ADAPTACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR BHK21 CLON 13 AL CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN PARA VACUNAS VIRALES PORCINAS

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1 ADAPTACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR BHK21 CLON 13 AL CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN PARA VACUNAS VIRALES PORCINAS O. Leiva, F. Lorenzo, R. Calderón, R. Barrero y R. Gálvez Empresa de Producciones Virales y Bacterianas UP7, Grupo Empresarial LABIOFAM. La Haana, Cua osneylp@infomed.sld.cu RESUMEN Este traajo tuvo como ojetivo la otención de un cultivo celular en suspensión a partir de la adaptación de la línea celular estacionaria BHK21 C13, exriñón de hámster. Las condiciones de cultivo fueron las siguientes: volumen final de 8 ml, temperatura de incuación 37ºC y agitación de 3 rpm. La concentración inicial de células en cada pase fue de 1x1 6 células/ml. Se sustituyó el uso del suero fetal ovino a través del aumento creciente del suero de ternero en cada pase celular en medio de cultivo Eagle MEM (medio mínimo esencial, acrónimo en inglés). Se determinó la cinética de crecimiento de las células BHK21 C13 durante un período de 12 horas. Las células se adaptaron al crecimiento en suspensión a partir del tercer pase aproximadamente. El perfil de crecimiento de las células de BHK21 C13 mostró que la fase exponencial de crecimiento de las células duró 72 horas, oteniendo una densidad celular de 42x1 6 células/ml. A partir de ese momento comenzó la fase de meseta Se otuvieron diferencias significativas (P<.5) en el crecimiento de las células suplementadas con suero de ternero con respecto al control suplementado sólo con suero fetal ovino. Mediante este estudio se logró la otención de un cultivo en suspensión de las células BHK 21 clon13 en condiciones experimentales cuanas. El uso futuro de las células en suspensión de BHK21 C13 proveerá un método simple y eficiente para la propagación viral en la producción de vacunas porcinas. Palaras claves: BHK21 C13, cultivo en suspensión, vacuna, virus Título corto: Crecimiento en suspensión de la línea celular BHK21 clon 13 ADAPTATION OF THE BHK 21 C13 CELL LINE TO THE GROWTH IN SUSPENSION FOR PIG VIRAL VACCINES SUMMARY The aim of this work was to assess a cell culture suspension from the BHK21 C13, exhamster kidney, cell line adaptation for pig viral vaccines manufacture. Culture conditions were the following: final volume of 8 ml, incuation temperature of 37 ºC and 3 rpm of speed agitation. Initial cell concentration in all transferences was 1x1 6 cells/ml. The use of foetal ovine serum was replaced y calf serum increase in cell transference in culture medium of Eagle MEM (minimal essential medium). Growth kinetics of BHK21 C13 cells was determined during a period of 12 hours. Cells were adapted to the suspension growth approximately in the third transference. The growth profile of BHK21 C13 cells showed the exponential growth phase during 72 hours and maximum cell density was 42x1 6 cells/ml. Thereafter the plateau phase was initiated. There were significant differences (P<.5) for growth of cells supplemented with calf serum with respect to the control only supplemented with foetal ovine serum. In conclusion, the herein descried technique allowed the assessment of a BHK21 C13 suspension culture according to the designed Cuan experimental conditions. The future use of BHK21 C13 cells in suspension cultures will provide a simple and efficient method for viral propagation for development of porcine vaccines production. Keywords: BHK21 C13, suspension culture, vaccine, virus Short title: Growth in suspension of the BHK21 C13 cell line 312

2 INTRODUCCIÓN La alta demanda de la producción de vacunas requiere de sistemas de ioproducción estales y de alto rendimiento así como de la implementación de nuevas tecnologías (Slivac et al 26). Los cultivos celulares son el modelo iológico utilizado para la replicación viral requerida en la producción de muchas vacunas veterinarias (Chapman y Ramshaw 1971; Prodafikas y Plavsic 2). En el proceso de estalecimiento de un cultivo celular se seleccionan las células que crecerán según numerosos criterios. Así solo formarán el cultivo aquellas células que sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación y por otra capaces de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o suspensión (Reina 23). Por otra parte, las suspensiones celulares ofrecen ventajas como sistema de propagación masiva por las altas tasas de multiplicación que presentan, una mayor homogeneidad en las condiciones de cultivo y posiilidad de automatización (Durán 25; Hermoso y Menéndez 2). La línea celular continua de riñón de neonatos de hámster (BHK21) es susceptile a varios tipos de virus (Prodafikas y Plavsic 2), entre los que se encuentran: el virus de la encefalomiocarditis porcina (Durán et al 25), de la peste porcina clásica y de la enfermedad de Aujeszky (Slivac et al 26). El ojetivo de este estudio fue lograr la otención de una sulínea celular en suspensión a partir de las células de BHK21 clon13 para en el futuro optimizar el rendimiento de la producción de vacunas virales porcinas que emplean este tipo de células en condiciones cuanas de traajo. MATERIALES Y MÉTODOS Línea celular La línea original BHK21 C13 se derivó de los riñones de cinco hámsters de sexo no determinado, en 1961 (Hernández y Brown 21). Las células BHK21 C13 usadas en este estudio (BHK21 C13 CCL-1) fueron otenidas y certificadas por la ATCC (American Type Culture Collection) en el pase 53 en el año Medio de cultivo Las células fueron cultivadas en el medio Eagle MEM (medio mínimo esencial con glutamina y aminoácidos no esenciales) al 9% (SIGMA 25), suplementado con caldo triptosa fosfato (CTF) al 1% (SIGMA 25), L-glutamina, 1%(SIGMA 25), icaronato de sodio, 1% (SIGMA 25) y suero fetal ovino (SFB) al 1% (SIGMA 25), durante los primeros pases o sucultivos realizados, para comenzar la adaptación de las células al cultivo en suspensión.. No fueron usados antiióticos. Esterilidad Se controló la esterilidad durante todo el estudio. Muestras de 1 ml de las suspensiones celulares de cada uno de los pases realizados, fueron inoculadas con pipetas estériles desechales en los medios de cultivo caldo triptona de soya y tioglicolato de sodio (SIGMA 25), los cuales fueron oservados durante 15 días consecutivos. Las muestras inoculadas en caldo triptona de soya se mantuvieron a temperatura amiente mientras que las inoculadas en el medio tioglicolato de sodio fueron incuadas a 37ºC. Adaptación de las células al crecimiento en suspensión Una monocapa celular de la línea estacionaria BHK21 C13 proveniente de un frasco roux de 225 cm 2 fue desprendida empleando el método de dispersión enzimática, utilizando tripsina al.25% en solución con verseno (EDTA) al.2% (SIGMA 25). Estas células fueron sucultivadas en medio de cultivo en agitación, con un volumen inicial de 1 ml en tres frascos roux de cultivo celular estéril (Nunc) de 25 cm 2 de área. Para los pases o sucultivos, las células de cada frasco fueron utilizadas nuevamente en el próximo cultivo; no se desechó ninguna célula y se vertieron asépticamente en el nuevo frasco junto con el medio de cultivo fresco. Cada 24 horas se aumentó el volumen de medio de cultivo al dole del volumen inicial hasta alcanzar un volumen final de 8 ml en tres frascos erlenmeyer. A partir de este momento las condiciones de cultivo fueron las que aparecen en la tala 1. Tala 1. Condiciones de cultivo de células BHK21 clon13 en un medio en suspensiòn Valor Volumen final, ml 8 Temperatura de incuación, ºC 37 Velocidad de agitación, por minuto 3 ph inicial 7.2 Tiempo entre distintos pases, horas 24 Las correcciones de ph se realizaron con una solución de NaHCO 3 al 7.5% y cuando fue necesario se almacenaron los cultivos a 4 C deido fundamentalmente a que en el momento de realizar el próximo sucultivo se correspondía con un día no laorale. La concentración inicial de células en cada sucultivo con volumen de 8 ml fue de 1 x 1 6 células/ml. Las muestras fueron tomadas diariamente para realizar la determinación de la concentración y viailidad celular. Conteo celular Para la determinación de la concentración y viailidad celular las células fueron contadas en cámara de Neuauer (Martínez et al 1989) mediante el método de exclusión de tripán azul, Concentración = [número de células contadas/número de cuadrantes] x 1 4 x factor de dilución Las células viales son impermeales al tripán azul por lo que se oservan sin teñir al microscopio mientras que las células no viales se oservan teñidas de azul. La determinación de la densidad celular fue realizada por espectrofotometría con luz visile. Se aplicó la ley de volumetría C 1 V 1 = C 2 V 2 para calcular la concentración del inóculo del siguiente pase. 313

3 Adaptación de las células al crecimiento en suspensión con suero de ternero distintos pases del cultivo, ni tampoco huo más camios en la morfología celular oservada. Para lograr la adaptación de las células de la línea BHK21 C13 al crecimiento en el medio de cultivo en suspensión ya descrito (vode supra), fueron realizados pases crecientes en cuanto a la concentración del suero de ternero en el medio de cultivo suplementado. La distriución del 1% del suero animal entre los distintos pases del cultivo fue la que se muestra en la tala 2. Tala 2. Distriuciòn del 1% del suero animal entre los distintos pases del cultivo en suspensiòn Relaciòn SFB, % 1 ST, % 1: 1-3: : : :1-1 SFB y ST expresan suero fetal ovino y suero de ternero, en ese orden Durante este nuevo período de adaptación las células de la línea BHK21 C13 fueron mantenidas ajo las mismas condiciones de cultivo celular descritas anteriormente. Tasa de crecimiento celular a a Número de pases en suspensión Para el estudio del perfil de crecimiento celular de la sulínea de BHK21C13 fueron semradas células a una concentración inicial de 1x1 6 células/ml en un frasco erlenmeyer de 1 L con 4 ml de medio de cultivo. Este frasco fue mantenido ajo las mismas condiciones de cultivo celular descritas anteriormente, solo que el tiempo de incuación fue extendido hasta 12 horas. Se determinó la concentración y viailidad celular cada 24 horas (Helgason 23). Procesamiento estadístico Los datos fueron procesados mediante un análisis de varianza simple (Steel y Torrie 198), con el concurso del paquete estadístico Statgraphic (21) versión 5.1. En caso de existir diferencias entre las medias se utilizó la pruea de comparación múltiple Newman-Keuls (Newman 1932; Keuls 1952). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Adaptación al crecimiento celular en suspensión. Los experimentos realizados en este estudio permitieron la otención de la sulínea celular BHK21 C13 a partir de la línea celular estalecida del mismo nomre; ya que se otuvo a partir de una selección celular producto de la modificación del sistema de crecimiento de dicha línea a través de un proceso de adaptación (Mather y Roerts 1998). La figura 1 muestra la adaptación de la línea BHK21 C13 al cultivo en suspensión aproximadamente a partir del tercer pase en un volumen de 8 ml. Desde este momento no huo diferencias significativas (P>.5) con respecto a la concentración final alcanzada por las células entre los Figura 1. Adaptación de la línea BHK 21 C13 al cultivo en suspensión a, Medias sin letra en común difieren entre sí significativamente (P<.5 ) Es importante destacar que durante los primeros pases realizados en frascos de cultivo celular con volúmenes de 1 ml, no se formaron demasiadas agrupaciones de células ni tampoco se adhirieron en grandes cantidades a la superficie del frasco, lo cual no concuerda con lo informado por Davis et al (1971) ya que dichos autores plantearon la formación de agregados o racimos celulares durante varios pases del cultivo. Sin emargo, esto pudo estar influenciado por los medios de cultivos empleados y a la cantidad de células inoculadas en cada pase, deido al volumen final de medio de cultivo empleado por dichos autores, el cual fue de 4 ml desde el inicio del estudio realizado por ellos. En las condiciones experimentales aquí descritas, una vez aumentado el volumen de medio de cultivo a 8 ml tampoco aparecieron demasiadas células adheridas al cristal del frasco. La proliferación celular oservada fue adecuada y el medio de cultivo no se acidificó como consecuencia del metaolismo celular, en parte gracias al ph estalecido en el medio de cultivo, 7.2, desde el inicio del estudio. Este resultado difiere del hallado por Akatov et al (1991) estos autores plantearon que la proliferación de las células en suspensión de la línea BHK21 C13 en presencia de icaronato ocurre a un valor medio de ph 6.76 ±.2. La adaptación de las células al crecimiento en cultivo en suspensión concuerda con lo informado por múltiples autores que han adaptado la línea BHK 21 C13 a este tipo de sistema de crecimiento con diversos ojetivos (Radlett et al 1985; Perrin et al 1995; Amadori y Berneri 1993; Gaurina et al 24). 314

4 Adaptación al crecimiento celular con suero de ternero Las células de la sulínea celular BHK21 C13 fueron adaptadas al crecimiento en el medio de cultivo MEM A suplementado con suero de ternero, con lo que se sustituyó de esta forma el uso de suero fetal ovino. La figura 2 muestra el efecto del suero de ternero en el crecimiento de las células en suspensión de la sulínea BHK 21 C13. Tasa de crecimiento celular El estudio de la cinética de crecimiento de las células de la sulínea BHK 21 C13 se realizó durante 12 horas partiendo de una concentración inicial celular de 1x1 6 células/ml en un volumen de 4 ml. Se determinó la concentración celular cada 24 horas durante el tiempo de análisis. La figura 3 presenta la tasa de crecimiento del cultivo en suspensión I II III IV V Relación SFB/ST Figura 2. Efecto del Suero de Ternero en el crecimiento celular en suspensión de BHK 21C13 SBT/ST expresan la relación suero fetal ovino/suero de ternero en las proporciones detalladas en la tala 2 A excepción del SFB 1%, las restantes relaciones mostraron diferencias significativas (P<.5) según la pruea de rango múltiple aplicada. Se oservó además que desde la primera vez que se suplementó el medio de cultivo con suero de ternero en la relación 3:1, se otuvieron diferencias significativas (P<.5) en cuanto al crecimiento celular final alcanzado con respecto al control celular suplementado solo con suero fetal ovino (relación 1:). Si se tiene en cuenta la importancia de los sueros animales como suplemento de medios de cultivos celulares y además el por ciento en gramos de proteínas totales aportadas por cada uno de los sueros animales usados en este estudio, SFB, y ST, 4.5-6, de acuerdo con SIGMA (25) entonces el resultado otenido tendría una mejor explicación, ya que se conoce que el suero aporta entre estas proteínas totales, factores nutritivos, hormonales y de crecimiento, que son imprescindiles para el mantenimiento del cultivo celular (Reina 23). Este resultado está en concordancia con los de otros autores que han otenido cultivos en suspensión de la línea BHK21 C13 suplementados con suero de ternero (Davis et al 1971; Pardo et al 2; Prodafikas y Plasvic 2). Esta adaptación permite disminuir los costos de la producción, y se otiene un crecimiento celular superior al otenido con el empleo de suero fetal ovino. Tiempo (Horas) Figura 3. Tasa de crecimiento en suspensión de la sulínea de BHK 21 C13 Pudo oservarse que la concentración celular aumentó aproximadamente hasta las 72 horas manteniendo la fase exponencial de crecimiento, para comenzar entonces la aparición de una aparente fase estacionaria o de meseta, donde la concentración final máxima alcanzada fue de 44x1 6 células/ml. Este período de tiempo pudiera utilizarse para otener las células que funcionarían como inóculo en los próximos envases celulares de la producción, ya que en este momento el número de células que mueren no es notale con respecto a las que se están dividiendo al incrementar la polación celular. Las células tomadas en esa fase de crecimiento muestran un período de latencia menor al ser sucultivadas porque no necesitan nueva síntesis de enzimas para el aprovechamiento de los nutrientes extracelulares ya que el medio de cultivo es el mismo (medio de cultivo MEM). Este resultado no difiere de lo encontrado por otros autores quienes tamién oservaron similar comportamiento de células en suspensión de BHK 21 C13 (Prodafikas y Plasvic 2; Slivac et al 26), deido a que las líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un período de adaptación. Mediante este estudio se logró la otención de una sulínea celular en suspensión a partir de la línea estacionaria BHK 21 C13 en condiciones cuanas experimentales para en el futuro 315

5 optimizar la productividad de vacunas virales porcinas que emplean este tipo de células en Cua. AGRADECIMIENTOS Los autores de este traajo queremos expresar nuestro agradecimiento a la Sra Clara Norka Hernández, de la Empresa Productora de Vacunas Virales y Bacterianas del Grupo Empresarial LABIOFAM, Cua, deido a la experiencia teórica que aportó a este estudio. REFERENCIAS Amadori, M. y Berneri, C Genotypic and phenotypic changes of BHK-21 cells grown in suspension cultures. Cytotechnology, 11:21-25 Akatov, V., Groova, M. y Koshevoĭ, V Intracellular ph and the proliferation of BHK-21 cells. Tsitologiia, 33: Chapman, W. y Ramshaw, A Growth of the IB-RS-2 pig kidney cell line in suspension culture and its susceptiility to foot-and-mouth disease virus. Applied Microiology, 22:1-5 Davis, J., Hodge, H. y Campell, W Growth of Chikungunya virus in ay hamster kidney cell (BHK-21-clone 13) suspension cultures. Applied Microiology, 21: Duran, R., Valle, A., Viña, X. y Mujica, B. 25. Importancia iológica en la multiplicación de las líneas celulares estales: III. Tipos y líneas Revista Digital CENIAP HOY Número 9. Venezuela. Versión electrónica disponile en el sitio: an_r.htm Gaurina, V., Cajavec, S., Sladic, D. y Kniewald, Z. 24. BHK 21 C13 cells for Aujeszky s disease virus production using the multiple harvest process. Cytotechnology, 45:11 16 Helgason, D. 23. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Humana Press (third edition), 29:6-7 Hermoso, L. y Menéndez, A. 2. Multiplicación masiva del café (Coffea araica L. cv. Catimor) mediante cultivo de suspensiones celulares emriogénicas. Acta Científica Venezolana, 51:9-95 Hernández, R. y Brown, D. 21. Growth and maintenance of ay hamster kidney (BHK) cells. Current Protocols in Microiology,17:1-7 Keuls, M Use of the "Studentized Range" in connection with an analysis of variance. Euphytica, 1: Mather J. y Roerts P Introduction to Cell and Tissue Culture: Theory and Technique. Plenum Press. New York, p Martínez J., Barrio, G. y Pasos, V Microiología General. Editorial Puelo y Educación. La Haana, pp 16 Newman, D The distriution of range in samples from a normal population, expressed in terms of an independent estimate of standard deviation. Biometrika, 31:2-3 Pardo, G., Almora, E., Fidalgo, O., Zamora, A., Rodríguez, N. y Pérez, E. 2. Ensayo in vivo para determinar agentes extraños en células BHK-21 empleadas en la otención de iológicos. VacciMonitor (aril/junio), 28:2 Perrin P., Madhusudana S., Gontier C., Petres, S., Tordo, N. y Merten, O An experimental raies vaccine produced with a new hk-21 suspension cell culture process: use of serum-free medium and perfusion-reactor system. Vaccine, 13: Prodafikas, G. y Plasvic, M. 2. Effects of medium supplements on BHK21 cell growth and luetongue virus production. Focus, 22:18 Radlett, P., Pay, T. y Garland, A.J The use of BHK suspension cells for the commercial production of foot and mouth disease vaccines over a twenty year period. Development Biological Standard, 6: Reina, M. 23. Técnicas de estudio de líneas celulares. Introducción al cultivo celular. Capitulo1. Versión electrónica disponile en el sitio:: SIGMA. 25. Sigma-Aldrich. Biochemical and Reagents. Saint Louis (Missouri), p 435, 551, 78, 92, 1826, 1852, 235 Slivac, I., Gaurina, V. y Radošević, K. 26. Aujeszky s disease virus production in disposale ioreactor. Biosciences, 31: Statgraphics. 21. Version 5.1 HelpLine. Maryland, versión electrónica disponile en el sitio: Steel, R.G.D. y Torrie, J.H Principles and Procedures of Statistics. A Biometrical Approach. McGraw and Hill Book Company In Company. Toronto, pp