Immunreactive Trypsin neonatal Screening ELISA

Transcripción

1 Instrucciones de Uso Immunreactive Trypsin neonatal Screening ELISA Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa de tripsina inmunoreactiva a partir de muestras de manchas de sangre. IM58012 IM C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 I. USO PROPUESTO El juego de reactivos ELISA para tripsina-mw de mancha de sangre está diseñado específicamente para medir la tripsina inmunoreactiva humana (TIR) a partir de muestras de manchas de sangre recolectadas en papel de filtro Schleicher and Schuell Nº 903. II. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES En principio, la tripsina se sintetiza y se secreta desde las células acinares del páncreas exócrino como la precursora o proenzima, tripsinógeno (MW: ). Se han reconocido dos isoenzimas del tripsinógeno. Ambas formas se convierten a tripsina enzimáticamente activa por la acción de la enterocinasa duodenal. En presencia de iones CA ++, esta enterocinasa elimina el hexapéptido Val-(Asp)4-Lys del tripsinógeno, liberando las formas activas de tripsina. Tres inhibidores específicos de la actividad enzimática de la tripsina están presentes en la sangre: á 1 -antitripsina, á 2 -macroglobulina e inter-á-tripsina. Dado que la competencia e inhibición variable de la tripsina en el suero se produce entre los factores endógenos y el anticuerpo específico de tripsina empleado, y debido a que parte del tripsinógeno ingresa en la circulación sin modificación, el examen ELISA para tripsina-mw es coherente con el ensayo informado anteriormente al describir su especie medida como actividad similar a la tripsina inmunoreactiva total o TIR. Como muestra, el ensayo utiliza un disco de papel de filtro de 3 mm que se perfora y extrae. El ensayo consiste en realizar una incubación durante toda la noche más una hora y cuarto. El ensayo puede automatizarse usando los equipos de extracción de discos, transvasado con pipeta y lavado de placa. Debe determinarse un rango normal para cada laboratorio, coherente con los reactivos inmunes que se utilicen. Actualmente, debido a los distintos valores de calibración entre los diferentes sistemas de ensayos, es difícil encontrar un rango normal universal. III. PRINCIPIO DEL ANÁLISIS ELISA PARA TRIPSINA-MW El kit ELISA para tripsina-mw utiliza una técnica de ensayo inmunoabsorbente unido por enzimas (ELISA) para cuantificar la tripsina humana en una muestra de mancha de sangre. En los ensayos ELISA, se utilizan dos anticuerpos complementarios contra distintas porciones del mismo antígeno. En el ELISA, un sistema de anticuerpos se une al pocillo de la microplaca y el otro anticuerpo se marca con una enzima. Cuando el antígeno se encuentra presente, se unen simultáneamente ambos anticuerpos en forma de puente o sándwich. Todo el complejo continúa unido al pocillo. Después de lavar la enzima no unida, se agrega un sustrato específico y se convierte a un producto final coloreado; la reacción finaliza rápidamente con solución de parada. La absorbencia se lee para cada pocillo en 450 nm y los resultados se determinan como concentración de TIR en ng/ml frente a la absorbencia sobre papel milimetrado. En el procedimiento, se extrae un disco de una mancha de sangre recolectada en papel de filtro Schleicher and Schuell Nº 903. Este disco se coloca en el pocillo con anticuerpo, junto con una disolución Buffer de Elución. Después de la incubación durante toda la noche, la Solución Buffer de Elución y la mancha de sangre se aspiran, se lava el pocillo y se agrega el anticuerpo con la enzima marcada. Después de una segunda incubación, se lava el pocillo y se le agrega el sustrato. La reacción enzimática finaliza rápidamente con la solución de parada, y se lee la absorbencia. Luego se crea una curva estándar con la que se pueden calcular las concentraciones desconocidas de tripsina. El anticuerpo anti-tir de conejo Lo que es más importante, el kit ELISA para TIR de mancha de sangre utiliza el anticuerpo TIR con sus características específicas con respecto a las formas moleculares de TIR. (23-27) Desde el desarrollo original del anticuerpo policlonal para TIR, gracias a una subvención del NIH, hemos informado de distintas maneras sobre aspectos únicos de nuestro anticuerpo en su reactividad mejorada como una forma patológica de TIR con relación a la forma normal de circulación. Esta especificidad patológica es independiente de las diferencias cuantitativas en el valor absoluto de los estándares utilizados y es una función del anticuerpo. Los resultados del análisis extensivo del anticuerpo sugieren que el TIR patológico con respecto a su especie molecular o interacciones demuestra una mayor potencia con nuestro anticuerpo que la tripsina intacta purificada. Version 5/05 1/6

3 IV. REACTIVOS INCLUIDOS EN EL KIT NOTA: Los siguientes reactivos se incluyen en el ensayo ELISA para tripsina de mancha de sangre con un solo kit (Nº de catálogo IM placas) y en el ensayo a gran escala (Nº de catálogo IM placas). Las cantidades para los reactivos del ensayo a gran escala se especifican en cursiva. A. Placas con micropocillos recubiertas de tripsina anti-humana policlonal MTP (96 pocillos) 2 cada uno (20 cada uno): La estabilidad de las tiras no abiertas es la fecha de vencimiento indicada en el kit a 2-8 C después de abrir la bolsa sellada. B. Conjugado Enzimático del análisis ELISA para tripsina ENZCONJ CONC Concentrado 0.5 ml (5.0 ml): Peroxidasa de rábano picante conjugado con anticuerpo antitripsina monoclonal en disolución Buffer de Fosfato, ph 7.4. Para usarlo, verter todo el contenido de la ampolla de Diluyente Enzimático en la ampolla del concentrado de enzimas, tapar la ampolla y girarla con cuidado varias veces para mezclar. La estabilidad del reactivo enzimático diluido es de una semana (7 días) a 2-8 C. La estabilidad del Conjugado Enzimático que se encuentra cerrado se indica en la etiqueta. 1. Ensayo con kit individual: Para usarlo, verter todo el contenido de la ampolla del Diluyente Enzimático en la ampolla del concentrado de enzimas, tapar la ampolla y girarla con cuidado varias veces para mezclar. La estabilidad del reactivo diluido es de una semana (7 días) a 2-8 C. La estabilidad del concentrado de enzimas que se encuentra cerrado es la indicada en la etiqueta. 2. Ensayo con kit a gran escala: Para su uso, diluir el concentrado de enzimas (x 50) en un Diluyente Enzimático. Por ejemplo: 4 placas = 45 ml de enzima diluida. Diluir 0:9 ml del concentrado de enzimas en un volumen total de 45:0 ml de Diluyente Enzimático. Mezclar bien para usar. La estabilidad del reactivo enzimático diluido es de una semana (7 días) a 2-8 C. NOTA: Debe tenerse cuidado al retirar la tapa de la ampolla para que no se pierda el concentrado de enzimas adherido a la tapa. Si se necesita más de una ampolla de reactivo enzimático, mezclar toda la enzima diluida antes de usar. C. Estándares CAL 1-7 [7 niveles], Controles CONTROL 1-3 [3 niveles] 1 tarjeta cada uno (5 tarjetas cada uno): Sangre completa adicionada con tripsina humana en papel de filtro. Las concentraciones son las indicadas en la etiqueta. La estabilidad de la tarjeta sin abrir es la indicada en la etiqueta. La estabilidad de la tarjeta una vez abierta la bolsa es la misma que la indicada como vida útil del kit a menos de 15 C. NOTA: Los niveles reales de calibración pueden variar entre los lotes. Debe consultarse la etiqueta en el lote actual de Estándares para conocer los valores de calibración que se usarán en los cálculos. D. Disolución Buffer de Elución ELUTINGBUF 40.0 ml (400.0 ml): La estabilidad de la disolución Buffer es la indicada en la etiqueta a 2-8 C. E. Diluyente Enzimático ENZDIL 22:0 ml (220.0 ml): La estabilidad, cuando se usa con el concentrado de enzimas, es de una semana a 2-8 C. F. Solución de Parada STOP 22.0 ml (220.0 ml): H 2 SO 4 en agua desmineralizada. La estabilidad es la indicada en la etiqueta a 2-8 C. G. Solución de sustrato SUBS 22.0 ml (220.0 ml): 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) lista para usar. La estabilidad de TMB después de la apertura es de una semana a 2-8 C. H. Buffer de Lavado WASHBUF CONC Concentrado 50.0 ml (500.0 ml): Disolución Buffer de Fosfato que contiene 0.5 % de Tween 20. Diluir 10 veces (a 500 ml) con agua destilada antes del uso. La estabilidad de la disolución Buffer de Lavado diluida es la misma que la indicada como vida útil del kit a 2-8 C. NOTA: Por reglamento, la Solución Buffer de Lavado concentrada a gran escala está disponible para su uso en lavadoras automáticas. Version 5/05 2/6

4 ADVERTENCIA: MATERIALES HUMANOS Manejar como si pudieran transmitir infecciones. Se encontró que el material de origen del que deriva este producto no es reactivo para los anticuerpos HIV1, HIV2 y para HBsAg y Hepatitis C al probarse con reactivos con licencia a nivel de donantes. Ningún método de prueba conocido puede ofrecer seguridad con respecto a que los productos derivados de la sangre humana no sean infecciosos. Consulte la publicación Bioseguridad en laboratorios bioquímicos y microbiológicos de CPC/NIH (Publicación Nº CPC de HHS). ADVERTENCIA: AZIDA SÓDICA Estos reactivos contienen azida sódica, que tiende a acumularse en cañerías de plomo o cobre, lo que forma azidas metálicas potencialmente explosivas. Enjuagar siempre las cañerías con grandes cantidades de agua después de desechar estos reactivos. V. CALIBRACIÓN Y ESTANDARDIZACIÓN La cantidad de TIR en la muestra (mancha de sangre) se calcula con una curva estándar preparada a partir una cantidad conocida de tripsina calibrada por comparación con nuestros RIA para TIR de mancha de sangre bien establecidos. Actualmente, no existe preparación de referencia internacional para la tripsina. VI. VII. VIII. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO A. Para garantizar resultados precisos y confiables, asegurarse de que todos los discos con mancha de sangre estén dentro de la solución de reacción durante el período de incubación. B. Se recomienda cumplir estrictamente con el protocolo para obtener resultados confiables. Las modificaciones o los cambios realizados en el kit o en el procedimiento del ensayo son responsabilidad del usuario. C. Este ensayo está diseñado para usarse con muestras que se recolectan EXCLUSIVAMENTE en PAPEL DE FILTRO SCHLEICHER AND SCHUELL Nº 903. EQUIPO Y REACTIVOS NECESARIOS A. Lector de placas, con capacidad para leer absorbencia a 450 nm. B. Micropipetas y micropipetas multicanal calibradas a 100, 200 y 300 µl. NOTA: 200 µl o 300 µl es aceptable para la etapa de lavado. C. Lavadora de placas automáticas (opcional). RECOLECCIÓN Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE Transferir suficiente sangre al papel de filtro para llenar por completo, como mínimo, dos círculos. Es fundamental que la sangre penetre el papel de filtro hasta el otro lado. La sangre debe colocarse en el centro del círculo para permitir que se esparza hacia el exterior. Evitar rasgar o dañar la superficie del papel de filtro. Permitir que la muestra se seque al aire por completo (durante toda la noche) y no colocarla cerca de una fuente de calor, a la luz directa del sol o sobre superficies absorbentes. Una vez pasada la noche, las muestras ya secas deben almacenarse en sobres plásticos cerrados al vacío a menos de -15 C, hasta la realización del ensayo. Version 5/05 3/6

5 IX. ETAPAS DEL ENSAYO (se recomiendan duplicados) NOTA: Para usarse en un máximo de dos placas consecutivas. Para ensayos más largos, el tiempo de transvasado con pipeta debe retrasarse para garantizar el procesamiento uniforme de las placas. A. Para cada calibrador, control y desconocido, en duplicado: 1. Extraer un papel de filtro de 1/8 (3 mm) con mancha de sangre y colocar en los pocillos adecuados de las placas de tiras de microvaloración. 2. Agregar 200 µl de disolución Buffer de Elución a cada pocillo. 3. Cubrir la placa, agitar (suavemente) durante 30 segundos e incubar durante toda la noche a temperatura ambiente.* * Asegurarse de que ciertas manchas de sangre se sumerjan en la disolución Buffer de Elución. 4. Aspirar el contenido de todos los pocillos. Lavar 3 veces con 300 o 200 µl de disolución Buffer de Lavado y aspirar o agitar la placa hasta el secado después de cada lavado. 5. Agregar 100 µl de conjugado de enzimas diluido a cada pocillo. 6. Cubrir la placa, agitar suavemente con la mano (durante 30 segundos) e incubar durante una hora a temperatura ambiente. 7. Aspirar el contenido de todos los pocillos o agitar la placa hasta secar. 8. Lavar 3 veces con 300 µl de disolución Buffer de Lavado y aspirar o agitar la placa hasta el secado después de cada lavado. 9. Agregar 100 µl de Substrato recién preparado a cada pocillo. 10. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. 11. Agregar 100 µl de Solución de Parada a cada pocillo y agitar durante diez segundos, en forma horizontal y con la mano. 12. Leer la absorbencia a 450 nm y trazar en papel de gráfico semilogarítmico (absorbencia frente a concentración logarítmica en ng/ml). La absorbencia puede leerse en cualquier momento posterior al agregado de solución de parada, hasta un máximo de 60 minutos. X. CONTROL DE CALIDAD Los controles externos de mancha de sangre que contienen TIR en tres niveles diferentes (bajo, intermedio, alto) deben incluirse en forma rutinaria en cada ensayo. Los resultados del control deben registrarse y evaluarse mediante protocolos establecidos, por ejemplo, Westgard, J.O. et al., Clinical Chemistry 27: , Controles internos (del kit): Asimismo, los controles de tres niveles incluidos en el kit deben supervisarse en forma rutinaria para constatar que cumplan con los valores indicados. Los controles del kit ofrecen información valiosa con respecto a la manera en que se comporta el kit con relación a las especificaciones del fabricante. XI. CÁLCULOS E INTERPRETACIONES A. Leer las absorbencias de las muestras directamente de la curva como ng/ml de suero. En la Sección XII, se proporciona un ensayo de muestras y curva estándar. B. Las muestras con niveles de tripsina que superan el estándar más alto deben informarse como mayores que.... Version 5/05 4/6

6 XII. CARACTERÍSTICAS, PRECISIÓN Y CONFIABILIDAD DEL ENSAYO A. Ensayo de muestras Calibrador Calibrador o desconocido ng/ml Abs. Net.Abs. Gráfico NSB Nivel I Nivel II Nivel III B. Precisión La variabilidad intranalítica de las distintas muestras que contienen tripsina purificada se muestra en B1. La variabilidad interanalítica para las distintas muestras que contienen tripsina agregada o endógena (TIR) se muestra en B2. 1. Intra-Assay (Abs): Muestra n TIR ng/ml X Abs D.S. C.V. (%) A B C D Inter-Assay (TIR ng/ml): Muestra n TIR ng/ml D.S. C.V. (%) A B C D C. Recuperación Los porcentajes de recuperación de muestras estabilizadas a las que se agregaron cantidades conocidas de tripsina se muestran en la siguiente tabla. Muestra n TIR esperado TIR oberservado % ng/ml ng/ml recuperado A B C D Recuperación media Todas las muestras media = % D. Sensibilidad Dosis mínima detectable: La dosis mínima detectable de ensayo ELISA para TIR-MW de mancha de sangre es <5 ng/ml, tal como lo determina el análisis repetitivo del calibrador de cero. Version 5/05 5/6

7 XIII. COMPONENTES DE LOS ANTICUERPOS El kit ELISA para TIR de mancha de sangre utiliza una configuración de anticuerpo de captura policlonal en la microplaca y un anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasa de rábano picante complementario como marcador. El anticuerpo monoclonal se produce a partir de ratones inmunizados con tripsina humana. El anticuerpo policlonal se obtuvo inmunizando a conejos con tripsina. XIV. LITERATURA DE REFERENCIA SOBRE EL PRODUCTO 1. Adrian, T.E. et al., Clin. Chem. Acta. 97:205, Andrulli, A., et al., Dig. Dis. Sci. 26:532, Lake-Bakaar, G et al., Lancet i:66, Gamble, D. R. et al., J. Clin. Pathol, 32:897, Elias, E. et al., Lancet i:66, Adrian, T. E, et al., Gut. 19: A446, Healey, A. F., Watson D., Clin. Chem. 29:2011, Kirby, L. T. et al., Clin. Chem. 27: 678, Crossley, J. R. et al., Lancet, i March 3, 472, Kirby, L., et al., 29:1559, Travis, J. C., Unpublished observations, Fahrenkrug, J. et al., Clin. Chem. 27:1655, Koehn, H. D., A. Mostbeck, Clin. Chem 27:502, Travis, J. C., et al., Clin. Chem., 25,735, Coury, A. J., et al., Clin, Chem., 29:1593, Scwachwon, H., Mohmoodian, A., Clin. Chem., 25:158, Thompson, L. S., Clin. Chem. News, pg 8, Ryley, H. C., J. Clin, Pathol., 34:179, Margolies, R., Boat, T.F., Pediatr. Res., 17:931, Quissel, D. O., et al., Pediatr. Res., 17:899, Reiter, E. O., et al., Clin. Endocrinol., 16: Malvano, R. et al., Scand J. Gastroenterol., Supp. 62, 150:3, Travis, J. C., Poster III International Conference on NewbornScreening for Cystic Fibrosis, Oct. 5-6, 1988, CAEN, France. 24. Travis, J. C., Poster 7th National Neonatal ScreeningSymposium, Nov , 1989, New Orleans, LA. 25. Travis, J.C., Poster IVth International Conference on NewbornScreening for Cystic Fibrosis, Oct. 8-9, 1990, Estes Park,CO. 26. Travis, J. C., Poster 8th International Neonatal ScreeningSymposium and Inaugural Meeting of the International Societyfor Neonatal Screening, Leura, N.S.W., Australia, Nov , Travis, J. C., Poster 9th National Neonatal ScreeningSymposium, Raleigh, NC, April 7-11, Version 5/05 6/6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /