High Resolution Melting (HRM)

Transcripción

1 High Resolution Melting (HRM) El análisis de las Curvas de Melting en conjunción con el Real Time PCR fue introducido en 1997 (Ririe et al., Anal Biochem 1997; 245: ; Lay et al., Clin Chem 1997;43:2262 7) Es una extensión natural de un PCR continuamente monitoreado dentro de cada ciclo. Una ventaja de este método es que más que determinar la presencia o ausencia de un alelo específico, el método puede analizar la región entera dentro de la sonda.

2 HRM: USOS-1 Análisis de nuevas mutaciones Screening para pérdida de heterocigosidad DNA fingerprinting Genotipificar SNP Caracterización de blocks de haplotipos Análsis de metilación Mapeo de ADN

3 HRM: USOS-2 Identificación de especies Determinar el rango de mut. Somát.adquiridas Compatibilidad HLA Identificación de genes candidatos para predisposición Estudios de asociación (casos-controles) Prevalencia alélica en las poblaciones

4 El análsis de HRM en real-time PCR utiliza fluorescencia que se une a ADN de doble hebra. Luego del ciclo 40, el blanco es amplificado y una gran fluorescencia se encuentra en el estado de anneling. En este momento, el instrumento capta la fluorescencia realizando rampas de temperatura mientras simultáneamente lee la fluorescencia.

5 Los niveles de fluorescencia bajan levemente hasta la temperatura cercana a la Tm. Muy cerca de la Tm se produce un decrecimiento drástico en la fluorescencia que es onservada como una muestra de transicion desde la doble hebra a la simple hebra

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7 Utilizar amplicones cortos para mayor sensibilidad, alrededor de 100pb podrían permitir una detección mejor de SNps. Asegurarse la especificidad de los primers: mismach o formación de dímeros pueden complicar la interpretación Concentración de primers mas baja que 200n m, MgCl 2 de 1.5 a 3 mm y el uso de hot start es aconsejable

8 Evitar amplificaciones dentro de las regiones que podrían tener otras variaciones que los SNPs buscados. Chequear homologías, uniones exon/intón, sitios de splicing, formación de estructuras secundarias Es útil insertar un paso de pre-hold a 50ºC seguido de la amplificación (pero previo a el melt) para asegurar que todos los productos sean reasociados y se formen los heteroduplex.

9 Debe usarse fluorescencia de 3er nivel para saturar la molécula Los perfiles de homo y heteroduplex son diferentes

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11 Para una muestra heterocigota, un amplicón de PCR puede comprender 4 diferentes moléculas 2 heteroduplex 2 homoduplex Sin embargo, un wild type u homocigota mutante comprenden un único homoduplex Cuando se realiza el melting, cada duplex exhibe una diferente disociación. Esto puede ser monitoreado por el RT-PCR durante el desarrollo del ploteo de los cambios de fluorescencia que ocurren en el amplicón con los cambios de temperatura en la disociación de la doble hebra de ADN a simple hebra

12 Ejemplo de curva de HRM utilizando RotorGene 6000 AZUL: wilt type ROJA: muestra heterocigota 62C>G ROSADA: homocigota mutado.

13 No.Name Genotype pp Variation pp Variation Variation Variation pp Variation pp Variation Normalised minus pp ,5 77,0 77,5 78,0 78,5 79,0 79,5 80,0 80,5 81,0 81,5 82,0 82,5 83,0 deg.

14 Genotipificación de 2 SNPs adyacentes (HbS and HbC) dentro de un fragmento de 110-bp globina con el uso de high-resolution amplicon melting curve analysis.

15 (A) Incluye 2 diferentes individuos para cada uno de los 6 diferentes genotipos, cada individuo corre en duplicado

16 B: las mismas curvas que en A luego de la normalización

17 Cuando el propósito del análisis es escanear a los heterocigotas la temperatura de balance (compensación) de las muestras puede ser eliminado por el desvío de la temperatura del eje de las X de cada curva de tal manera que las curvas se sobrelapen dando el intervalo de fluorescencia.

18 Los amplicones de los heterocigotas producen más bajas temperaturas por la presencia del heteroduplex. Los heteroduplex se identifican por su temprano decrecimiento de la fluorescencia a más baja temperaturas Sin embargo este solapamiento podría emparejar a los homocig.

19 C: curvas normalizadas luego de desvió de temperatura de cada curva que se solape con AA dentro de in 5 % y 10% de fluorescencia

20 D: deferencias de las curvas de fluorescencia sustrayendo cada una de las curvas en el panel C desde la curva wild type (AA) (no se muestra la otra curva AA para clarificar)

21 Debido al cambio en la temperatura de las curvas de los paneles C y D, el eje de la X no refleja temperatura absoluta pero refleja diferencias relativas de temperatura al segmento impuesto de la curva

22 SNPs typing in en PCR amplicones con múltiples dominios Análisis de HRM de SNPs dentro de un fragmento de 544-bp del gen humano HTR2A

23 Genotipificación de la región I507/F508 del gen de la Fibrosis Quística A: escala del amplicon de 44 pb B: uso de syber green: la curva de melting derivada muestra la cercanía de las curvas detm. No separa heteroduplex C: con el uso de otro fluróforo claramente se separan los heteroduplex donde el melting tiene temperaura más baja que los homoduplex. En ambos casos se muestran 2 homocigotas y 3 heterocigotas