SPORE NEWS. Volúmen 11 Número 3 Julio por Beth Ridgeway
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- Gonzalo Romero Crespo
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1 10 Evergreen Drive, Suite E, Bozeman, MT Phone: (406) FAX: (406) Mesa Laboratories, Inc ALL RIGHTS RESERVED Produced in USA SPORE NEWS Volúmen 11 Número 3 Julio 2014 Análisis de la resistencia de las esporas mesofílicas a la esterilización por óxido de etileno Traducido por: por Beth Ridgeway Duquessa d'orleans 46, B Barcelona Tel.: Fax: info@tiselab.com
2 Ocasionalmente, algún cliente se pone en contacto con nosotros cuando ha identificado un organismo en su indicador biológico (BI) que no ha sido catalogado en el certificado de análisis (CofA). Algunas de estas situaciones aparecen cuando un cliente realiza un cultivo por extensión de un control positivo para su aislamiento y aparece un positivo inesperado en su ciclo o durante la identificación inicial de especies en las pruebas de cualificación internas. La mayoría de las veces, los indicadores biológicos en cuestión son aquellos que contienen esporas mesofílicas de Bacillus atrophaeus usadas en los procesos de esterilización por óxido de etileno (EtO) y por calor seco. Esta Spore News se centrará principalmente en estos BIs. De dónde proviene esta contaminación? Entre las posibles fuentes se encuentran, aunque no en exclusiva, las siguientes: Una técnica de asepsia inadecuada al realizar la siembra o el cultivo del BI puede provocar contaminación post exposición, p.ej. el microbio provino del técnico. Medioambiente: los microbios aerotransportados pueden contaminar el BI o el medio de cultivo durante el proceso de cultivo. Medio de cultivo no estéril. Contaminación durante el proceso de fabricación de los indicadores biológicos. Debido a que el número de microbios contaminantes es normalmente muy bajo - inferior a 10 unidades formadoras de colonias (CFU) -, resulta difícil realizar un recuento exacto mediante técnicas de medios de cultivo debido a la presencia de 10 6 esporas de Bacillus atrophaeus en el BI. El Bacillus atrophaeus tiene una morfología de colonia de color naranja que ayuda a diferenciar esta especie de otras que pudieran estar presentes. Una vez más, el nivel es tan bajo que para especificar el contaminante suele ser necesario cultivarlo en una placa a partir de una dilución 10-1, lo que conlleva una cuidadosa evaluación de las placas ya que este factor de dilución producirá un crecimiento en césped del Bacillus atrophaeus. Algunos usuarios han tratado de recontar o determinar un porcentaje del nivel de contaminación cultivando un control positivo (PC) y dejándolo proliferar. Esta es una valoración muy inexacta principalmente porque cada organismo tiene una tasa de crecimiento y muerte diferentes. Este test es bueno para establecer si hay otro organismo presente siempre y cuando se haya utilizado una técnica estrictamente aséptica, pero no se debería usar para determinar el porcentaje de contaminación. Dicho esto, es la contaminación realmente un problema en la medida en que impactaría negativamente sobre el rendimiento previsto del BI?. Echemos un vistazo a lo que dicen las normas respecto a la pureza del BI.
3 USP 37, Capítulos generales: <1035> INDICADORES BIOLÓGICOS PARA ESTERILIZACIÓN Los portadores y envases primarios no deberán tener ningún tipo de contaminación (física, química o microbiana) que pudiera afectar el rendimiento o las características de estabilidad del indicador biológico. USP 37, Monografías: Indicadores biológicos para calor húmedo, calor seco y métodos gaseosos de esterilización, portadores no de papel Pureza No hay evidencia de contaminación con otros microrganismos tras el examen de las esporas recuperadas del portador usando un medio de cultivo adecuado en placa. USP 37, Monografías: Indicadores biológicos para esterilización por óxido de etileno, portador de papel Pureza Tras el examen de las esporas en un medio de cultivo adecuado en placa, no hay evidencia de contaminación con otros microrganismos. ANSI/AAMI/ISO :2006, Esterilización de productos sanitarios Indicadores biológicos Parte 1: Requisitos generales Sistemas de calidad El fabricante establecerá, documentará y mantendrá un sistema de calidad formal (p.ej. ISO 13485, buenas prácticas de fabricación (GMP) u otros requisitos nacionales o regionales) para cubrir todas las operaciones requeridas por esta parte de la ISO En particular, el fabricante deberá tomar precauciones en todas las fases de la producción para minimizar la contaminación que podría afectar negativamente al rendimiento del indicador biológico. 5.2 Portador, envases primario y secundario Los materiales del portador y los envases primario y secundario no deberán tener ningún tipo de contaminación (física, química o microbiana) que pudiera afectar negativamente al rendimiento del indicador biológico. 5.3 Portador inoculado Sólo se usará una cepa del organismo de ensayo en un lote de portadores inoculados, a menos que el fabricante demuestre que el uso de múltiples cepas no afecta significativamente al rendimiento del organismo de prueba en el proceso de esterilización especificado. Al evaluar el tema de la contaminación, la postura de Mesa Lab es normalmente que la contaminación no tendrá un efecto negativo sobre la función de resistencia del BI. Esto es especialmente cierto si la contaminación se produjo durante el proceso de fabricación del BI. Si el contaminante se capta por una técnica de asepsia inadecuada o si se trata de contaminación aerotransportada durante el cultivo, el tipo de problema que se plantea es completamente diferente, pero el impacto sobre el rendimiento del BI no es necesariamente negativo. Cuando se contempla desde el punto de vista de la función de resistencia, el valor D se define como el tiempo o dosis requeridos para conseguir la inactivación del 90% de la población del microrganismo de ensayo en condiciones de dosis establecidas. Por lo tanto, considerando un EtO BI típico que contiene 1.0 x 10 6 esporas de Bacillus atrophaeus tiene un valor D de unos 3,5 minutos, aunque estuviera contaminado con 100 CFUs por BI y esos microbios contaminantes tuvieran una resistencia equiparable a la del microrganismo de prueba, el contaminante sería eliminado en las primeras fases de la exposición, con prácticamente cero posibilidades de sobrevivir a la especie de ensayo.
4 Sin embargo, siguen surgiendo preguntas tales como cuál es la resistencia de algunos de estos organismos? y cómo sabemos a ciencia cierta que no hay impacto sobre la función de resistencia?. Para evaluar este aspecto, se comprobó la resistencia al óxido de etileno de cuatro organismos diferentes. Dos de los organismos, Bacillus cereus y Bacillus thuringiensis, fueron captados porque son contaminantes formadores de esporas que se aíslan comúnmente. Los otros dos organismos, Bacillus subtilis 5230 y Bacillus pumilus, fueron seleccionados al azar sin ninguna razón específica, aparte de ser otros dos formadores de esporas mesofílicas. Para la prueba, se fabricaron cuatro lotes de BIs de tiras de esporas MesaStrip con cada uno de los cuatro organismos usando una población En cada lote se realizó un ensayo de población y seguidamente un análisis de fracción negativa usando un resistómetro evaluador del indicador biológico del óxido de etileno (BIER) y 10 unidades/exposición para cada lote. Las diez unidades de cada lote fueron expuestas en el mismo ciclo. Se dejó que las unidades se airearan adecuadamente y se cultivaron en caldo de soja tríptica (TSB) a 30ºC 35ºC durante 7 días. A lo largo de esos 7 días se registraron los datos y se calcularon los valores D post incubación usando el método de Stumbo Murphy y Cochran. Los resultados se muestran en la tabla 1. Tabla 1: Resistencia al óxido de etileno de las esporas mesofílicas Organismo Población Valor D (en minutos) Bacillus atrophaeus 2.7 x Bacillus sub0lis x Bacillus cereus 3.5 x Bacillus pumilus 3.0 x Bacillus thuringiensis 3.1 x Se realizó otro test para determinar si la presencia de esporas en el BI afecta a la función de resistencia indicada en el CofA. Para este estudio se seleccionaron dos organismos, Bacillus cereus y Bacillus subtilis Las tiras MesaStrips de Bacillus atrophaeus se sacaron de la bolsa de papel glaseado y cada tira fue inoculada con 10 6 esporas de cada organismo. Las tiras se dejaron secar durante la noche y luego se volvieron a meter en los sobres de papel glaseado. Se efectuó un análisis de fracción negativa usando un recipiente BIER de óxido de etileno y 10 unidades/exposición para cada lote incluyendo tiras MesaStrips que sólo contenían Bacillus atrophaeus. Todos los lotes fueron expuestos en el mismo ciclo. A continuación, se dejó que las unidades se airearan adecuadamente, se cultivaron en TSB y se incubaron a 30ºC 35ºC durante 7 días. En esos 7 días, se registraron los datos y se calcularon los valores D post incubación usando el método de Stumbo Murphy y Cochran. Al concluir los 7 días, los tubos positivos del ciclo más largo que daban datos fraccionales fueron sembrados por extensión para el aislamiento con el fin de confirmar la presencia única de Bacillus atrophaeus. Todas las placas presentaron únicamente crecimiento de Bacillus atrophaeus. La función de resistencia se muestra en la tabla 2. Tabla 2: Resistencia de las tiras de Bacillus atrophaeus inoculadas con otro organismo Configuración del BI Valor D (en minutos) solo Bacillus atrophaeus 3.8 Bacillus atrophaeus inoculado con 10 6 esporas de Bacillus cereus 3.9 Bacillus atrophaeus inoculado con 10 6 esporas de Bacillus sub0lis
5 Los datos expuestos anteriormente reafirman la posición de Mesa Lab respecto a la pureza y la contaminación. Todos los organismos ensayados presentaron una resistencia inferior a la del Bacillus atrophaeus (datos de la tabla 1). Incluso si los BIs estaban extremadamente contaminados con otro organismo, los datos de este estudio indican que el cambio sobre la medición general de la resistencia es insignificante ya que, como demuestran los datos de la tabla 2, sólo hay un aumento de 0,1 minutos respecto al valor D medido. Vale la pena señalar que los criterios de aceptación de pureza de Mesa Lab requieren un nivel de %. Esto equivale a no más de un microbio contaminante por cada millón de esporas de ensayo en el BI. De los datos presentados anteriormente resulta evidente que se trata de un nivel de aceptación muy razonable y excesivamente conservador. Los controles del proceso se implementan en cada paso del proceso de fabricación de los BI para asegurar que somos capaces de alcanzar este nivel de pureza. En resumen, si uno se hace a sí mismo cualquiera de las siguientes preguntas, puede sentirse seguro con las respuestas que aparecen a continuación. Está mi BI OK para ser utilizado con estos bajos niveles de contaminación? Respuesta: Sí Afectará a mi proceso? Respuesta: No Cumplo las normas establecidas en la USP y en la ISO? Respuesta: Sí Beth se graduó en la University of Montana con un B.S. en Microbiology and Medical Technology. Trabaja para Mesa Labs (anteriormente SGM Biotech) desde hace nueve años y ha ocupado puestos en el laboratorio de producción de BI, Investigación y desarrollo y estudios por contrato. El puesto anterior de Beth era Spore Lab Supervisor y actualmente es Director of Laboratory Production. SPORES DON T LIE Sírvanse indicarnos qué temas desearían que abordásemos en Spore News.
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