Nuevos ensayos moleculares de la tecnología SUMA para el diagnóstico de las hepatitis B y C

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1 Nuevos ensayos moleculares de la tecnología SUMA para el diagnóstico de las hepatitis B y C MSc. Anny Armas Cayarga Laboratorio de Biología Molecular Centro de Inmunoensayo Octubre 16, 2015

2 Qué es el diagnóstico molecular? Este incluye todos los ensayos y métodos para identificar una enfermedad o la predisposición para una enfermedad, analizando el ADN o ARN de un organismo.

3 Etapas del Diagnóstico Molecular 1. Procesamiento de la muestra: (Aislamiento y purificación del ácido nucleico) 2. Amplificación de ácidos nucleicos: (Amplificación de la señal o del blanco) 3. Detección del producto amplificado: (Detección de fluorescencia, luminiscencia, absorbancia, otros)

4 1. Métodos de purificación de ácidos nucleicos Precipitación del ácido nucleico con isopropanol y etanol (método largo y complejo) Columnas de sílica (Requiere de pasos de centrifugación y puede ocurrir pérdida del ácido nucleico) Partículas magnéticas (no requiere de pasos de centrifugación, método sencillo, rápido, facilidad de automatización)

5 2. Métodos de amplificación de ácidos nucleicos Amplificación del blanco: - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - Reacción en cadena de la ligasa (LCR) - Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) - Amplificación mediada por la transcripción (TMA) - Amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA)

6 Qué es la PCR? Técnica de amplificación in vitro de un fragmento de ADN, que permite la obtención de millones de copias del mismo en unas pocas horas. La PCR nos permite encontrar la aguja en el pajar, no por el procedimiento de ir separando la paja, sino por la vía de hacer crecer la aguja hasta que sea visible (Hans Burkardt, Prof. Univ. Alemania). Inventada por Kary Mullis en 1983.

7 Tipos de PCR 1. RT-PCR 2. Nested-PCR (PCR anidada) 3. PCR con primers degenerados 4. PCR hot start 5. PCR touchdown 6. PCR múltiple 7. PCR en tiempo real

8 3. Métodos de detección del producto amplificado Análisis en geles de agarosa Sistemas colorimétricos o fluorigénicos en placas Secuenciación directa Microarreglos de ADN PCR en tiempo real

9 Importancia de las técnicas moleculares Útiles en la confirmación de infecciones (VHC y VHB, solo alrededor de un 50% de los casos positivos a anticuerpos contra el VHC o al AgsHB, respectivamente, son positivos a las pruebas moleculares) Permiten definir los casos de infecciones resueltas: seropositivos que no tienen replicación activa del virus (seguimiento de la respuesta a una determinada terapia) Permiten la detección del agente infeccioso en el periodo de ventana (Ej VHC: 70 días; técnicas moleculares: 7-10 días Útiles en el diagnóstico en pacientes inmunodeprimidos (trasplantados, pacientes con cáncer o SIDA)

10 Utilidad de las técnicas moleculares en el diagnóstico y manejo de enfermedades infecciosas Diagnóstico inicial (Ensayos cualitativos) Pronóstico de la enfermedad (Ensayos cualitativos, cuantitativos y de genotipaje) Monitoreo de la respuesta a terapia (Ensayos cualitativos y cuantitativos)

11 GHANY ET AL. HEPATOLOGY, 2009 Diagnóstico y manejo de la infección por VHC 1- Ensayos serológicos (detectan anticuerpos específicos al VHC) 2- Ensayos moleculares (detectan el ácido nucleico viral) Ensayos cualitativos Ensayos cuantitativos Ensayos de genotipaje Interpretación de los ensayos para VHC: Anti-VHC ARN-VHC Interpretación Positivo Positivo Infección por VHC aguda o crónica, dependiendo del contexto clínico Positivo Negativo Resolución de infección por VHC; Infección aguda por VHC durante el periodo de bajo nivel de viremia Negativo Positivo Infección por VHC aguda temprana; Infección crónica por VHC en un estado de inmunodepresión; prueba de ARN del VHC falsa positiva Negativo Negativo Ausencia de infección por el VHC

12 Ensayos cualitativos Ensayos cualitativos aprobados por la FDA para la detección delarn del VHC Ensayo (fabricante) Método Límite de detección (UI/mL) Amplicor HCV v2.0 (Roche Molecular Systems) RT-PCR manual 50 Cobas Amplicor HCV v2.0 (Roche RT-PCR semiautomatizada Molecular Systems) 50 Ampliscreen (Roche Molecular RT-PCR semiautomatizada Systems) 50 Versant HCV RNA Qualitative RT-PCR semiautomatizada Assay (Siemens Healthcare Diagnostics) 10 Procleix HIV-1/HCV Assay (Chiron TMA manual Corporation) 50 Escenario Diagnóstico seguimiento Diagnóstico seguimiento Pesquisaje la sangre Diagnóstico y seguimiento Pesquisaje de la sangre y y de Abreviaturas: RT-PCR, del inglés reverse transcription-polymerase chain reaction (transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa); TMA, del inglés transcriptionmediated amplification (amplificación mediada por la transcripción). GHANY ET AL. HEPATOLOGY, 2009

13 Ensayos cuantitativos Ensayo (fabricante) Método Rango dinámico Aprobación (UI/mL) FDA Amplicor HCV Monitor (Roche Molecular Systems) RT-PCR manual ,000 Sí Cobas Amplicor HCV Monitor V2.0 (Roche Molecular Systems) Versant HCV RNA 3.0 Assay (bdna) (Siemens Health Care Diagnostics) LCx HCV RNA-Quantitative Assay (Abbott Diagnostics) SuperQuant (National Genetics Institute) Abbott RealTime (Abbott Diagnostics) Cobas Taqman HCV Test (Roche Molecular Systems) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative Test, v2.0 (Roche Molecular Systems) semi- RT-PCR automatizada semi- RT-PCR automatizada Amplificación de la señal (bdna) semiautomatizada semi- RT-PCR automatizada semi- RT-PCR automatizada PCR en tiempo real semi-automatizada PCR en tiempo real automatizada ,000 Sí 615-7,700,000 Sí 25-2,630,000 No 30-1,470,000 No ,000,000 No 43-69,000,000 Sí ,000,000 (LD: 11 UI/mL) Sí

14 Sensibilidad y Especificidad de los ensayos moleculares requeridas para el diagnóstico y manejo de la infección por VHC Históricamente, los ensayos cualitativos han sido más sensibles que los cuantitativos. Con la disponibilidad actual de los ensayos de PCR en tiempo real, con sensibilidades de UI/mL, no son necesarios los ensayos cualitativos. Un ensayo altamente sensible, con un límite de detección en este rango y una especificidad excelente (>98%), se considera apropiado para el seguimiento de la infección por el VHC durante la terapia. Fuente: Diagnosis, Management, and Treatment of Hepatitis C: An Update. Hepatology 2009; 49:

15 Monitoreo del tratamiento de la hepatitis C Incluye el monitoreo de la eficacia del tto., de la seguridad y efectos secundarios. Monitoreo de la eficacia del tto. Se basa en mediciones repetidas de niveles de ARN del VHC por un ensayo sensible, con buena exactitud y amplio rango dinámico. En cada paciente debe emplearse el mismo ensayo, idealmente del mismo lab., para asegurar consistencia en los resultados. Fuente: EASL Clinical Practice Guidelines. Journal of Hepatology, 2014

16 Nuevos ensayos moleculares de la tecnología SUMA para el diagnóstico de las hepatitis B y C (PCR en tiempo real) SUMASIGNAL VHC SUMASIGNAL VHB (un paso)

17 PCR en tiempo real. Ventajas de su uso En qué consiste?: PCR convencional en la que los termocicladores poseen un sistema de detección de fluorescencia. Se emplean moléculas específicas: fluoróforos y quenchers. Ambos factores, nos van a permitir monitorear, en tiempo real, la amplificación del ADN, sustituyendo los pasos de electroforesis/hibridación y análisis de imagen de una PCR tradicional. Los pasos de amplificación del blanco y su detección ocurren simultáneamente en el mismo tubo de reacción. Ventajas de la PCR en Tiempo Real: No requiere de un procesamiento post-pcr: ahorra tiempo, recursos y disminuye el riesgo de contaminación. Incrementa el rango dinámico de detección del ensayo (hasta 9log). Mayor sensibilidad, especificidad y precisión. Permite detectar más de un producto específico en una misma reacción (PCR múltiple), utilizando sondas marcadas con diferentes fluoróforos.

18 Cuantificación en tiempo real - ventajas La cuantificación en la PCR convencional: se hace en función del producto final (variaciones muy significativas). La cuantificación en la PCR en tiempo real: se realiza en función del valor de Ct (Cycle threshold, valor umbral de ciclo), que al ser al principio de la amplificación, no se ve afectado por todas esas variaciones (mayor precisión). Resultados de 96 réplicas de una muestra evaluada en una misma placa de PCR. Se observan las variaciones que se pueden obtener en los resultados del producto final frente a la nula variación en el valor de Ct en todas las réplicas.

19 Tecnologías principales (SUMASIGNAL) Ensayos moleculares (partículas magnéticas) --- extracción de ácidos nucleicos sencilla y rápida (1,5 horas) --- alta sensibilidad y especificidad --- Bajos volúmenes de muestra --- amplio rango dinámico (hasta 9log 10 ) --- precios competitivos Protocolo de operación

20 Tecnologías principales (SUMASIGNAL) --- uno de los ensayos diagnósticos de ADN más sencillos Ensayos moleculares (un paso) --- disminución del tiempo de operación en más de un 70% --- no hay necesidad de un conocimiento técnico estricto por el operador --- menos consumibles de laboratorios --- amplio rango dinámico (hasta 9log 10 ) --- costos reducidos Protocolo de operación

21 SUMASIGNAL VHC (24 pruebas) Ensayo para la cuantificación por PCR en tiempo real del ARN del virus de la hepatitis C (VHC) en suero o plasma humano

22 SUMASIGNAL VHC Características generales del ensayo: Apropiado para el diagnóstico de la infección por el VHC y para el seguimiento del efecto terapéutico de los antivirales en los pacientes infectados. Incluye la tecnología de partículas magnéticas para la extracción del ARN (Fácil manipulación, bajos costos, rapidez, no requiere de pasos de centrifugación, uso limitado de productos químicos y facilidad de automatización). Empleo de la enzima Uracil-N-Glicosilasa (UNG) + dutp, lo cual permite degradar los productos amplificados no deseados, para evitar resultados falsos positivos. Incluye un control interno que informa sobre la presencia de inhibidores de la PCR, para evitar resultados falsos negativos. Compatible con los equipos de PCR en tiempo real: ABI 7300 y ABI 7500 (Applied Biosystems), Stratagene Mx3000P (Invitrogen), LightCycler 480 (Roche Diagnostics) y SLAN-96P (TecnoSuma S.A.)

23 SUMASIGNAL VHC Características analíticas: Volumen y tipo de muestra Sensibilidad analítica (límite de detección) 200 µl (suero, plasma) 25 UI/mL Especificidad clínica y analítica 100% Rango lineal Detección de genotipos del VHC 1 6 Comparación con ensayo de referencia COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV test v2.0 (Roche Diagnostics) Tiempo total de ensayo (24 pruebas) 50 1 x 10 8 UI/mL r = 0,952 (n = 36) 3,5 horas Correlación entre los ensayos COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV test v2.0 de Roche Diagnostics (eje-x) y SUMASIGNAL VHC de la compañía TecnoSuma SA (eje-y). Se graficaron los log 10 de las concentraciones de ARN del VHC calculadas para las 36 muestras clínicas. Línea sólida, línea de regresión. r, coeficiente de correlación de Pearson.

24 SUMASIGNAL VHB (un paso) 48 pruebas Ensayo para la cuantificación por PCR en tiempo real del ADN del virus de la hepatitis B (VHB) en suero o plasma humano

25 SUMASIGNAL VHB (un paso) Características generales del ensayo: Apropiado para el diagnóstico de la infección por el VHB y para el seguimiento del efecto terapéutico de los antivirales en los pacientes con hepatitis B. No requiere del paso de extracción del ADN, solo lisis rápida y liberación del ADN del VHB (disminuye la probabilidad de posibles contaminaciones durante la extracción del ADN y reduce significativamente el tiempo total del ensayo). Empleo de la enzima Uracil-N-Glicosilasa (UNG) + dutp (evita resultados falsos positivos). Incluye un control interno que informa sobre la presencia de inhibidores de la PCR (evita resultados falsos negativos). Compatible con los equipos de PCR en tiempo real: ABI 7300 y ABI 7500 (Applied Biosystems), Stratagene Mx3000P (Invitrogen), LightCycler 480 (Roche Diagnostics) y SLAN-96P (TecnoSuma S.A.)

26 SUMASIGNAL VHB (un paso) Características analíticas: Volumen y tipo de muestra Sensibilidad 5 µl (suero, plasma) 100 UI/mL Especificidad clínica y analítica 100% Rango lineal Detección de genotipos del VHB Comparación con ensayo de referencia COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV test v2.0 (Roche Diagnostics) Tiempo total de ensayo (48 pruebas) x 10 9 UI/mL A-H r = 0,926 (n = 87) 2,5 horas Correlación entre los ensayos COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV test v2.0 de Roche Diagnostics (eje-x) y SUMASIGNAL VHB (un paso) de TecnoSuma SA (eje-y). Se graficaron los log 10 de las concentraciones de ADN del VHB calculadas para las 87 muestras clínicas. Línea sólida, línea de regresión. r, coeficiente de correlación de Pearson.

27 Equipo de PCR en tiempo real: SLAN-96P (TecnoSuma S.A.) CARACTERÍSTICAS: - Capacidad: 96 muestras - Dos bloques de reacción (48/48), controlados de forma independiente para ejecutar dos ensayos de PCR diferentes - Permite emplear una gran variedad de fluoróforos: FAM, SYBR, HEX, JOE, VIC, TET, ROX, TEXRD y CY5 - Capacidad de lectura para 6 colores (PCR múltiple) - Realiza el análisis cualitativo o cuantitativo de las muestras - Permite el análisis de las curvas de fusión para diferenciar diferentes productos amplificados - Se obtienen resultados con buena exactitud en menos de 80 minutos - Apropiado para Diagnóstico Clínico in vitro y para uso general en el laboratorio APLICACIONES: Detección de patógenos en muestras clínicas Investigación científica básica Tamizaje genético Inspección de la higiene de los alimentos Epidemiología

28 Precauciones en el empleo de las técnicas moleculares Técnica altamente sensible, contaminación con ADN ambiental (aerosoles del propio material amplificado previamente). Normas que ayudan a evitar las contaminaciones y la aparición de falsos positivos: 1- No violar el flujo de trabajo (área de pre-amplificación área de postamplificación. 2- Lugar físico e instrumental exclusivo para la realización del ensayo. 3- Utilización de reactivos y tubos estériles, así como puntas resistentes a aerosoles (puntas con filtro). 4- Descontaminar habitualmente el puesto de trabajo empleando hipoclorito de sodio al 5% y luz U.V. Para evitar la aparición de resultados falsos negativos, producidos por errores al pipetear, dejar restos de solventes orgánicos en la muestra extraída o presencia de inhibidores en las muestras, se recomienda: Emplear un Control Interno que compite con la muestra problema (Control de calidad del ensayo). Personal entrenado en los procedimientos de extracción y amplificación en tiempo real, con habilidades en el uso de técnicas asépticas y con adherencia estricta a los procedimientos de operación.

29 Transportación y almacenamiento de las muestras para la realización de pruebas moleculares Transportación de las muestras: El transporte de sangre entera debe realizarse de 2 a 25º C y procesarse dentro de las 4 horas después de la recolección. El plasma o suero se transportará a una temperatura de 2 a 8 ºC en estuches o bolsas cerradas con hielo. Almacenamiento de las muestras: El suero o plasma podrá ser conservado de 2 a 8 ºC un día como máximo, a una temperatura de -20 ± 5 C hasta tres meses o a -70 C ± 5 C durante un período más largo. No hacer congelaciones y descongelaciones repetidas de los sueros o plasmas porque pudieran producirse falsos negativos de la prueba (muestras con baja viremia).

30 MATERIALES Y EQUIPAMIENTOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS Tubos de centrífuga de 1,5 ml libres de RNasas o DNasas Tubos de PCR de 0,2 ml Pipetas y puntas con filtro (10 μl, 200 μl, 1000 μl) Centrífuga para tubos de 1,5 ml Agitador orbital (vortex) Separador magnético Equipo de PCR en tiempo real

31 SUMASIGNAL VHB (un paso) SUMASIGNAL VHC MUCHAS GRACIAS

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