principal en el sitio catalítico. b) Cisteina proteasas (Cys, His, Asp): Se caracteriza por tener un residuo de cisteina como el principal componente del sitio activo. c) Aspartato proteasas (Asp, Asp): Estas presentan una estructura bilobular, con el sitio catalítico ubicado entre los dos lóbulos, cada uno de los cuales contribuye con un residuo de aspartato como aminoácido principal en la catálisis. d) Metaloproteasas (Zn, Glu, Try): Esta clase difiere mucho entre sí en su secuencia y estructura, pero en general contienen un átomo de zinc, cobalto o níquel catalíticamente activo. 4

10 Serina proteasas Las serina proteasas son consideradas importantes debido a su actividad y estabilidad a ph alcalino, condiciones comúnmente halladas en la industria. El mecanismo de acción de estas enzimas está muy bien caracterizado. Tienen un residuo de serina en el sitio activo, encargado del ataque nucleofílico sobre el sustrato. Además, tienen dos residuos adicionales esenciales para su actividad, aspartato e histidina. La triada catalítica forma el sitio activo. La reacción comienza con la polarización del grupo imidazol de la histidina, por acción del grupo carboxilo del aspartato (Figura 1) [12]. De esta forma, la histidina actúa como base y atrae al protón del grupo OH de la serina. En ese momento el oxígeno de la serina actúa como un nucleófilo para atacar el grupo carbonilo del enlace peptídico que será cortado. Se disocia el doble enlace del grupo carbonilo al arrastrar los electrones hacia el oxígeno de la serina, para formar el intermediario tetraédrico (Figura 1, cuadro 1.1). Con este cambio, el enlace peptídico se rompe mediante la transferencia de los electrones hacia el protón del grupo amino de la histidina, el cual actúa como un ácido, finalizando el paso de acetilación (formación del intermediario acilenzima) (Figura 1, cuadro 1.2). El siguiente paso es nuevamente catalizado por la acción base de la histidina, la que atrae un protón desde el agua para que este actúe como un nucleófilo que ataca el enlace éster que forma la acil-enzima (Figura 1, cuadro1.3). El último paso involucra la recuperación del hidrógeno de la serina desde la histidina y el rompimiento del enlace éster (Figura 1, cuadro 1.4). La función del ácido aspártico es polarizar la histidina para que ésta actúe como base o ácido que ayuda en los procesos de acetilación y desacetilación, mientras la serina se une covalentemente al péptido sustrato para que la reacción ocurra. 5

11 Ataque Nucleofílico Sustrato polipeptídico Complejo de Michaelis Intermediario Tetraédrico Acil-enzima Ataque Nucliofilico H 2 O Intermediario 3 Tetraédrico 4 Figura 1: Mecanismo general de acción de las serina proteasas. En el esquema se indican los pasos involucrados en la catálisis enzimática de las serina proteasas: (1.1) unión del sustrato; (1.2) formación del intermediario tetraédrico; (1.3) formación de intermediario covalente y (1.4) liberación del producto final y regeneración del catalizador Aplicaciones industriales de las proteasas Las proteasas abarcan hasta el 40 % de las ventas totales de enzimas en el mercado, distribuyéndose en diferentes sectores industriales; como por ejemplo en detergentes, procesamiento de alimentos, farmacéutico, cueros, diagnósticos, tratamiento de desechos y recuperación de plata. Las más apetecidas en el mercado de enzimas son las proteasas alcalinas para aplicación en detergentes. Estas son estables y activas a ph dentro de los rangos alcalinos, condición necesaria para la aplicación en detergentes. 6

12 El éxito de las enzimas en detergentes llevó al desarrollo de distintas proteasas con otras aplicaciones técnicas más específicas: limpieza de sistemas de membranas, limpieza de elementos quirúrgicos, limpiadores ópticos, limpiadores de lentes de contacto, control de pestes, desgomado de seda, deslignificación selectiva de cáñamo, etc. [13]. Todas obtuvieron éxito comercial Industria de alimentos En la industria de alimentos se utilizan distintos tipos de proteasas, como la quimosina en la elaboración de quesos [1]. Esta es una proteasa aspártica que se extrae del cuajo de bovinos, conocida comercialmente con el nombre de renina. En el caso de la elaboración de carnes en conserva se requiere de proteasas neutras o alcalinas que remuevan la carne adherida a los huesos. En el ablandamiento de carnes es utilizada la papaína, cisteina proteasa proveniente de la papaya [14]. También se utilizan proteasas para incrementar la solubilización y mejorar del sabor y olor de ciertos alimentos Industria del cuero El reemplazo de métodos convencionales para el procesamiento de cueros, por tratamientos bioquímicos, ha permitido mejorar el control del proceso del cuero. Por ejemplo, se alcanza una mayor velocidad en el tratamiento, así como menores niveles de contaminación ambiental, y una reducción de los desechos. El proceso de depilación de los cueros fue mejorado gracias al uso de proteasas alcalinas con actividad elastolítica y keratinolíticas, debido a que permiten la exposición de las raíces de los pelos con la consecuente facilidad de desprendimiento. Otros procesos como el de ablandamiento del cuero también fueron mejorados mediante la utilización de proteasas en condiciones alcalinas, que degradan las proteínas interfibrilares presentes en éste. 7

13 Usos médicos Las proteasas han sido utilizadas principalmente en la remoción de tejido necrótico producido por quemaduras, ulceraciones y heridas. Se ha comprobado que enzimas proteolíticas provocan una licuefacción selectiva de células y tejido muerto, así como disolución de costras de sangre facilitando el drenaje y acelerando la granulación y re-epitelización de la herida, con una disminución en el tiempo de cicatrización [15]. Para la desinflamación de tejidos se recurre a tripsinas, que disuelven coágulos de sangre y precipitados de proteínas extracelulares [16]. Estas también son usadas en el procesamiento de proteínas bio-farmacéuticas, como en la producción de insulina a partir de pro insulina, descrita por Klemer W. et al (1971) Industria del detergente La tendencia del mercado y la necesidad de los consumidores han tenido gran influencia en el desarrollo de nuevas enzimas para detergentes. Además de proteasas, estos poseen lipasas, que ayudan en la hidrólisis de lípidos en la interfase lípido agua; amilasas, que aceleran la degradación de los residuos de almidón en alimentos como papa y chocolate, y celulasas, que facilitan la remoción de suciedad y restauran la suavidad y color de las fibras de algodón [17]. Las proteasas han sido por largo tiempo tema de mucho interés para la industria de los detergentes, debido a la habilidad de estas para remover manchas proteicas de forma mucho más eficiente que los compuestos convencionalmente utilizados. Se ha puesto mucho énfasis en la utilización de nuevas enzimas que mejoren los rendimientos del lavado y que sean compatibles con los otros componentes del detergente. El éxito comercial de las subtilisinas como aditivos en detergentes, se debe principalmente a su alta estabilidad y baja especificidad de sustrato, además de ser secretada extracelularmente en grandes cantidades por las especies de Bacillus, lo que facilita en gran medida su obtención y purificación [18]. El incrementado uso de fibras sintéticas que no toleran el lavado a altas temperaturas ha llevado al uso frecuente del lavado a bajas temperaturas. Esto ha obligado a los manufactureros de detergente a buscar nuevas enzimas que tengan mejor desempeño a bajas temperaturas. En 1998, Novo Nordisk desarrolló para el mercado japonés, una proteasa para detergentes llamada Kannasa, que tiene una buena eficiencia incluso a 15 C. 8

14 Producción de proteínas recombinantes Entre los sistemas biológicos heterólogos para la producción de proteínas recombinantes más utilizados se encuentran: bacterias (como E. coli y B. subtilis), levaduras (como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris), y células eucariontes (cultivos animales, células de insectos en cultivo y plantas). La elección de un sistema de expresión para un alto nivel de producción de proteínas recombinantes depende de muchos factores. Éstos incluyen características del crecimiento de la célula, niveles de expresión, la localización final de la proteína expresada, modificaciones posttraduccionales, y la actividad biológica de la proteína de interés [19]. E. coli ofrece los medios para la producción rápida y económica de proteínas recombinantes. Estas ventajas permiten que E. coli siga siendo un organismo valioso para el alto nivel de producción de las proteínas recombinantes [20,21]. Las bacterias producen proteínas recombinantes por medio de plasmidios. Entre las propiedades de los plasmidios se incluyen (1) su pequeño tamaño, que hace que este DNA sea fácil de aislar y de manipular; (2) que son DNA circular, lo que hace que el DNA sea más estable durante su aislamiento químico; (3) su origen de replicación independiente, de manera que la replicación del plasmidio en la célula transcurre independientemente del control directo del cromosoma; (4) su múltiple número de copias, de manera que en la célula pueden estar presentes en numerosas copias, aumentando los niveles de expresión de la proteína de interés; (5) la presencia de marcadores seleccionables, tales como genes de resistencia a antibióticos, haciendo posible la detección y selección de los clones que contienen plasmidios [22]. El nivel de expresión del gen que codifica la proteína de interés depende, en parte, del promotor que éste posea río arriba. Para aumentar la eficiencia transcripcional, los plasmidios cuentan con promotores con las siguientes características: (1) fuerte, es decir, con una alta afinidad por la RNA polimerasa, lo que implica un inicio frecuente de la transcripción; (2) que permita generar niveles intermedios de expresión y (3) regulado, es decir, que el investigador pueda controlar cuándo el gen es expresado utilizando inductores y/o co-represores. El promotor debe ser regulado ya que la sobreexpresión de una proteína impone un estrés metabólico a las células, bajando la velocidad de crecimiento. Algunas proteínas recombinantes pueden ser tóxicas para las bacterias, por lo que se requiere separar la fase de crecimiento de las células huéspedes de la fase de expresión del gen heterólogo [23]. 9

15 Expresión recombinante de proteínas criofílicas Las formas recombinantes de varias enzimas bacterianas adaptadas al frío han sido exitosamente expresadas en microorganismos [24 27]. Por ejemplo, la enzima uracil-dna glicosilasa del bacalao atlántico adaptada al frío fue recientemente expresada de forma activa en E. coli [28]. Más aún, la forma precursora de la tripsina I recombinante del bacalao atlántico, fue expresada en un sistema de expresión E. coli His-Patch ThioFusion y puriwed [29]. Todos los cdnas de tripsinas del grupo III han sido aislados de especies de peces que pasan parte de su vida en ambientes muy fríos, a 0 C o a temperaturas más bajas. Hoy, ninguno de los polipéptidos de tripsinas del grupo III ha sido aislado desde sus fuentes nativas. Por lo tanto su caracterización ha sido principalmente basada en el análisis de las sucesiones de cdna que codifican las enzimas, así como en el análisis bioquímico de la tripsina Y recombinante producida en P. pastoris [30]. También se han logrado expresar subtilisinas criofílicas recombinantes, aunque hay pocos reportes en la literatura. Un ejemplo es la expresión de una subtilisina criofílica de la antártica en Bacillus [31], otra expresión exitosa se realizó con una serina proteasa tipo subtilisina en E. coli [26]. Es por esto que la producción de una subtilisina criofílica recombinante representa un gran desafío. 10

16 1.3. Descripción del proyecto y justificación Este proyecto encuentra justificación en la necesidad de dar una solución al problema del gasto evitable de energía para lavar ropa, de manera que las enzimas psicrofílicas puedan ser utilizadas como materia prima para eliminar manchas. Esto presenta un importante interés comercial en la actualidad, por lo que la producción de una proteasa recombinante activa, corresponde al primer y fundamental paso que permita avanzar hacia la generación de una herramienta tecnológica con el objetivo solucionar esta inquietud. La búsqueda y desarrollo de nuevas enzimas para una aplicación industrial se basa en tres parámetros principales [32]: 1) La eficiencia que tiene la enzima en su aplicación 2) Producción segura y económica de la proteína 3) Patentabilidad de la proteína o aplicación Este trabajo está enfocando en parte del primer punto, es decir, en la expresión de enzimas descubiertas desde la naturaleza. Luego de la selección de enzimas (mediante ensayos de actividad compatibles con las aplicaciones requeridas), siguen las etapas de clonamiento, expresión, purificación y caracterización de las enzimas para que los mejores candidatos sean probados a escalas mayores. Recientemente, en el CIByB (Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología) se han aislado microorganismos psicrófilos (bacterias) de la antártica y se ha determinado que las proteínas que secretan tienen una alta actividad a bajas temperaturas. Particularmente se aislaron proteínas del tipo subtilisina desde distintas cepas de Polarisbacter sp. de origen marino antártico. Entre éstas proteínas se encuentran las denominadas T4 y T7. Se espera que alguna de estas proteasas de origen antártico favorezca el desarrollo de detergentes con las propiedades descritas anteriormente. Para esto, es necesario expresar estas enzimas de manera recombinante, con el objeto de facilitar su posterior producción a mayor escala. El trabajo que se presenta a continuación se enmarca dentro de la secuenciación del gen de una subtilisina criofílica, para luego ser clonado en vectores de expresión y transformados en un organismo adaptado para la expresión de grandes cantidades de proteína recombinante, y poder así tener una gran cantidad de enzima pura. Con esta enzima purificada se puede evaluar su desempeño en la aplicación. 11

17 Las técnicas a utilizar con dicho fin serán: la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) para encontrar la secuencia del gen completo, también para posibilitar su inserción en los dos vectores de expresión a utilizar; el clonamiento en cepas de E. coli y la inducción de la expresión mediante IPTG, según protocolos para cada vector de expresión a utilizar Objetivos Objetivo General El objetivo general del Trabajo de Memoria de Título es: producir una enzima tipo subtilisina criofílica recombinante, en forma activa en Escherichia coli, a partir de un gen de una bacteria de origen marino antártico Objetivos específicos Aislar el gen completo de una proteasa mediante un método de genome walking. Analizar la secuencia aminoacídica realizando estudios comparativos con otras proteasas. Clonar y expresar de forma recombinante los genes codificantes para las proteasas T4 y T7. 12

18 2. METODOLOGIA En este capítulo se presentan cada uno de los pasos seguidos con el fin de obtener una subtilisina recombinante activa Materiales Cepas bacterianas E.coli cepa DH5α, genotipo: F - Φ80dlacΔM15 Δ(lacaya-argF) U169 reca1 enda1 hsdr178r k -,m k + ) phoa supe44 λ - thi-1 gyra96 rela1. E. coli BL21(D3E), genotipo: F - ompt hsds B (r B - m B + ) gal dcm (DE3). E. coli TB1, genotipo: F - araδ(lac-proab)[φ80dlacδ(lacz)m15] rpsl(str R ) thi hsdr Reactivos Los reactivos utilizados durante el trabajo de tesis y el laboratorio proveedor se detallan en la Tabla 1. 13

19 Tabla 1: Reactivos utilizados durante el trabajo de tesis. Reactivos Enzimas de restricción NdeI, PvuII, XhoI, y XbaI. Taq DNA polimerasa, pgem-t Easy. T4 DNA ligasa, Elongasa, estándar de tamaño molecular 1 Kb, dntps, cepa E. coli DH5α. X-GAL, IPTG. Laboratorio Promega (WI-USA) Invitrogen (CA-USA) Sigma (MO-USA) El estándar de tamaño molecular preteñido de proteínas, enzimas de restricción NcoI, KpnI. Triptona, extracto de levadura, medio LB, agar. pmal-c/p2e, cepa E. coli TB1. pet22b(+), cepa E. coli BL21(D3E). Los sistemas de purificación de productos de PCR, de DNA plasmidial y de extracción de DNA desde geles de agarosa. Resina Ni-NTA. Tris, SDS, Glicerol. Cloruro de sodio. Agarosa. El resto de las sales, ácidos, bases, bromuro de etidio y solventes de grado analítico o de biología molecular. Fermentas Disco (DT- USA) New England Biolabs (MA-USA) Novagen, Madison (WI-USA) Qiagen Winkler J.T Backer Fermelo Merk Enzimas de restricción La mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en esta tesis producen cortes de tipo cohesivos, excepto PvuII y EcoRV que producen cortes romos (Tabla 2). Tabla 2. Enzimas de restricción utilizadas durante el trabajo de tesis. Enzima Sitio de reconocimiento (5 3 ) NcoI CCATGG XhoI CTCGAG KpnI GGTACC XbaI TCTAGA EcoRV GATATC PvuII CAGCTG 14

20 2.2. Métodos Búsqueda de la secuencia 5 del gen t7 mediante la técnica de Genome Walking La técnica denominada genome walking consiste en la amplificación de secuencias desconocidas de DNA genómico, adyacentes a secuencias ya conocidas [33]. Esta técnica consta de 5 etapas: Diseño de partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia río arriba del gen de proteasa. Digestión del DNA genómico con la enzima de restricción deseada y luego elongación de los fragmentos producidos, mediante el uso de la Taq DNA polimerasa que agrega una adenina a los extremos 3 de cada fragmento. Construcción de un oligo-adaptador de doble hebra que contiene una timidina no apareada en un extremo 3. Ligación del oligo-adaptador con los fragmentos de DNA generando así una genotecaadaptador. Amplificación del gen completo. Estos pasos se detallan en la Figura 9 en Resultados Diseño de partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia 5 del gen t7 Se dispone de la secuencia del extremo 3 del gen codificante para la proteasa T7 (gen t7). Por otra parte, se realizó un alineamiento múltiple con las secuencias de subtilisinas conocidas, revelándose la existencia de una región conservada en la fracción central de los homólogos. Con el fin de encontrar la secuencia del extremo 5 del gen en cuestión, se utilizó la técnica de genome walking estandarizada en el laboratorio del CIByB. Para esto se diseñaron partidores y adaptadores específicos a partir del fragmento central conservado (Tabla 3 en Resultados). 15

21 Digestión del DNA genómico y elongación Se digirió el DNA genómico de la cepa p9/2-10 aislada en el laboratorio (que contiene el gen t7), con las enzimas de restricción PvuII y EcoRV y los tampones recomendados por el proveedor. La reacción se efectuó en un volumen final de 20 µl que contenía 1 µg de DNA previamente purificado, 2 µl de tampón 10X y 1,5 µl de enzima. El resto del volumen se completó con agua Milli-Q estéril. La mezcla se incubó a 37 C por 3 h. Para extender los extremos 3 de los fragmentos de DNA y agregar una adenina desapareada, fueron incubados 500 ng del DNA previamente digerido y purificado con 5 unidades de Taq DNA polimerasa, 1 µl de 10 mm dntps y 5 µl de tampón Taq 10X en un volumen total de 50 µl. Se incubó a 70 C por 45 min Construcción del oligo-adaptador Se construyó un oligo-adaptador de doble hebra que contiene 6 sitios de restricción, hibridizando los oligonucleótidos AdaptS y AdaptA no fosforilados. El oligo-adaptador se denominó Adapt-total y posee una timidina no apareada en uno de sus extremos 3 (Figura 8 en Resultados). La hibridización o alineamiento de los dos partidores se realizó calentando 3 minutos a 95 ºC una solución 10 µm de cada oligonucleótido, seguido de un enfriamiento lento hasta alcanzar la temperatura ambiente Construcción de la genoteca-adaptador Para la construcción de la genoteca-adaptador, que corresponde al DNA digerido unido al oligo-adaptador en sus extremos, se hizo una mezcla de ligación. Se tomaron 7 µl de la mezcla de fracciones de DNA polimerizado con una adenina no apareada en el extremo 3` y se mezclaron con 15 pmoles del adaptador Adapt-total, para realizar la reacción de ligación con una unidad de T4 DNA ligasa (Invitrogen (CA-USA)) y 2 µl del tampón de ligación 5X en un volumen de 10 µl de reacción. Esta reacción se incubó a 16 ºC por 16 h. 16

22 Amplificación del extremo 5 del gen t7 La reacción de amplificación fue realizada en un volumen de 50 µl en presencia de tampón elongasa 1X (Invitrogen (CA-USA)), donde la concentración final de los reactivos fue: 1.9 mm MgCl2, 0.2 mm dntps y 0.5 µm del primer partidor específico T7A1 diseñado a partir de la secuencia conocida del gen blanco (Tabla 3). Luego se agregó 5 µl de la genoteca-adaptador diluida 10 veces y 1 µl de Elongasa. El programa de PCR utilizado fue el siguiente: 1 min a 94 C, 20 ciclos (32 s a 94 C y 5 min a 68 C), finalmente 7 min a 70 C. Las reacciones fueron llevadas a cabo en el termociclador Eppendorf MasterCycler Gradient. Los productos de PCR fueron diluidos 10 veces para ser utilizados como templado en la segunda ronda de PCR, que busca amplificar el extremo 5 del gen de proteasa T7. En este PCR, se utilizó como partidor sentido AdapS2, que fue diseñado a partir de la secuencia del oligoadaptador Adapt-total, y como partidor antisentido T7A2 (diseñado a partir de la secuencia conocida del gen blanco, río abajo de T7A1). La segunda reacción de amplificación fue hecha en un volumen total de 50 µl de tampón elongasa 1X, donde la concentración final de los reactivos fue: 1.9 mm MgCl2, 0.2 mm dntps, 0.5 µm del segundo partidor específico T7A2, 0.2 µm del partidor específico para el oligoadaptador AdaptF2, 3 µl del producto de PCR diluido de la primera ronda y 1 µl de Elongasa. Las condiciones de los ciclos térmicos del PCR fueron: 1 ciclo por 1 min a 94 C, 35 ciclos (32 s a 94 C y 5 min a 68 C), finalmente 7 min a 70 C. El fragmento amplificado fue sometido a electroforesis en un gel de agarosa 0,8% (Anexo A), y posteriormente purificado desde éste (Anexo B), para ser ligado al vector de clonamiento pgem-t Easy (Anexo C). Con la construcción se transformó E. coli DH5α (Anexo D). Luego se realizó una minipreparación de los transformados (Anexo E) para secuenciar el producto de ligación Secuenciación y análisis del extremos 5 del gen t7 El DNA plasmidial se mandó a secuenciar a Macrogen S.A. (Corea). La secuencia se analizó comparándola con otras secuencias mediante los algoritmos BLASTn, BLASTp y BLASTx ( que comparan la secuencia nucleotídica, aminoacídica y la secuencia nucleotídica traducida en todos sus marcos de lectura respectivamente [12]. 17

23 Diseño de partidores para el clonamiento del gen t7 en los vectores de expresión Para poder insertar el gen de la proteasa T7 en los vectores de expresión pet22b(+), pmalc2e y pmalp2e se realizó PCR sobre el DNA genómico, utilizando partidores que agregan sitios de restricción para determinadas enzimas. Estos mismos sitios de restricción se encuentran en el sitio de clonamiento múltiple (MCS) de los plasmidios. Se diseñaron partidores para realizar cuatro construcciones de vectores recombinantes, dos de ellas con el gen en el vector de expresión pet22b(+) con distintos sitios de restricción, una con el vector pmalc2e (la proteína queda en el citoplasma) y otra con el vector pmalp2e, que tiene señal de exportación a periplasma. Estas dos últimas construcciones solo difieren en el vector, el inserto con sitios de restricción utilizado es el mismo. Para insertar el gen en el vector pet22b(+) se consideraron las siguientes dos opciones: 1. Una construcción que incluye los sitios de restricción NcoI y XhoI en el gen t7. Para esto se diseñaron los partidores petncois y petxhoia respectivamente ( Figura 2). 2. Una construcción que incluye los sitios de restricción NcoI y XhoI en el gen t7. Para esto se diseñaron los partidores petncois y petshxhoia respectivamente. El partidor petshxhoia contiene un sitio de término de la transcripción antes de la secuencia de corte para XhoI. Figura 2: Región de clonamiento del vector de expresión pet22b(+). Mapa de clonamiento del vector de expresión pet22b(+). Para la opción 1 y 2 se utilizaron los sitios de corte NcoI y XhoI para dejar el gen unido al péptido de exportación del vector. 18

24 Para clonar en los sistemas de expresión pmalc2e y pmalp2e, se diseñaron los partidores pmalt7s y pmalt7a con sitios de restricción para KpnI y XbaI, respectivamente. Estos sitios de restricción proporcionaron los extremos requeridos para clonar el gen finalmente en los vectores antes mencionados (Figura 3). Figura 3: Mapa de restricción del vector de expresión pmal. Se utilizaron las enzimas de restricción KpnI y XbaI para insertar el gen t7 en los vectores de expresión pmalc2e y pmalp2e Amplificación de DNA mediante PCR Los partidores se usaron a una concentración de 10 pmol/µl y se realizaron amplificaciones del DNA genómico mediante PCR, utilizando Elongasa (Elongase Enzyme) (ver Anexo F) en lugar de Taq DNA polimerasa ya que la Elongasa es capaz de amplificar fragmentos de mayor tamaño que la Taq, además de cometer menos errores durante la amplificación. Agrega una base de adenina al extremo 3`, permitiendo la posterior ligación al vector de clonamiento pgem-t. De esta manera el gen quedó con los extremos requeridos (con sitios de corte para enzimas de restricción) para ser clonados finalmente en los vectores de expresión Purificación de fragmentos amplificados de DNA desde geles de agarosa Los productos de PCR fueron cargados en un gel de agarosa 0,8% y sometidos a electroforesis para separar los fragmentos deseados. Con el fin de purificar estos fragmentos de DNA, se cortó la banda desde el gel y se purificó con el sistema QIAEX II Gel Extraction, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 19

25 Ligación en el vector de clonamiento pgem-t Easy Para obtener un mayor número de copias del vector con el inserto, y para facilitar estéricamente el corte por parte de las enzimas de restricción, se utilizó el sistema pgem -T Easy, como vector de clonamiento. La mezcla de reacción se realizó en un volumen final de 10 µl y contenía 5 µl de tampón de ligación 2X, 50 ng de vector pgem-t Easy, 3,5 µl de fragmentos de DNA purificado y 1 unidad de enzima T4-DNA ligasa. Se dejó ligando por 16 h a 37 ºC. Los distintos vectores se denominaron pgem-t7ncoi, pgem-t7ncoish y pgem-t7kpni Transformación de células electrocompetentes DH5α Los productos de ligación pgem-t7ncoi, pgem-t7ncoish y pgem-t7kpni fueron transformados en células electrocompetentes E.coli DH5α. Las células electroporadas se sembraron en placas LB agar (ver Anexo H) con carbenicilina [0,1 mg/ml], X-GAL [80ng/mL] e IPTG [0.5mM], luego se dejaron incubando a 37 ºC toda la noche en un agitador orbital (Max Q 4000, Equilab). Posteriormente se utilizó Taq DNA polimerasa para realizar un PCR de colonias (ver Anexo G). De acuerdo a los resultados, se seleccionó una colonia positiva (con inserto), correspondiente a la de mayor concentración de producto de PCR. Esta se inoculó en 4mL de medio LB estéril (ver Anexo I) con carbenicilina [0,1 mg/ml] y se dejó creciendo durante toda la noche a 37 ºC. Luego se extrajo el DNA plasmidial, mediante una minipreparación Digestión de DNA plasmidial y linearización de los vectores de expresión Los plasmidios pgem-t7ncoi y pgem-t7ncoish fueron digeridos con las enzimas NcoI y XhoI. El plasmidio pgem-t7kpni fue digerido con los pares de enzimas KpnI y XbaI. Con la finalidad de ligar cada fragmento con su respectivo vector de expresión, estos fueron digeridos con las mismas enzimas de restricción, es decir, pet22b(+) con los pares de enzimas NcoI y XhoI, pmalc2e y pmalp2e con KpnI y XbaI. 20

26 Las reacciones finales de digestión contenían 2 µl de tampón 5X recomendado por New England Biolabs para digestiones dobles, 1 µl de cada enzima y 100 ng de vector pgem T-Easy con inserto. Para el caso de la linearización, se utilizaron 500 ng de los vectores de expresión. Las mezclas se llevaron al volumen final de 20 µl con agua Milli-Q estéril. Las digestiones se dejaron reaccionando durante 16 h a 37 ºC y el resultado se analizó mediante un gel de agarosa 0,8%. Se cortaron las bandas correspondientes al inserto en el caso de pgem-t, y las de los vectores linearizados. Se purificaron con el Kit de purificación de DNA QIAEX II Gel Extraction según instrucciones del fabricante Ligación de los insertos en los vectores de expresión Las reacciones de ligación se realizaron en un volumen final de 10 µl en una mezcla que contenía 100 ng de vector digerido, 300 ng de inserto digerido con las mismas enzimas de restricción, tampón T4 DNA ligasa 5X (Tris/HCl 250 mm ph 7,6, MgCl 2 50 mm, ATP 5 mm, DTT 5 mm, polietilénglicol % p/v) y 1 µl de T4 DNA ligasa [2.500U/mL]. La mezcla de reacción se dejó a 16 ºC por 16 h. Los plasmidios producto de las reacciones de ligación se denominaron pet-ncoi, pet- NcoISH, pmalc T7 y pmalc T Clonamiento de los constructos en células DH5α Con el fin de obtener un mayor número de copias, los vectores pet-ncoi, pet-ncoish, pmalc T7 y pmalc T7 fueron clonados en células electrocompetentes DH5α, para lo cual fueron transformadas por electroporación 20µL de células de E.coli DH5α con 1µL de plasmidio [0,2µg/mL], y posteriormente sembradas en placas LB agar y carbenicilina [0,1mg/mL]. Se dejaron incubando toda la noche a 37 ºC. Las placas se sacaron de la incubadora y se guardaron a 4 ºC para que las colonias no siguieran creciendo (comienzan a aparecer colonias satélites). Luego se realizó un PCR de colonias usando los partidores correspondientes a cada inserto, seguido de una electroforesis de DNA en gel de agarosa 0,8% para verificar la presencia de estos. 21

27 Se identificaron las colonias con el inserto del tamaño esperado, se eligió una en cada caso y se dejaron creciendo a 37 ºC toda la noche en 4 ml medio LB y carbenicilina [0,1 mg/ml] a 200 rpm. Luego se extrajo el DNA plasmidial mediante una minipreparación, con el método QIAprep Spin Miniprep Kit using a Microcentrifuge Clonamiento de los plasmidios recombinantes en células de E. coli BL21(DE3) y TB1 Se transformaron células competentes E.coli BL21(DE3) y TB1 adquiridas en MoBiTec, con los vectores pet-ncoi y pet-ncoish en las primeras y pmalc T7 y pmalc T7 en las segundas. Se eligió una colonia y se dejó creciendo a 37 ºC toda la noche en 4 ml medio LB y carbenicilina a una concentración de 0,1 mg/ml. A 900 µl de cada cultivo se agregó 100 µl de glicerol 80%. Los tubos se guardaron a -80 ºC. Con el cultivo sobrante se hizo una minipreparación para obtener DNA plasmidial, con el método QIAprep Spin Miniprep Kit using a Microcentrifuge. Para verificar la presencia y correcta ligación de los insertos en los plasmidios, se realizó una digestión de éstos con las respectivas enzimas de restricción como se indica en la sección Pruebas de actividad proteasa extracelular Del PCR de colonias realizado luego de la clonación de los vectores de expresión en E. coli DH5α, se eligieron 3 de cada constructo, se sembraron en placas de Skim Milk (SM) Agar con IPTG y luego se incubaron durante la noche a 37 ºC. Para hacer las placas se mezcló: 1 gr de leche descremada en polvo, 0,1 gr de extracto de levadura y 1,5 gr de agar. La mezcla se llevó a 100mL con H 2 O (HPLC), se autoclavó, se dejó enfriar y se agregó IPTG a una concentración 0,5 mm. 22

28 Expresión recombinante de la proteasa T7 en E. coli El gen codificante para proteasa, se expresó en células E. coli BL21(DE3) electrocompetentes previamente transformadas con los vectores recombinantes pet-ncoi y pet- NcoISH. Para inducir la expresión del gen en pet22b(+), se procedió según lo recomendado por el manual del sistema pet. Así, se inocularon 4 ml de medio LB más carbenicilina con una colonia de células BL21(DE3), lo mismo para otra colonia control con plasmidio sin inserto. Los inóculos se dejaron creciendo a 37 ºC con agitación de 200 rpm por 16 h. Al día siguiente se midió la densidad óptica a 600 nm (DO 600 ) y se determinó el volumen necesario para inocular 250 ml de medio LB estéril más carbenicilina con el cultivo de noche para una DO 600 inicial de 0,05 nm. El cultivo se creció con agitación a 37 ºC hasta alcanzar una DO 600 de 0,6 en aproximadamente 2 h. Se tomó una muestra de 1 ml, se centrifugó (centrífuga Eppendorf 5403 de Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) y el precipitado se resuspendió en 10 µl de tampón SDS-PAGE 5X para luego guardarlo a -20 ºC (muestra1: células sin inducir). El resto del cultivo de células se enfrió en hielo durante 5 min y se centrifugó en una botella esterilizada por autoclave a g v durante 5 min (centrífuga Sorvall RC-28S y rotor GS-3 Sorvall, DuPont, CT, USA). El precipitado se resuspendió en 250 ml de medio TB estéril (Anexo J) más carbenicilina, se pasó a un matraz estéril y la inducción se hizo agregando IPTG para una concentración final de 0,5 mm. Se continuó la incubación a 20 ºC con agitación de 200 rpm. Pasadas 4 h se tomó una muestra de 500 µl, se centrifugó y el precipitado se resuspendió en 200 µl de tampón SDS-PAGE 5X para después guardarlo a -20 ºC (muestra 2: células inducidas). El resto se utilizó para la purificación de la proteína recombinante Purificación de la proteína recombinante T7 Las células se recolectaron mediante centrifugación a x g v por 5 min a 4 ºC, en una botella de centrífuga previamente pesada (centrífuga Sorvall RC-28S y rotor GS-3 Sorvall, DuPont, CT, USA). Al sobrenadante se le midió la actividad proteolítica (sección ) y se guardó a -20 ºC hasta la purificación por columna. El precipitado se resuspendió en 8 ml/0,1gr peso húmedo de células, de una solución Tris/HCl 30 mm, sucrosa 20% p/v (ph 8). Se agregó EDTA para una concentración final de 1 mm. Se agitó utilizando una barra magnética durante 10 min a temperatura ambiente, para luego centrifugar a x g v y 4 ºC durante 10 min (centrífuga Sorvall RC-28S y rotor F-28/50 Sorvall, DuPont, CT, USA). El precipitado se resuspendió en 25 ml de una solución fría de MgSO 4 5 mm y se agitó con agitador magnético en baño de hielo. Luego de 10 min se centrifugó a x g v y 4 ºC durante 10 min. 23

29 Del sobrenadante, que corresponde a la fracción periplasmática, se tomó una muestra de 10 µl y se agregó tampón SDS-PAGE 5X para luego guardarlo a -20 ºC (muestra 3: fracción periplasmática sin purificar). Al resto se le midió la actividad proteolítica y se guardó a -20 ºC, para posteriormente purificarlo por una columna con resina de níquel agarosa (Ni-NTA His Bind, Novagen). Por otro lado, el sedimento que contiene tanto la fracción citoplasmática soluble como la insoluble, se resuspendió en 25 ml de tampón Binding 1X (Anexo O) para luego sonicar la mezcla (Sonicador Microson, Equilab) en hielo a alta potencia con 5 pulsos de 30 s, dos veces con un intervalo de 5 minutos. Posteriormente se centrifugó a x g v durante 15 min a 4 ºC. El sobrenadante, que corresponde a la fracción soluble, se purificó por una columna con resina de níquel agarosa. El precipitado, que corresponde a la fracción insoluble se guardó a -20 ºC. Todas las fracciones se purificaron por una columna con resina de níquel. La resina utilizada tiene alta afinidad por un segmento de polihistidina presente en la proteína de fusión. A las fracciones a purificar se agregaron 250 µl de resina de agarosa Ni-NTA previamente ambientada con tampón Binding 1X. Además, a las fracciones sobrenadante y periplasmática se agregó tampón Binding 10X para una concentración final de 1X y se agitó durante 1 h en hielo. Se cargaron lentamente las fracciones en columnas pd10 con filtros previamente ambientadas con tampón Binding 1X (Anexo O) con el fin de cargar la proteína unida a la resina. Se lavó con 5 volúmenes de columna (10 ml) con tampón de lavado Binding Imidazol 20 mm (Anexo P), luego se eluyeron y colectaron 4 fracciones con 500 µl de tampón de elución Binding 250 mm imidazol (Anexo Q) Electroforesis de proteínas SDS-PAGE Las separaciones electroforéticas en condiciones denaturantes se realizaron en una cámara vertical MiniProtean II. Las muestras se prepararon en proporción 4:1 con tampón de carga 5X (Tris/HCl 60 mm, glicerol 25% v/v, SDS 2% p/v, 2- mercaptoetanol 14,4 mm y azul de bromofenol 0,1% p/v ph 6,8), se denaturaron por ebullición durante 5 min y posteriormente se cargaron en geles de bis-acrilamida 12,5 % de acuerdo a los procedimientos estándares. La electroforesis se realizó bajo voltaje constante de 200 V, utilizando tampón de corrida Trisglicina-SDS (Tris 25 mm, glicina 192 mm y SDS 0,1% p/v). Para visualizar las proteínas en el gel de acrilamida, este se incubó durante 1 hora en una solución de tinción Coomasie (45 % metanol, 10 % ácido acético, 45% agua destilada y 1 gr de 24