EVALUACIÓN DE LA TÉCNICA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA CONVENCIONAL E INCUBADO, PARA USO DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD HEMOLÍTICA EN RECIÉN NACIDOS

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1 UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA EVALUACIÓN DE LA TÉCNICA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA CONVENCIONAL E INCUBADO, PARA USO DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD HEMOLÍTICA EN RECIÉN NACIDOS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN TECNOLOGÍA MÉDICA ALUMNO: ALEJANDRA LEYTON PEREIRA PROFESOR GUÍA: TM. MG. SP. MONICA MALDONADO TALCA CHILE 2014

2 AGRADECIMIENTOS En estas líneas quiero expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a todas aquellas personas que con su ayuda han colaborado en la realización del presente trabajo, en especial a mí profesora Mónica Maldonado, guía de esta investigación, por la orientación, dedicación y la supervisión continúa de la misma, pero sobre todo por la motivación y el apoyo recibido durante este año. Quisiera agradecer de forma muy especial por la comprensión, paciencia y el ánimo recibido de mi familia, de mi pololi y amistades. A todos ellos, muchas gracias

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4 ÍNDICE Página 1. RESUMEN INTRODUCCIÓN REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO: GENERALIDADES Historia Etiología Fisiopatología Diagnóstico Tratamiento Prevención TEST ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTO Principio del Test Antiglobulina Directo por técnica en gel Objetivo de la prueba Ventajas y desventajas del uso de geles antiglobulina BILIRRUBINEMIA EN NEONATOS Correlación entre TAD positivo y niveles de bilirrubina OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIALES Y MÉTODOS Población en estudio... 18

5 5.2 Muestra Diseño metodológico Materiales y métodos Análisis estadístico RESULTADOS DISCUSIÒN CONCLUSIÓN REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 ÍNDICE DE TABLAS Página TABLA 1: RESULTADOS DE MUESTRAS ANALIZADAS POR TÉCNICA DE ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA (TAD) CONVENCIONAL Y POR TÉCNICA DE ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA (TAD) INCUBADO.21

7 ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1. FLUJOGRAMA MANEJO MADRE RhD (-) NO Página ALOINMUNIZADA...8 FIGURA 2. FLUJOGRAMA MANEJO RhD (-) ALOINMUNIZADA INTRAEMBARAZO. MANEJO BASADO EN LOS TITULOS DE ANTICUERPOS.9 FIGURA 3. ASPECTO DE LA REACCIÓN CON DIFERENTES GRADOS DE AGLUTINACIÓN EN LA TARJETA DG GEL...14 FIGURA 4: COMPARACIÓN DE INTENSIDAD DE AGLUTINACIONES DE TAD CONVENCIONAL E INCUBADO. 22 FIGURA 5: AGLUTINACION ENTRE SUERO DE UNA MUESTRA DE CORDON TAD POSITIVA Y GLOBULOS ROJOS A 1 Y B 23

8 1. RESUMEN La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) es una afección de origen inmune, en la cual la sobrevida del glóbulo rojo del recién nacido se ve disminuida como consecuencia de la acción de anticuerpos maternos, que pasan a través de la placenta y que tienen especificidad contra antígenos del niño, heredados del padre, presentes en sus células rojas. Aunque se han identificado una variedad de antígenos eritrocitarios capaces de originar una respuesta inmunitaria en una gestante, este trastorno se relaciona principalmente con el antígeno D del sistema Rh con previa aloinmunización de la madre frente a este antígeno y con los antígenos A y B del sistema ABO, en donde habitualmente los anticuerpos ABO de clase IgG están preformados. El paso de anticuerpos de la clase IgG a través de la placenta y posterior unión a la membrana del glóbulo rojo del niño seria la etiopatogenia. La prueba utilizada para hacer el diagnóstico precoz de la EHRN consiste en identificar la presencia de anticuerpos antieritrocitarios del isotipo IgG, provenientes del suero materno en la superficie de los eritrocitos del recién nacido. Esta prueba es universalmente conocida como Test Antiglobulina Humana Directo (TAD) o Prueba de Coombs Directa (TCD). En este trabajo se evaluó la eficacia del TAD convencional en comparación con una prueba de TAD modificada, la que se llamó TAD Incubado. Se analizaron 208 muestras de sangre de cordón umbilical, de las cuales se obtuvo 3 muestras positivas por ambos métodos. Se concluye que la variación del método no mejora la sensibilidad diagnóstica de la prueba.

9 2. INTRODUCCIÓN Las anemias hemolíticas son un grupo de enfermedades hematológicas que se caracterizan por la destrucción de los eritrocitos. Esta destrucción incide en la médula ósea aumentando la producción de glóbulos rojos para compensar la falta de éstos en circulación sanguínea. Cuando este aumento de la hematopoyesis no alcanza a cubrir la destrucción descontrolada de glóbulos rojos para mantener la homeostasis sanguínea, se desarrollan cuadros clínicos característicos a los estados hemolíticos. Existen las anemias hemolíticas intracorpusculares que se caracterizan por un defecto en la propia célula sanguínea y las anemias hemolíticas extracorpusculares donde el eritrocito posee morfología normal pero inciden factores externos, por ejemplo anticuerpos que producen la destrucción anticipada de los eritrocitos. En el caso de este último grupo, pueden ser causadas por mecanismos inmunes por anticuerpos de clase IgG o IgM que se unen a la membrana celular del eritrocito o por mecanismos no inmunes. El sistema inmune puede producir esta hemólisis en los eritrocitos por un proceso autoinmune o aloinmune. La anemia hemolítica del recién nacido es causada por un proceso aloinmune. Esta enfermedad se caracteriza porque se afectan los glóbulos rojos del feto y/o neonato por anticuerpos maternos capaces de atravesar la placenta. Actualmente, en clínica se realiza el diagnóstico de enfermedades inmunes mediante el test de antiglobulina directa (TAD), el cual detecta inmunoglobulina G y / o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos [1]. Esta prueba permite identificar la presencia de anticuerpos del isotipo IgG, provenientes del suero materno que reconocen antígenos en la superficie de los eritrocitos del feto o neonato [2]. Sin embargo el test convencional posee falencias frente a un diagnóstico precoz, ya que la sensibilidad de la prueba pareciera ser menor que una variante del test de antiglobulina humana directo incubado previamente. Es por esto que se planteó investigar y evaluar la prueba de antiglobulina directa convencional e incubado y definir la técnica que presente mejor sensibilidad diagnóstica para detectar en forma precoz la enfermedad hemolítica del recién nacido. 2

10 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3.1 ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO Las anemias hemolíticas presentan características morfológicas del glóbulo rojo normocíticas normocrómicas y que se caracterizan por tener una vida media disminuida. Esto puede ocasionarse debido a causas propias del glóbulo rojo o causas externas a él. Entre las anemias hemolíticas extracorpusculares están aquellas mediadas por mecanismos inmunes o no inmunes. Las de etiología inmune se clasifican en: (a) anemias hemolíticas aloinmunes mediadas por anticuerpos ajenos al paciente, por ejemplo la reacción hemolítica postransfusional o entre una madre y su hijo en gestación, como en el caso de la enfermedad hemolítica del recién nacido y (b) anemias hemolíticas autoinmunes cuando los anticuerpos formados por el paciente, están dirigidos contra los antígenos de sus propios glóbulos rojos [3] Historia Considerada hace unas décadas como una enfermedad hemolítica perinatal no conocida, que influía considerablemente en las tasas de mortalidad de los recién nacidos y que carecía de tratamiento y prevención, a la situación actual, en que su incidencia es ocasional, en que existen técnicas para hacer el diagnóstico de forma oportuna, así como de brindar tratamiento a aquellos nonatos o recién nacidos que lo necesiten disminuyendo los mortinatos y la tasa de mortalidad neonatal. La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) fue descrita por primera vez en un caso clínico presentado en Francia en el año 1609, en donde se describen un par de 3

11 gemelos que padecían diferentes cuadros en donde uno de ellos presentaba hidrops y el segundo una ictericia severa, en que ambos fallecen tiempo después [4]. Luego en 1932 se identifican las fases de esta enfermedad, entre algunas características de ella encontramos la anemia, hidrops e icterus gravis neonatorum [5] en que todas coinciden con la presencia de eritroblastosis fetal. Hasta ese momento no se conocía la causa de esta enfermedad, pero en 1940 Landsteiner y Wiener describen la aglutinación de glóbulos rojos humanos de origen caucásico, puestos en contacto con suero de conejos inoculados con glóbulos rojos de monos Macacus rhesus: al 85% que aglutinan les denominan Rh positivos [6]. En 1946 se dio a conocer el primer tratamiento para evitar la evolución a kernicterus de recién nacidos, este consistía en la transfusión de glóbulos rojos en neonatos [6]. Posteriormente se utilizó como tratamiento la interrupción prematura del embarazo para disminuir las complicaciones de esta enfermedad. Luego, en 1958 Cremer describió por primera vez la influencia de la luz tanto solar como la fluorescente en la disminución de la hiperbilirrubinemia neonatal [7]. En términos del diagnóstico de esta enfermedad también hubo evolución, donde en 1961 se correlaciona el aumento de bilirrubina en el líquido amniótico con la presencia de la enfermedad en el feto, luego en 1968 aparece una forma innovadora de profilaxis para prevenir la enfermedad del recién nacido que consiste en tratar a las madres Rh negativas y que no están aloinmunizadas con la administración de gammaglobulina anti-d o RhoGAM [8], que tiene la finalidad de destruir los glóbulos rojos fetales Rh(D) positivos que han pasado a circulación materna con el fin de que la mujer no se aloinmunize. Debido a todos los descubrimientos en cuanto a la etiología, diagnóstico y tratamiento de esta enfermedad, se ha logrado disminuir significativamente la mortalidad perinatal por esta enfermedad pasando de los 500 fallecidos por cada 1000 nacidos vivos en los años 1950 y luego de múltiples medidas adquiridas con los años se llegó a obtener tasas 4

12 de 2 fallecidos por cada 1000 nacidos vivos en el año 1990 [6], cifra que se mantiene hasta los últimos años Etiología La etiología se la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) se caracteriza por una respuesta inmune materna producida en dos fases, la primera se forman anticuerpos contra este sistema antigénico de tipo IgM los cuales no atraviesan la barrera placentaria, luego se liberan anticuerpos IgG que si atraviesan la barrera placentaria y sensibilizan los glóbulos rojos fetales uniéndose a antígenos de origen paterno presentes en ellos, con la consecuente disminución de la vida media del hematíe. Aunque se han identificado más de 60 antígenos eritrocitarios diferentes capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un receptor adecuado, este trastorno se relaciona principalmente con el antígeno D del sistema Rh y con los antígenos A y B del sistema ABO [9]. En donde estos antígenos presentes en los eritrocitos fetales ingresan a través de la placenta a la madre produciendo una aloinmunización, que consiste en la estimulación inmune de la madre y la formación de anticuerpos específicos para los diversos antígenos, en que actualmente encontramos 43 antígenos capaces de producir enfermedad hemolítica en el recién nacido [10]. Es importante indicar que el sistema Rh está compuesto por aproximadamente 50 antígenos, y de estos son 5 los antígenos considerados como antígenos mayores que conforman tres pares de antígenos Cc, D y Ee ubicados en el brazo corto del cromosoma 1 [11]. La presencia del antígeno D determina el grupo RhD positivo, mientras que su ausencia determina la característica RhD negativo ; el alelo hipotético d nunca ha sido comprobado. Un individuo RhD negativo es homocigoto para la ausencia de D. La ausencia del antígeno D, es una característica de los grupos étnicos de origen caucásico y la distribución de individuos RhD negativos no es uniforme en todas las poblaciones [6]. Con respecto a la identificación del antígeno RhD, en el año 1998 se descubrió que mediante una muestra de plasma materno y el uso de la técnica de amplificación por PCR 5

13 se puede predecir con un cien por ciento de precisión el antígeno RhD del feto. La capacidad diagnóstica es tan temprana que abarca los 38 días de gestación, pero este método aún no es incorporado en clínica [12] Fisiopatología La enfermedad hemolítica del recién nacido desencadena una sucesión de problemas fisiopatológicos. En primera instancia el feto desarrolla anemia, ya que sus glóbulos rojos sensibilizados con anticuerpos de la madre son retirados de circulación. Para suplir esta deficiencia se inicia la producción de eritrocitos, que induce la liberación de glóbulos rojos inmaduros (eritroblastos) desde la médula ósea. Si esto no es suficiente comienza el proceso de síntesis de estas células en el hígado y bazo, lo que origina hepatoesplenomegalia en el feto, junto a complicaciones como la hipertensión portal y daño hepatocelular. Finalmente, el cuadro más grave en el feto es la hidrops fetalis que se caracteriza por falla cardíaca y edema generalizado, efusión y ascitis, [3] cuadro que puede terminar con la muerte del feto en el útero. La hemoglobina liberada por la hemólisis durante la etapa fetal es metabolizada a bilirrubina y luego transportada hacia la circulación materna, en donde es eliminada. En cambio luego del parto, el recién nacido debido a su inmadurez hepática no puede metabolizar y excretar la bilirrubina, por lo que este metabolito se acumula en el organismo alcanzando niveles tóxicos (>18 mg/dl). La bilirrubina no conjugada puede atravesar la barrera hematoencefalica del recién nacido y puede infiltrar al tejido cerebral produciendo un cuadro patológico grave conocido como Kernicterus. [3] 6

14 3.1.4 Diagnóstico En la primera visita prenatal a toda mujer embarazada se le realizan exámenes para conocer el grupo sanguíneo y la búsqueda de anticuerpos irregulares dirigidos a antígenos presentes en los glóbulos rojos, además de investigar sus antecedentes clínicos obstétricos (historias de partos previos) o si la gestante ha recibido transfusiones de sangre. También se solicita un examen para conocer el grupo ABO y RhD del progenitor con el fin de averiguar si existe riesgo de incompatibilidad sanguínea [3]. En el caso de que las embarazadas sean RhD (-), se clasifican en tres categorías: las no aloinmunizadas, aloinmunizadas preembarazo y aquellas aloinmunizadas durante el embarazo. El manejo de la mujer RhD (-) no aloinmunizada, cuando no existe riesgo de alguna incompatibilidad frente al antígeno D se prosigue a monitorear el embarazo de forma habitual. En cambio, si existe un embarazo con el progenitor RhD (+) se debe controlar en el embarazo y se deben tomar medidas para que disminuya el riesgo de aloinmunización de la madre, para esto se realiza una profilaxis con gama globulina anti D a las semanas con ug (que neutraliza 30 ml de sangre fetal) [6]. En el caso de embarazadas que son aloinmunizadas durante el embarazo, sólo un 2% que posean un feto RhD (+) desarrollarán una respuesta inmune durante el embarazo, la que ocurre habitualmente después de las 28 semanas de gestación [6], las cuales deben permanecer periódicamente con exámenes sanguíneos (ver figura 1) 7

15 TAI: Test de Antiglobulina Indirecto. TAD: Test de Antiglobulina Directo. FIGURA 1. FLUJOGRAMA MANEJO MADRE RhD (-) NO ALOINMUNIZADA [6]. En la figura 2, se presenta el flujograma de una embarazada RhD (-) que ha comenzado la gestación con el Test de Antiglobulina Indirecto (TAI) con resultados negativos pero en cualquier semana de gestación se puede obtener este examen con resultados positivos con un riesgo del 2% si existe compatibilidad ABO entre la madre y el feto [6]. Lo importante es poder diagnosticar de forma oportuna y poder realizar una terapia al feto, como por ejemplo la transfusión intrauterina si existe riesgo de una enfermedad hemolítica severa para el nonato o realizar una interrupción del embarazo. Una vez que el TAI se ha hecho positivo y titulado, se repite cada dos semanas para saber el nivel de títulos presentes; aceptándose 1/16 para parto programado a término y títulos de 1/32 para realizar estudios de anemia fetal [6]. 8

16 TAI: Test de Antiglobulina indirecto. AMCT: amniocentesis. FIGURA 2. FLUJOGRAMA MANEJO RhD (-) ALOINMUNIZADA INTRAEMBARAZO. MANEJO BASADO EN LOS TITULOS DE ANTICUERPOS [6]. El diagnóstico postnatal de la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) se realiza según parámetros clínicos y de laboratorio. Entre las características físicas que guían el diagnostico esta la palidez, taquicardia y taquipnea por el efecto de la anemia. Así también la presencia de hepatoesplenomegalia [3]. Además en el momento del parto a todos los recién nacidos se les extrae sangre del cordón umbilical para realizar análisis bioquímicos, hematológicos e inmunohematologicos, en los cuales se evalúa la concentración de hemoglobina y presencia de eritroblastos, entre otros parámetros para detectar anemia u otra enfermedad hematológica y también se realiza el TAD para diagnosticar de forma precoz alguna incompatibilidad sanguínea, entre otras pruebas [3]. 9

17 Son características esenciales para diagnosticar EHRN: un resultado positivo del TAD; parámetros de hemoglobina y hematocritos bajos que indican anemia; bilirrubina indirecta sobre los parámetros normales; incompatibilidad de grupo sanguíneo; y características físicas fisiopatológicas en el neonato Tratamiento El manejo óptimo de la madre aloinmunizada y de su hijo Rh (+) requiere cuidados prenatales y postnatales continuos de ambos. Mientras que los cuidados prenatales se centralizan en el diagnóstico y tratamiento de la anemia severa y del hidrops fetalis, que constituyen las dos amenazas más importantes de la vida fetal, el cuidado postnatal se refiere principalmente a la prevención del daño producido por la hiperbilirrubinemia y por la anemia severa del lactante; y a la supresión de la producción de anticuerpos anti-rh en la madre [13]. La gravedad de la EHRN por isoinmunización Rh varía pudiéndose considerar que el 40% no precisa tratamiento, el 10% necesita transfusiones intrauterinas (TIU), otro 10% TIU y adelantar el momento del nacimiento, una cifra similar necesitan adelantar el parto y exanguinotransfusiones posteriores y el 30 % restante llegan al final de la gestación pero necesitarán tratamiento postnatal [10]. En relación al manejo prenatal existen varias opciones de tratamiento que depende de las semanas de gestación y nivel de riesgo del feto. Los nonatos más severamente afectados y su edad gestacional es de 34 semanas o más, se puede inducir el parto prematuro para disminuir la incidencia de muertes fetales debidas a la anemia [13]. En aquellos casos en que la edad gestacional sea menor se debe considerar los riesgos relacionados con la prematurez y se recomienda realizar una transfusión intrauterina para mantener en buen estado al feto y que pueda llegar vivo al final del embarazo. Existen dos 10

18 modalidades de transfusión intrauterina, la primera es la transfusión intraperitoneal. Esta técnica de menor complejidad introduce en la cavidad peritoneal fetal un catéter largo y por medio de la aguja inyectan aproximadamente 10 ml de glóbulos rojos O Rh (-). La segunda forma es hacer la transfusión por vía percutánea umbilical. Es de mayor complejidad y consiste en introducir directamente a la vena umbilical del feto la cantidad de glóbulos rojos O Rh (-) de acuerdo a la talla del nonato y peso calculado según semanas de gestación. Este último procedimiento tiene una tasa de sobrevida superior al de la transfusión intraperitoneal [3]. Ambas modalidades se deben realizar cada semana hasta la fecha del parto. Finalmente, si el feto tiene un riesgo moderado y su edad gestacional no permite otro tipo de procedimiento, se puede realizar plasmaféresis en la madre para reducir la tasa de anticuerpos hasta un 75% y reemplazando el plasma removido por albúmina e inmunoglobulinas intravenosas [3]. Para el manejo posnatal las medidas terapéuticas habituales se basan en dos mecanismos de acción: eliminación de la bilirrubina por vías alternativas de excreción para evitar neurotoxicidad (fototerapia); remoción mecánica de la bilirrubina y anticuerpos (exanguinotransfusión). En primer lugar la fototerapia es una terapia específica no invasiva que disminuye los niveles de bilirrubina plasmática. En cambio, la exanguinotransfusión es invasiva y presenta un mayor riesgo de morbi-mortalidad [14], este tratamiento consiste en un recambio sanguíneo con la remoción de los glóbulos rojos sensibilizados en circulación y de la bilirrubina libre [3]. Se han sugerido algunas sustancias farmacológicas para el manejo de la hiperbilirrubinemia neonatal tratando de disminuir la producción de bilirrubina (protoporfirinas) o de aumentar la excreción, por bloqueo o inducción enzimática respectivamente. Las metaloporfirinas, análogas del hem en la configuración de mesoporfirina y protoporfirina, con sustitución de hierro por estaño, cromo, zinc o 11

19 manganeso, inhiben la actividad de la hem oxigenasa y disminuyen la producción de bilirrubina. A continuación el hem se excreta sin metabolismo en la bilis [15]. Pero el tratamiento con metaloporfirinas implica potenciales efectos tóxicos, como lesiones de origen oxidativo producido por la luz que conlleva a la fotosensibilización de la piel, así como exantemas reversibles [15]. Existen actualmente metaloporfirinas que son menos fotosensibilizantes que otras y algunas longitudes de onda de luz de fototerapia que son menos peligrosas Prevención Los medios más efectivos para proteger a los niños contra la enfermedad hemolítica son los que previenen la aloinmunización materna a los antígenos fetales, o los que inhiben la producción de anticuerpos específicos contra estos antígenos. Esto se logra con un cuidado obstétrico adecuado que prevenga posibles hemorragias transplacentarias y con la inmunización pasiva de las madres Rh (-) no aloinmunizadas con hijos Rh (+), por medio de una globulina hiperinmune anti-rh en las primeras 72 horas después del parto [4] ; la dosis usual es de 300 microgramos por vía intramuscular. Esta dosificación de inmunoprofilaxis Rh post parto se basa en estudios clínicos que establecen que los 300 microgramos de anti-d evita la aloinmunización en una paciente RhD negativa después de una hemorragia fetomaterna (HFM) de 30 ml o menos de sangre total de un feto RhD positivo [16]. Cabe destacar que no existe un criterio universal para la inmunoprofilaxis anti- D, ya que la dosis de inmunoglobulina RhD (IgRhD) a administrar así como los test para determinar el volumen de la HFM varían de un país a otro. Por ejemplo, en Uruguay se recomienda una dosis de 120 microgramos de IgRhD intravenosa dentro de las 72 horas posteriores al parto [17]. En los países en los que se practica sistemáticamente la prevención, la incidencia de la enfermedad ha disminuido bastante (a cerca del 1%). En relación al uso de IgIV en el 12

20 recién nacido es beneficioso considerándose una alternativa de tratamiento antes de someter al recién nacido a una exanguineotransfusión [4] TEST ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTO El test de antiglobulina humana o prueba de Coombs tiene sus inicios desde 1945 cuando fue usado en medicina clínica por Robin Coombs, de ahí el nombre que lleva esta prueba [13]. La prueba de Coombs puede ser de tipo indirecto o directo, cuando es indirecto permite la detección de anticuerpos eritrocitarios presentes en el suero o plasma del paciente, por sensibilización de los glóbulos rojos in vitro, y la de tipo directo, la cual permite la detección de glóbulos rojos sensibilizados in vivo por inmunoglobulinas o fracciones del complemento [18]. Esta última como ya se mencionó es la técnica usada para el diagnóstico de la EHRN Principio del Test Antiglobulina Directo por técnica en gel. El principio del método se basa en la técnica en gel en la cual se detectan reacciones de aglutinación de los glóbulos rojos. Esta se produce cuando entran en contacto los antígenos de los glóbulos rojos con los anticuerpos correspondientes presentes en el reactivo o en la muestra de suero o plasma. La tarjeta DG Gel es un soporte de plástico constituido por 8 microtubos, en que cada uno está formado por una columna y una cámara de dispensación/incubación [19]. Cada columna contiene microesferas de dextranos polimerizados en medio tamponado que actúan como filtro y a la vez se encuentran mezclados con un reactivo que contiene antiglobulina humana [20]. Los microtubos que contienen el suero de coombs actúan aglutinando los glóbulos rojos sensibilizados, ya sea in vitro o in vivo con anticuerpos IgG o fracciones del complemento. Luego de la centrifugación se pueden observar reacciones positivas, en donde los glóbulos rojos que aglutinan serán atrapados según su tamaño en la superficie o a lo largo de la columna de gel 13

21 como se muestra en la figura 3. Finalmente, en las reacciones negativas los glóbulos rojos que no son aglutinados descienden hasta el fondo del microtubo y se observa un sedimento en la parte inferior del tubo [21] (-) FIGURA 3. ASPECTO DE LA REACCIÓN CON DIFERENTES GRADOS DE AGLUTINACIÓN EN LA TARJETA DG GEL. (Fuente: Content 2010 Immucor, Inc.) Objetivo de la prueba El TAD en muestras de recién nacido tiene como objetivo determinar la presencia o ausencia de anticuerpos maternos detectables presentes en los glóbulos rojos sensibilizados del recién nacido [22], por lo tanto esta técnica tiene como objetivo realizar un tamizaje neonatal a todos los recién nacidos para prevenir o modificar la evolución de niños con hiperbilirrubinemia y medir la efectividad del tratamiento [23] Ventajas y desventajas del uso de geles antiglobulina En cuanto a desventajas de la técnica se presenta la dependencia total del estado de la muestra, en la que se debe tener cuidado de algunos medicamentos, restos de gel de silicona del tubo de extracción que pueden inducir un resultado positivo en el test. De 14

22 preferencia utilizar muestra anti-coagulada, debido a que en muestras parcialmente coaguladas con restos de fibrina, pueden retener a los glóbulos rojos no aglutinados en la superficie del gel, lo que puede llevar a malinterpretación de los resultados [19]. Con respecto a las desventajas que presenta el producto existe una dependencia del estado de las tarjetas, en cuanto a fecha de vencimiento o contaminación, además que se requiere un equipo de centrifugación especial para estas tarjetas. En cuanto a las ventajas de esta técnica, según estudios se ha determinado la precisión de los reactivos que se encuentran presentes en la tarjeta de DG Gel Coombs, en que en los resultados no se obtuvieron casos con falsos positivos o falsos negativos. Otra ventaja de esta técnica, es que se disminuyen los errores por operador al compararlo con la técnica en tubo y es de mayor rapidez, ya que los procesos son controlados y se pueden automatizar. La metodología es simple y estandarizada para todas las reacciones. La lectura de los resultados es fácil, por ser las reacciones microscópicas y fijadas sobre el gel. Se reduce el número de manipulaciones aumentando la bioseguridad del operador. Es una microtécnica con una macrolectura. Hay trazabilidad desde el inicio de una prueba hasta la obtención del resultado [24] BILIRRUBINEMIA EN NEONATOS La ictericia en el Recién Nacido (RN) es frecuentemente un hecho fisiológico y autolimitado que se origina por una hiperbilirrubinemia significativa (bilirrubina sérica 6 mg/dl [25] ) debido a inmadurez hepática e hiperproducción de bilirrubina y es la causa más común de reinternación en las salas de cuidados de RN durante las primeras dos semanas de vida para recibir tratamiento como es la fototerapia y en no pocas oportunidades, para exanguinotransfusión [26]. 15

23 Uno de cada bebés tiene niveles de bilirrubina que puede ser elevado hasta el punto de que cause a corto plazo encefalopatía por bilirrubina aguda y a largo plazo daño cerebral (kernicterus) [27]. Algunas de las principales causas de hiperbilirrubinemia neonatal se debe a incompatibilidad de grupos sanguíneos y la enfermedad hemolítica del recién nacido [2]. Principalmente esta última se produce por incompatibilidad al sistema ABO y la isoinmunización al RhD, aunque también se han identificado anticuerpos contra otros antígenos del sistema Rh u otros sistemas eritrocitarios como el Kell, Diego o Duffy [2] Correlación entre TAD positivo y niveles de bilirrubina El valor predictivo positivo del TAD positivo para la enfermedad hemolítica del recién nacido, según el estudio de Dinesh [28] es del 23% y la sensibilidad se estimó en 86%. Por lo tanto, de 10 bebés que requieren reingresar para recibir tratamiento por fototerapia sólo 2 de ellos fueron TAD positivos al inicio. También se observó que la ictericia en vez del TAD positivo, fue el primero en dar la alerta en la mayoría de los casos de neonatos que necesitaron fototerapia como tratamiento [28]. Según Baptista et al [2] en casos que presentan incompatibilidad ABO, más del 80% de los recién nacidos presentaron TAD negativo. Sin embargo, aquellos neonatos con incompatibilidad ABO y TAD positivo tienen cinco veces más probabilidad de presentar enfermedad hemolítica que aquellos que el resultado del TAD fue negativo. Por lo tanto, esta prueba es útil en la predicción temprana de ictericia pero aún no es lo suficiente para detectar todos los casos, ya que presenta una alta tasa de falsos negativos. La hipótesis de esta investigación consiste en que el TAD incubado presenta una mayor sensibilidad diagnóstica que el TAD convencional para el diagnóstico de la EHRN. 16

24 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar la eficacia de dos metodologías para la Prueba Antiglobulina Humana Directa, como uso diagnóstico de la enfermedad hemolítica en recién nacidos. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realizar TAD convencional y TAD modificado a muestras de sangre de cordón umbilical, referidas de la Unidad de Medicina Transfusional del Hospital de Talca. Comparar la sensibilidad diagnóstica del test de antiglobulina humana directa incubado con respecto a la técnica antiglobulina humana directa convencional con el fin diagnóstico de EHRN. Investigar la especificidad de los anticuerpos en aquellas muestras que resulten positivas. 17

25 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Población en estudio región. La población en estudio fueron recién nacidos en el Hospital de Talca, séptima 5.2 Muestra Se utilizaron 208 muestras de sangre de cordón umbilical recogida con anticoagulante EDTA, de recién nacidos. Las muestras fueron colectadas entre el periodo de octubre a noviembre del 2013 y abril del año Diseño metodológico Trabajo experimental de corte transversal. 18

26 5.4 Materiales y métodos Test de antiglobulina humana directa convencional por técnica en Gel-Coombs. Las muestras de cordón umbilical fueron previamente centrifugadas (centrifuga Hettich- EBA 21) y lavadas con una solución isotónica de tampón fosfato salino y luego se procedió según las instrucciones del método manual del fabricante de tarjetas DG Gel Coombs, marca Grifols (lote: ). Primero se realizó la preparación de una suspensión de hematíes de cada paciente al 1% en tampón fosfato salino y luego se añadió 50 µl de esta suspensión en el microtubo correspondiente de las tarjetas DG Gel Coombs. Finalmente se centrifugó en el equipo específico para las tarjetas DG Gel (Centrifuga Grifols-Dianafuge) y se leyó los resultados. Test de antiglobulina humana directa modificado por técnica Gel-Coombs. Se realizó una modificación a la técnica convencional que consiste en la incubación durante 30 min a 37 C de los glóbulos rojos de la muestra de cordón con el suero/plasma extraída previamente de la misma muestra. Esta modificación otorga la posibilidad que aquellos posibles anticuerpos maternos que se encuentren en la circulación sanguínea del neonato, puedan reaccionar con los glóbulos rojos que posean el antígeno. Se apuesta a que podría aumentar la sensibilidad diagnóstica, demostrada en el aumento del número de muestras positivas con respecto a la técnica convencional. De cada muestra una vez separado el plasma, se preparó una suspensión de los glóbulos rojos al 1%. De éstas, se añadió 50 µl a cada microtubo según correspondía al número asignado, luego se agregó 25 µl del plasma de la misma muestra y se dejó incubar 19

27 a 37 C en una incubadora para microplacas (Heidolph- inkubator 100) durante 30 minutos. Finalmente se centrifugó en el equipo específico para las tarjetas DG Gel (Centrifuga Grifols-Dianafuge) y se leyó los resultados. Identificación de anticuerpos irregulares de tipo IgG. Para determinar la especificidad (es) del (de los) anticuerpo(s) presentes en las muestras con resultado TAD positivo se utilizó el suero de la sangre de cordón y el reactivo PANOCELL-16 (INMUCOR, INC. LOTE: 39988) y glóbulos rojos A 1 y B. Se procedió empleando tarjetas DG Gel y mediante las instrucciones del fabricante. 5.5 Análisis estadístico Análisis descriptivo de datos, utilizando porcentaje como expresión de resultados. 20

28 6. RESULTADOS De total de muestras analizadas (n=208) sólo 3 muestras de cordón umbilical resultaron TAD positivo, por ambos métodos. En la tabla 1 se muestran los resultados expresados en porcentajes del estudio mediante la técnica antiglobulina directa convencional e incubada. Se puede observar que el número de muestras TAD negativo son significativamente mayor al número de muestras con TAD positivo. TABLA 1: RESULTADOS DE MUESTRAS ANALIZADAS POR TÉCNICA DE ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA (TAD) CONVENCIONAL Y POR TÉCNICA DE ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA (TAD) INCUBADO. Test Muestras cordón Muestras positivas Muestras negativas N % N % N % TAD Convencional TAD Incubado , , , ,5 Con los resultados obtenidos con la técnica antiglobulina humana directa (TAD) incubada no se logró un aumento de la sensibilidad diagnóstica con respecto al TAD convencional, ya que ambas técnicas arrojaron los mismos resultados. Sólo se observó un cambio en la intensidad de la reacción positiva, siendo mayor la aglutinación en el TAD incubado a diferencia de las débiles aglutinaciones del TAD convencional (ver figura 4). 21

29 A. Muestra 21 ampliada B. Muestra 21 ampliada FIGURA 4: COMPARACIÓN DE INTENSIDAD DE AGLUTINACIONES DE TAD CONVENCIONAL E INCUBADO. (A) Se observa la intensidad de aglutinación de 2 cruces de la muestra N 21 del TAD incubado. (B) En la tarjeta de DG Gel se aprecia la intensidad de 1 cruz en la muestra N 21 mediante el TAD convencional. Finalmente se realizó la técnica de identificación de anticuerpos para determinar la especificidad de los anticuerpos detectados en las tres muestras TAD positivo. Al enfrentar los anticuerpos con el panel de 11 células Grupo 0 (Pannocell) los tres sueros dieron resultados negativos, por lo que enseguida se enfrentaron a células reactivas A 1 y B, en donde se observó aglutinaciones con ambos glóbulos rojos, lo que indica la presencia de 22

30 anticuerpos de tipo IgG del sistema ABO (anti-a y anti-b) y que serían los responsables de los TAD positivo. La figura 5 muestra los resultados obtenidos para una de las muestras positivas. Aglutinación con glóbulos rojos A 1 ampliada Aglutinación con glóbulos rojos B ampliada FIGURA 5: AGLUTINACION ENTRE SUERO DE UNA MUESTRA DE CORDÓN TAD POSITIVO Y GLÓBULOS ROJOS A 1 Y B. 23

31 7. DISCUSIÓN La causa más importante de anemia fetal es por incompatibilidad Rh. Este factor RhD tiene un gran poder antigénico y el volumen de sangre capaz de inmunizar se ha estimado en, por lo menos 0,25 mm 3 si existe concomitantemente compatibilidad de grupos ABO. Cuando los grupos ABO no son compatibles, la frecuencia de inmunización al factor RhD disminuye, ya que las aglutininas naturales del sistema ABO eliminan los glóbulos rojos con el Ag Rh incompatible de la circulación impidiendo la inmunización [13]. Esta patología afecta a dos de cada recién nacidos, siendo la mortalidad menor del 2 % [29]. Estos índices se deben a la detección temprana de posible incompatibilidad sanguínea entre madre e hijo durante el embarazo y a la profilaxis oportuna a todas las gestantes en riesgo. La EHRN se identifica con el TAD, que indica si existen glóbulos rojos del recién nacido sensibilizados con anticuerpos IgG maternos que han atravesado la placenta. La causa más común de esta enfermedad es por anticuerpos frente a antígenos ABO, sin embargo los anticuerpos frente a antígenos Rh y Kell son la segunda causa más común y tienden a causar que la EHRN se desarrolle con mayor gravedad. También los anticuerpos anti-kidd, Duffy, MNS, y Diego también han sido implicados [30]. El TAD convencional es utilizado para el tamizaje postnatal y diagnóstico de la EHRN. Estudios evidencian una sensibilidad de la técnica en gel de 93,5% y una especificidad del 88,6% [31]. Estudios clínicos indican que el TAD en sangre de cordón umbilical presenta una sensibilidad diagnóstica de 15-64% [32]. Es por esto que en esta investigación se realizó una modificación al TAD convencional con el fin de aumentar la sensibilidad diagnostica de la prueba. Los resultados de las muestras analizadas por el TAD convencional e incubado arrojaron exactamente el mismo porcentaje de muestras positivas. Sólo se observó un cambio en la intensidad de aglutinación, siendo este mayor en los resultados obtenidos por el TAD incubado. 24

32 El TAD a partir de sangre de cordón umbilical de recién nacidos ha demostrado un alto porcentaje de falsos negativos y baja sensibilidad diagnóstica, ya que no es capaz de identificar a todos los casos que desarrollaran hiperbilirrubinemia posteriormente [32]. Se encontró un estudio que indica que la probabilidad de reingreso por fototerapia es igual para aquellos recién nacidos que su resultado del TAD de cordón umbilical fue positivo o negativo, e incluso, para aquellos en los que no se realizó un TAD [33]. Además, en un estudio en Nueva Zelanda [33] se estimó el valor predictivo positivo en 23 %, es decir, la cuarta parte con un TAD positivo en la sangre del cordón umbilical desarrollo ictericia neonatal. Se planteó la hipótesis de una modificación al TAD convencional que consistía en extraer el plasma de la sangre de cordón, que contiene los probables anticuerpos traspasados de la madre, al ponerla en contacto con los glóbulos rojos del neonato y dar un tiempo de incubación a la temperatura de reacción a los anticuerpos IgG (37 C), aumentaría el número de muestras TAD positivo. Los resultados obtenidos hacen necesario rechazar la hipótesis planteada. Según estos resultados y los mencionados de otro estudio, se predice que la vigilancia clínica para la ictericia neonatal tanto durante la hospitalización como luego del alta, sería un factor clave para el diagnóstico precoz de EHRN. Esto se basa en un estudio sobre la bilirrubina sérica determinada a las 24 y 48 horas de vida, señala que cifras de bilirrubina sérica superiores a 6 mg/dl a las 24 horas y 9 mg/dl a las 48 horas de vida indican riesgo al recién nacido de padecer hiperbilirrubinemia significativa [25]. Es importante indicar que el TAD convencional es realizado a partir de una muestra de cordón umbilical y al parecer, esta muestra no sería representativa del estado inmunológico del recién nacido, lo que conlleva a no detectar la sensibilización de los glóbulos rojos del recién nacido. Es por esto que se sugiere hacer un estudio comparativo 25

33 de TAD en muestras de sangre venosa versus sangre de cordón, con el fin de demostrar la sensibilidad diagnóstica de la prueba según origen de la muestra. 26

34 6.- CONCLUSIÓN La incubación del TAD no incrementó significativamente la sensibilidad diagnóstica de la técnica. Aunque el TAD es importante para tratar de identificar la causa de la hiperbilirrubinemia neonatal, se ha demostrado que tiene muy baja utilidad para predecir el desarrollo de una hiperbilirrubinemia significativa. Es necesario establecer cuál es la mejor muestra que represente el estado inmunológico del recién nacido para realizar el TAD. 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 27

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