3.- TECNOLOGIA EN EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

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1 3.- TECNOLOGIA EN EL DIAGNOSTICO MOLECULAR INTRODUCCIÓN Pocas áreas de la Biología Molecular han permanecido inalteradas con la aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de técnicas moleculares. El objetivo de este capítulo consiste en realizar un repaso por una selección de las distintas técnicas empleadas en el diagnóstico molecular, incidiendo en su fundamento EXTRACCIÓN DE LOS ACIDOS NUCLEICOS Los ácidos nucleicos son las dianas que vamos a emplear para realizar todos nuestros ensayos y un primer paso en la mayoria de las técnicas moleculares es la obtención de éstos. Los ácidos nucleicos se pueden extraer de cualquier tipo de muestra, de hecho se han empleado muestras tan insignificantes como células epiteliales de saliva, pelos e incluso fósiles incluidos en ambar para buscar genes de antiguos animales prehistóricos u otros organismos ya extinguidos. Aunque existen muchos métodos de extracción de ácidos nucleicos y el proceso se encuentra automatizado en muchos laboratorios, creemos conveniente explicar el fundamento de la extracción Extracción de ADN Primeramente hablaremos de la extracción de ADN. El método clásico más conocido es la extracción con fenol-cloroformo y consta de tres etapas 1. Lisis celular 2. Eliminación de proteínas 3. Precipitación y limpieza del ADN La etapa de lisis consiste en desestabilizar las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido. Para ello se emplean unos tampones de extracción que contienen los siguientes compuestos: detergentes como el SDS o el Triton X100, que eliminaran membranas y lípidos; agentes quelantes como el EDTA que elimina los cationes de la solución, desestabilizando las membranas celulares e inhibiendo las ADNasas (enzimas que podrían degradar el ADN libre lisándolo en pequeños fragmentos); sales como el cloruro de sodio (NaCl) que forma una capa iónica alrededor del ADN protegiéndolo; un tampón como el Tris HCl que mantiene un ph de la solución estable y proteinasa K que degradará proteínas y enzimas. La lisis se suele realizar a temperaturas elevadas alrededor de 50ºC (nunca mayor de 80ºC, ya que a esta temperatura comienza a degradarse el ADN) facilitando la ruptura de lípidos de la membrana y por ende la liberación de ADN de la estructura celular.

2 Posteriormente se procede a la eliminación de proteínas que se realiza mediante la adición de una mezcla de fenol:cloroformo: alcohol isoamílico (proporción 50:49:1) y posterior centrifugación, lo que provoca que el ADN permanezca en el sobrenadante y en la interfase queden las proteínas. El fundamento es el siguiente: el fenol y el agua (solución acuosa donde se encuentra el ADN) no se pueden mezclar, por lo que el ADN que es muy polar debido a su carga negativa, permanecerá en la fase acuosa de la solución, mientras que las proteínas (formadas por grandes cadenas cuyos componentes elementales son aminoácidos algunos polares y otros no) quedarán tras la centrifugación en la interfase y en la fase orgánica debido a su polaridad. Hay que extraer el sobrenadante con cuidado para no arrastrar las proteínas. La precipitación y limpieza del ADN se realiza añadiendo al sobrenadante recuperado en el paso anterior una sal a alta concentración (p.ej. acetato de sodio, cloruro de sodio o acetato de amonio). Con la adición de la sal, el ADN que está cargado negativamente va a obtener una capa iónica positiva que facilitará su precipitación. Posteriormente añadiremos alcohol en la solución de precipitación para eliminar la concentración residual de sales y promover la precipitación del ácido nucleico, ya que el alcohol va a sustraerle las moléculas de agua al ADN y por tanto deshidratarlo Cuando se trata de muestras con baja concentración de ácidos nucleicos, comúnmente se utiliza isopropanol (volumen a volumen). La precipitación del ADN es casi inmediata en presencia de la sal y el alcohol, sin embargo se recomienda incubar la muestra durante varios minutos a -20ºC o -80ºC para acelerar el proceso de precipitación. Posteriormente, se centrifuga la muestra unos minutos para recuperar el precipitado de ADN, lavándose el pellet obtenido varias veces con etanol al 70% para eliminar todas las sales que permanezcan en la solución. Posteriormente se vuelve a centrifugar, se elimina cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y se deja secar para eliminar las trazas de alcohol. El ADN así obtenido es rehidratado con agua bidestilada o tamponada con tampón Tris.

3 Esquema de extracción de ADN con el método de fenol cloroformo Actualmente existen muchos kits comerciales de extracción de ADN donde el proceso es simplificado fundamentalmente en el segundo y tercer paso de eliminación de proteínas y precipitación y limpieza. Con la ayuda de columnas equipadas con una membrana de sílice, es posible retener el ADN que se une al sílice, permitiendo el paso de moléculas como proteínas, lípidos y sales que acompañan a la reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y posterior elución del contenido. Esquema de extracción de ADN con kit comercial que emplea columnas rellenas de sílice Extracción de ARN: Existen muchos métodos para la extracción del ARN. Los protocolos más empleados son aquellos que incluyen agentes caotrópicos como isotiocianato de guanidinio o fenol para el lisado celular. Estos compuestos inactivan ARNasas (enzimas que degradan rápidamente el ARN), lo que resulta muy favorable cuando se trabaja con muestras que poseen altos niveles de

4 ARNasas endógenas. Posteriormente se realiza una desproteinización con cloroformo y una precipitación diferencial con una sal (Cloruro de Lítio). Actualmente ya existen diferentes empresas que ofrecen equipos automáticos para la extracción de ácidos nucleicos con un excelente rendimiento, evitando errores de manipulación; toxicidad de los reactivos empleados y permitiendo la estandarización de la técnica Concentración y calidad del ácido nucleico obtenido Tras la extracción del ácido nucleico de interés es conveniente evaluar la concentración y calidad del mismo. Una forma de evaluar si los ácidos nucleícos han sufrido roturas, consiste en realizar una electroforesis en gel de agarosa (su fundamento lo veremos en un apartado posterior). Con una electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra. Si el ADN no ha sufrido roturas veremos una única banda de alto peso molecular. Para el caso de muestras de ARN de buena calidad, la electroforesis mostrará claramente los diferentes tipos ARNs. Extracción de ARN de distintas muestras donde podemos ver los distintos ARN que se encuentran en la célula tras su electroforesis en gel de agarosa. Otra medida de la calidad de los ácidos nucleicos consiste en valorar la absorbancia de la disolución del ácido nucleico obtenido tras la extracción, en un espectrofotómetro (instrumento que mide la densidad óptica de una disolución) a 260nm y 280nm. Un ADN puro tendrá una relación de A260/A280 (Absorbancia a 260nm/Absorbancia a 280nm) entre 1,8 y 2. Valores menores indican contaminación con proteínas mientras que valores mayores se deben a contaminación con sales. Para calcular la concentración del ADN se mide en un espectofotómetro su absorbancia a 260nm. Se sabe empíricamente que para el ADN una absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 50ug/ml. Con esta relación puede calcularse la concentración de ADN de nuestra muestra. Para el caso del ARN una absorbancia de 1 corresponde una concentración de 40ug/ml.

5 3.3.- LAS ENZIMAS Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintos procesos de la Biología Molecular. Entre ellas podemos destacar: Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotídicos del interior de la cadena. Las endonucleasas de restricción son enzimas producidas principalmente por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto de ADN de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las más útiles en los métodos de manipulación del ADN debido a su especificidad de secuencia absoluta (reconocen una secuencia concreta del ácido nucleico), tanto para la reacción de unión como para la de ruptura. Algunas, tras la rotura de la cadena pueden producir extremos cohesivos (esto permitirá al fragmento generado unirse a otro fragmento de distinta procedencia que haya sido generado por la misma endonucleasa de restricción) o extremos romos. Secuencias de reconocimiento y zona de corte de dos enzimas de restricción Las enzimas de restricción se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género del microorganismo de procedencia, y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia (ejemplo: Sma: Serratia marcescens). El número señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa estirpe. Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromos. La rotura se produce en ambas hebras de ADN siendo esta simétrica respecto al eje binario. Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar ADN o ARN in vitro. La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: ADN polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde ARN para convertirlo en ADN), la ADN polimerasa del bacteriofago T7, ARN polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq

6 polimerasa (enzima empleada en la reacción en cadena de la polimerasa o PCR). La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador o primer complementario al ADN molde para iniciar la polimerización a partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+. Hay una polimerasa especialmente interesante y de la que vamos estudiar sus características en profundidad en el apartado correspondiente a la importante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta polimerasa se llama Taq polimerasa y su mecanismo de actuación es trascendental en la P.C.R., siendo clave en el impulso para el diagnóstico en los últimos años. Otras enzimas: Ligasas (une extremos de ADN protuberantes o romos), Fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5 de los ácidos nucleicos, Quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5 que han dejado las fosfatasas) etc LA CLONACION Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos de ácido nucleico a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de ADN que se quiere clonar (para este aislamiento podemos emplear las endonucleasas de restricción antes citadas que son capaces de reconocer y cortar al ADN en zonas concretas que nos puedan interesar ), se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos, cósmidos etc..) mediante el empleo de varias enzimas entre ellas las ligasas, posteriormente es introducido en el interior normalmente de una bacteria (para ello se emplean métodos químicos o impulsos eléctricos que permiten la permeabilización de la membrana), y finalmente se replica mediante cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente.

7 Introducción en una bacteria para su cultivo Cultivo Esquema del proceso de clonación Posteriormente se le separa del vector generalmente con la misma enzima de restricción que hemos empleado para obtenerlo, obteniendo como resultado un gran número de copias del fragmento de interés LA ELECTROFORESIS Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño. Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente pb (pares de bases). La poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos y para separación de proteínas. El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:

8 - ADN: en pares de bases o bp. - ARN : en nucleótidos o nt. - Proteínas: en Daltons o Da. Existen muchos tipos de electroforesis: - SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida para identificar proteínas. - Electroforesis 2D o electroforesis bidimensional para separación de proteínas con arreglo a su carga/masa. - Electroforesis en Geles de poliacrilamida para ADN desnaturalizado: para analizar fragmentos de ADN < 100 pb. - Electroforesis en Geles de Agarosa: Separación de ADN en base a su tamaño para fragmentos > 100 pb. - Electroforesis de campo pulsante para analizar grandes fragmentos de ADN (mayores de 10 megabases). - Electroforesis capilar: Para separar mezclas complejas de pequeñas moléculas de ADN ( pb). Actualmente se ha ampliado este rango y automatizado el proceso ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al ph y condiciones del tampón en el que se encuentran), y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de este a través del gel, a velocidades que dependen de sus tamaños (una molécula pequeña puede seguir su camino a través del gel más fácilmente que una molécula grande). Las velocidades de migración de las moléculas de ácidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los logaritmos de sus pesos moleculares. La detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante como el bromuro de etidio (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el propio gel y el ácido nucleico es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para valorar la migración de los ácidos nucleicos en un gel además de su tamaño es la configuración espacial que adopte la molécula.

9 REPRESENTACION DE UN GEL DE AGAROSA TRAS LA ELECTROFORESIS DE MUESTRAS DE PCR. En las carreras primera y última corren los marcadores de peso molecular, en la posición 2 se encuentra el control positivo, en la posición 3 el control negativo, la posición 4 y 5 son dos muestras positivas y en las posiciones 6 y 7 son muestras negativas. El peso molecular de los casos positivos oscilará alrededor de 2,5KB (KILOBASES) al compararlo con los marcadores de peso molecular laterales. FOTOGRAFIAS REALES DE GELES DE AGAROSA

10 PCR de Hepatitis C donde vemos marcador de pesos moleculares, en el pocillo 2 control negativo, en el pocillo 3 control positivo y en el pocillo 4 PCR+ de muestra real de Hepatitis C ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA Son geles normalmente realizados en un soporte vertical constituyendo un excelente medio para separaciones electroforéticas. Los geles de poliacrilamida se forman por copolimerización de la acrilamida y bis acrilamida. La reacción de polimerización es iniciada/catalizada por el compuesto químico TEMED (tetrametiletilendiamida) y por persulfato sódico. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros. Existen distintas aplicaciones para la electroforesis en este tipo de soporte. Generalmente se emplean para la separación de proteínas (SDS PAGE: de las siglas polyacrylamide gel electroforesis en condiciones desnaturalizantes causadas por el detergente SDS). También son empleadas para la separación de pequeños fragmentos de ADN, generalmente fragmentos que han sido generados tras corte con enzimas de restricción. Una aplicación importante en la que se emplea el soporte de gel de acrilamida es la técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Su fundamento está basado en el corte específico del ADN de la muestra problema con endonucleasas de restricción y la separación del producto resultante mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Una aplicación de esta técnica consistiría en la detección de una mutación puntual, por ejemplo una base G que se convierte en T justo en un punto de corte de una enzima de restricción, lo que provoca que la enzima que antes reconocía la secuencia diana específica y procedía a su corte, ahora tras la mutación, no la reconozca y por tanto no la corte. Este cambio sería visualizado después de su separación en una electroforesis. La técnica RFLP se emplea como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en medicina forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos.

11 3.6.- LA HIBRIDACION Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana a la que se le ha unido una molécula reporter. Esquema de hibridación El ADN está formado por una doble hélice de dos cadenas complementarias unidas por puentes de hidrógeno. La unión entre ambas cadenas puede ser rota (desnaturalización del ADN) por calor o por un incremento del ph, constituyendo así cadenas de ADN monocatenario. A este fenómeno es reversible, denominándose renaturalización, al proceso en el que las cadenas anteriormente separadas se unen de nuevo al bajar la temperatura o al restablecer el ph, según sea el caso, volviendo a formarse los puentes de hidrógeno entre ellas. Ahora bien, si tras la desnaturalización añadimos a la muestra una sonda de ADN marcada, es decir, un fragmento de cadena simple de ADN de secuencia complementaria a la de nuestro ADN diana y de origen distinto, cuando se restablecen las condiciones de temperatura o de ph, la sonda puede unirse a la cadena simple de ADN diana; siendo la señal del marcador suficiente para su detección. Este proceso se define como hibridación. Existe un capítulo completo en este módulo en el que se va a tratar en profundidad la hibridación y en particular la hibridación in situ para muestras parafinadas. Ahora tan solo vamos a desarrollar algunos conceptos generales de esta técnica Las sondas Una sonda es un fragmento monocatenario de ADN o ARN marcado con una molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridación. Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos: - Fragmentos de ADN - Fragmentos de ARN

12 - Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas (sintetizados artificialmente en equipos automáticos) Las moléculas reporter Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa...), quimioluminiscentes (ésteres de acridina), Plata etc Factores que afectan a la sensibilidad y especificidad de la hibridación - Concentración del ácido nucleico diana - Complementariedad sonda-ácido nucleico diana - Concentración de la sonda. - Longitud de la sonda - Actividad específica de la molécula reporter. - Condiciones de hibridación (ph, fuerza iónica, temperatura de hibridación,...) - Tm (temperatura de fusión, temperatura a la que el 50% de las hebras de ADN están desnaturalizadas ) - Capacidad de acceder al ácido nucleico diana. - Formato de hibridación Formatos de hibridación - Hibridación en solución: La sonda y el ácido nucleico diana se encuentran en una solución líquida. Las condiciones de hibridación deben ser rigurosas. La velocidad de formación del duplex en estas condiciones es alta. El problema de este tipo de hibridación es la eliminación de la sonda que no ha reaccionado, empleándose entre otros métodos la nucleasa S1-precipitación con tricloroacético o la hibridación protection assay. - Hibridación en fase sólida: El ácido nucleico diana o bien la sonda se encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijación

13 por calor) o de nylon (fijación por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijación se añade la sonda marcada que buscará su secuencia complementaria en el ácido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona, híbridos inestables o uniones inespecíficas son eliminados mediante lavados. Su sensibilidad es menor que la hibridación en solución. También se ha conseguido fijar los ácidos nucleicos al plástico de las placas de microtitulación. Existe un tipo de hibridaciones en fase sólida que son muy empleadas en Biología Molecular: los Southern blot : ADN cortado con enzimas de restricción, separado mediante electroforesis, transferido a un soporte sólido (nitrocelulosa o nylon) e hibridado con una sonda de ADN marcada con una molécula reporter y Northern Blot : ARN separado e hibridado con sondas de ADN o ARN marcadas con moléculas reporter. Estas técnicas consisten en líneas generales en una separación inicial de las moléculas en base a su peso molecular mediante electroforesis, trasferencia capilar de estas moléculas a un filtro de papel o de nylon, fijación, hibridación con la sonda de interés y detección. Resultado de un Southern Blot Hibridación in situ Aunque este apartado será tratado en extensión en un próximo capítulo diremos a modo de resumen que permite la detección de genes o expresión de genes dentro del contexto morfológico de la célula o tejido. Para conseguirlo se requiere que el ácido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener

14 acceso la sonda, pero preservando la morfología para la consiguiente interpretación y análisis.. El empleo de proteasas, que facilitan el acceso de la sonda al ácido nucleico diana debe ser realizado cuidadosamente para no provocar el desmantelamiento de la morfología celular. Se recomienda el empleo de oligosondas por su tamaño que permite un mejor acceso al interior de la célula. Entre las técnicas de hibridación in situ encontramos el FISH (hibridación in situ fluorescente) entre cuyas moléculas reporter podemos encontrar la fluoresceína o el rojo Texas, CISH (hibridación in situ cromogénica) y su variante DUO-CISH (realización de dos hibridaciones simultáneas y detección con dos cromógenos de distinto color), SISH (emplea plata como cromógeno).

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