Presencia y co-presencia de aflatoxinas, deoxinivalenol, fumonisinas y zearalenona en alimentos especiales: alimentos sin gluten y de importación

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1 14 Presencia y co-presencia de aflatoxinas, deoxinivalenol, fumonisinas y zearalenona en alimentos especiales: alimentos sin gluten y de importación Las aflatoxinas (AFS) son unas de las micotoxinas más importantes producidas por el género Aspergillus y pueden ser sintetizadas en un amplio número de alimentos no procesados, tan importantes como los cereales, los frutos secos, los higos secos y las especias (Malone et al., 2000). La aflatoxina B1 (AFB1) es la micotoxina más carcinogénica que se conoce y se ha documentado ampliamente la evidencia de que es el principal factor de riesgo para el carcinoma hepatocelular, y por eso ha sido clasificada en el grupo 1 por Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC, 2002). Las toxinas más importantes del género Fusarium son los tricotecenos, la zearalenona (ZEA) y las fumonisinas (FBs), que se pueden encontrar aisladas o simultáneamente, incluso con otras micotoxinas como las AFS, en cereales y por tanto en alimentos procesados derivados (Jestoi 2008). Los tricotecenos son una familia de sesquiterpenoids cíclicos, los cuales se dividen en 4 grupos (tipo AD) de acuerdo al grupo funcional. Los tricotecenos del tipo B son, a menudo, representados por deoxinivalenol (DON), siendo el más frecuente en Cataluña y de otros países europeos (Cano Sancho et al., 2011). Las fumonisinas B1 (FB1) y B2 (FB2) son micotoxinas producidas por F. verticilloides y F. proliferatum que pueden contaminar todo el maíz, por lo tanto, las FBs se encuentran principalmente en maíz y alimentos procesados derivados (Nelson et al., 1992). La ZEA es una micotoxina estrogénica producida por F. graminearum y otras especies de 181

2 Fusarium, que pueden infectar una amplia variedad de cereales, incluyendo el maíz y el trigo en regiones suaves y templadas del planeta (Jelinek et al. 1989; Patel et al. 1996). Los niveles de micotoxinas tanto en alimentos no procesados como en alimentos procesados para consumo humano fueron fijados por el Reglamento 1881/2006 del 19 de diciembre de 2006 y por el Reglamento 1126/2007 del 28 de septiembre de 2007 (Comisión Europea, 2006, 2007) y posteriormente por el Reglamento 105/2010 del 5 de febrero de 2010 y el Reglamento 165/2010 del 26 de febrero del mismo año (Comisión Europea, 2010a, b). Derivado de estudios de toxicidad, la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ha determinado unos niveles de exposición, toxicológicamente seguros, para las FBs de 2000 ng kg-1 pc día-1 (SCF, 2003), para el DON de 1000 ng kg-1 pc día-1 (SCF, 2002) y para la ZEA de 200 ng kg-1 pc día-1 (EFSA, 2004). En cuanto a la evaluación del riesgo de las AFS, los comités científicos internacionales no han establecido un límite de seguridad debido a su potencial carcinogénico y genotóxico. Generalmente, en los estudios de evaluación de la exposición a contaminantes químicos de origen alimentario no se tienen en consideración algunos grupos de población, que a pesar de poder ser minoritarios, muestran marcadas diferencias en el patrón de consumo alimentario. Entre estos grupos de población podemos destacar, por un lado, los celíacos que deben sustituir a los alimentos a base de trigo para aquellos libres de gluten, y por otra, los grupos de población recién llegada que mantiene cierta adherencia al patrón alimentario del país de origen. Considerando que durante el año 2009 la población recién llegada representaba alrededor del 16% de la población catalana total (Migracat, 2010), se justifica claramente la evaluación de forma específica de la exposición de este colectivo a las micotoxinas. Los objetivos de este trabajo son, evaluar la presencia y la co-presencia de AFS, DON, FBs y ZEA en muestras de alimentos de importación destinados específicamente a la población recién llegada y alimentos sin gluten, y adicionalmente, evaluar el exposición de una muestra de población recién llegada y celíaca a estos contaminantes alimentarios. 182

3 14.1 Metodologia Muestras Las muestras de alimentos de importación se tomaron en tiendas de barrio especializadas en importación de alimentos del Magreb, Países del Este o América Latina, o en supermercados o hipermercados con sección de alimentos de importación. Los alimentos eran principalmente, cuscús, harina de maíz, harina de trigo, crema de maíz y sémola de maíz. Los alimentos sin gluten se tomaron en tiendas especializadas en dietética y nutrición, o supermercados e hipermercados con sección de productos dietéticos. Los productos muestreados eran principalmente, pan, pasta y repostería sin gluten. En total se tomaron 35 muestras de alimentos de importación y 18 muestras de alimentos sin gluten Métodos analíticos Aflatoxinas El procés per determinar les AFs, va consistir en una extracció, mesclant i agitant 10 g de mostra triturada amb 15 ml de solució d acetonitril i aigua (60:40), durant 20 minuts. La mescla agitada es va filtrar i purificar mitjançant columnes d immunoafinitat AFLAPREP (R-Biopharm, Alemania). El contenido en AFS del extracto final se determinó por HPLC con detector de fluorescencia, haciendo uso de un derivatitzador fotoquímico post-columna, tipo UVE Derivatizer LC Tech, para intensificar la señal. La longitud de onda de excitación era de 365 nm, y la de emisión a 0-13 min y min era de 455 y 425 nm, respectivamente. La fase móvil consistió en una solución de agua, metanol y acetonitrilo (70:17:17). 183

4 Deoxinivalenol Cinco gramos de muestra triturada se mezcló con 40 ml de agua destilada y se agitó durante 10 min, finalmente se filtró con un filtro de microfibra. 4 ml de muestra filtrada se pasó a través de la columna de inmunoafinidad DONPREP (R-Biopharm, Alemania) y ésta se lavó con 10 ml de agua destilada. El DON se eluir con 3 ml de etanol grado HPLC. Las muestras purificadas se evaporaron bajo el flujo de nitrógeno. Cada muestra evaporada se resuspender con fase móvil (agua mili-q, acetoniril y metanol en proporciones 920:40:40). El DON se determinó por HPLC con detector UV a la longitud de onda de 218 nm Fumonisinas Diez gramos de muestra triturada se mezcló con 1 g de NaCl y 50 ml de solución de extracción (50% agua, 25% metanol y 25% de acetonitrilo), agitando durante 20 minutos. 10 ml de extracto filtrado se diluyó con 40 ml de tampón fosfato y se pasó por la columna de inmunoafinidad FUMONIPREP (R-Biopharm, Alemania). Las FBs del extracto purificado se determinaron por HPLC con detector de fluorescencia, realizando una derivatización en pre-columna con una solución de o-ftaldialdehid para aumentar la fluorescencia. La longitud de onda de excitación y de emisión era de 335 y 440 nm, respectivamente. La fase móvil estaba formada por una solución de dihidrógeno fosfato de sodio (0.1 M) y metanol Zearalenona La extracción y purificación de la ZEA se realizó mezclando la muestra triturada con solución de extracción de acetonitrilo y agua (75:25), y se agitó durante 10 minutos. Finalmente se filtró, y se mezcló con solución fosfato para pasar por la columna de inmunoafinidad EASI-EXTRACT ZEARALENONE (R-Biopharm, Alemania). El elución se realizó invirtiendo el flujo tres veces con 1,5 ml de acetonitrilo y pasando libremente 1,5 ml de agua milli-q. 184

5 La determinación y cuantificación de la ZEA en el extracto se hizo por HPLC con detector de fluorescencia. La longitud de onda de excitación y de emisión era de 274 y 455 nm, respectivamente. La fase móvil consistió en una solución de acetonitrilo y agua milli-q (60:40) Evaluación de la exposición Para evaluar la exposición alimentaria a las micotoxinas, se realizó un estudio nutricional mediante cuestionarios de consumo de alimentos (QFCA) específico para la población recién llegada y celíaca. El QFCA incluía aquellos alimentos que pueden estar potencialmente contaminados con micotoxinas y disponibles en Cataluña. Entrevistadores entrenados entrevistaron 70 celíacos adultos y 56 adultos recién llegados, un entrevistador de origen árabe realizó las entrevistas entre la población procedente del Magreb para aumentar la fiabilidad de las respuestas. En cuanto al tratamiento de las muestras no detectadas, se siguió el criterio establecido en el informe elaborado en el Workshop in the frame of GEMS / Food-EURO donde Reliable Evaluation of Low-Level Contamination of Food (GEMs / Food-WHO, 1995 ), donde se aconseja que en los casos donde se encuentra un porcentaje de no cuantificados superior al 60%, se realicen dos estimaciones, utilizando 0 y el LD para todos los valores no detectados, con el fin de obtener una estimación sencilla de la media Asumiendo independencia entre el consumo (C, j) y la contaminación (Tj), así como entre sus productos, se estimó la exposición media de la población con la muestra de población 0, tal y como se representa: ˆ p j E C j T 0 1 0, j Donde C 0, j es la media del consumo normalizado del alimento y en un grupo población 0, i T j es la media de los valores de contaminación disponibles de este alimento. Considerando estas asunciones, se calculó la estimación de la media y de la varianza de la muestra, mediante lo que llamamos en este trabajo como "método directo". Esta aproximación a la exposición debería considerarse una aproximación 185

6 teórica, ya que debido a dichas asunciones, se convierte en una aproximación muy simplificada en la estimación poblacional real. La exposición global se evaluó considerando fuentes de exposición adicionales y de consumo general entre el resto de población como son los copos de maíz, el pan, el pan de molde, los aperitivos de maíz, el maíz dulce, los pistachos y los cacahuetes Resultados Presencia i co-presencia de micotoxinas Las muestras de alimentos sin gluten estaban compuestas principalmente por harina de maíz o de arroz para evitar incorporar el gluten en el producto. Las AFS y la ZEA no se detectaron en ninguna muestra, mientras que el DON se encontró en dos muestras de pasta y pan con niveles respectivos de concentración de 162,7 y 270,0 g kg-1. Las FBs se detectaron en 6 muestras de un total de 18, siendo la FB1 la más presente en un intervalo de concentración entre 5,70 i 18,90 g kg -1. La FB1 y FB2 eran las micotoxinas más importantes que se encontraron en la categoría de alimentos de importación, con un porcentaje de contaminación entre el 51 y el 40%, respectivamente (ver Tabla 14.1), principalmente detectadas en alimentos a base de maíz. La concentración de la FB1 estaba entre 16,1 y 547,0 g kg -1, mientras que el interval de contaminación de la FB2 iba de 25,7 a 135,2 g kg -1. El DON se detectó en 15 de las 35 muestras, pero en este caso, principalmente en alimentos a base de trigo. El intervalo de concentraciones se encontraba entre 124,7 y 657,1 g kg-1. La presencia de ZEA y de AFS fue muy baja, detectando sólo en 3 y en 4 muestras, respectivamente. La presencia simultánea de la FB1 y la FB2 se observó en la mayoría de las muestras. También se observaron otras combinaciones como FBs-DON (4 muestras), FBs-AFS (2 muestras), FS-DON-ZEA (1 muestra) y FBs-AFS-DON (1 muestra). Tabla14.1 Presencia i co-presencia de micotoxinas en alimentos de importación (unidades g kg -1 ) 186

7 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 DON FB1 FB2 ZEA Alimentos a base de maíz Harina maíz ,85 18, Harina maíz , Harina maíz ,67 26,29 25,66 3,83 Harina maíz 6, ,53 188,63 53,04 - Harina maíz ,79 35,04 - Harina maíz ,63 62,26 - Harina maíz blanca - 2,29-1,57-129,86 41,92 - Harina maíz especiada ,71 30,79 - Harina maíz flocada ,65 54,66 - Harina maíz amarilla ,25 48,46 - Harina maíz blanca ,91 31,63 - Sémola maíz , Sémola blanca maíz ,79 108,98 - Sémola fina maíz ,91 52,18 - Sémola gruesa maíz ,74 98,33 34,55 - Crema maíz 14, ,95 53,32 - Crema maíz , Alimentos a base de trigo Cuscús , Cuscús , Cuscús , Cuscús , ,40 Cuscús Cuscús , Cuscús , Cuscús , Cuscús Cuscús Cuscús con frutos secos ,98 135,19 - Harina de trigo , Sémola trigo Sémola trigo , Sémola trigo , Sémola trigo duro , Pasta con vegetales ,37 Otros Sémola cebada

8 Evaluación de la exposición a les micotoxinas Dado el bajo número de muestras contaminadas de la categoría de productos sin gluten no hizo posible la evaluación de la exposición mediante un método simplificado, especialmente para las AFS donde se observó un amplio número de muestras no detectadas. En el caso de los recién llegados, a pesar de encontrarse un porcentaje más elevado de muestras contaminadas, se estimó un nivel de contaminación bastante amplio en función de la sustitución realizada, más marcada en el caso de las AFS y la ZEA. Los patrones alimentarios de los individuos entrevistados estaban fuertemente relacionados con su país de origen. El cuscús era principalmente consumido por individuos procedentes del Magreb, y la harina de maíz por el colectivo procedente de América Latina. En la tabla 14.3 se muestra la exposición a cada micotoxina procedente del cuscús y de la harina de maíz, y de forma global, considerando aquellos otros alimentos no específicos que pueden contribuir a la exposición. En todos los casos los valores se encontraban alejados de los valores de seguridad de 2000 ng kg-1 pc día-1 de las FBs (SCF 2003), de 200 ng kg-1 pc día-1 de la ZEA (EFSA 2004), de 1000 ng kg-1 pc día-1 del DON (SCF 2002) o 1 ng kg-1 pc día-1 para las AFS. Tabla 14.2 Exposición dietetica estimada de la población récien llegada las AFs, DON, FBs i ZEA a través de alimentos especiales de importación (media ± desviación estándar, unidades en ng kg -1 pc dia -1 ) AFBs FBs DON ZEA Exposición a partir del cuscús ND=0 0.00± ± ± ±0.46 ND=LOD 0.00± ± ± ±1.66 Exposición a partir de la harina de maíz ND=0 0.31± ± ± ±7.14 ND=LOD 0.35± ± ± ±14.57 Evaluación de la exposición global ND=0 0.38± ± ± ±2.03 ND=LOD 0.70± ± ± ±2.11 % TDI ND=0 38±55 7±8 43±39 1±1 188

9 ND=LOD 70±78 7±8 43±39 1± Conclusiones En resumen, las FBs se encontraron de forma generalizada en los alimentos a base de maíz procedentes de tiendas especializadas en alimentos de importación. El DON se encontró principalmente en cuscús y algunos alimentos de importación. Los alimentos sin gluten presentaban un bajo porcentaje de muestras contaminadas con FBs (6 de 18) y de DON (2 de 18), mientras que las AFS y la ZEA sólo se detectaron en 6 alimentos de importación. Considerando estos resultados, estos productos especiales no deberían representar una preocupación para la salud de los colectivos que los consumen Referencias Cano-Sancho G, Valle-Algarra FM, Jiménez M, Burdaspal P, Legarda TM, Ramos AJ, Sanchis V, Marin S Presence of trichothecenes and co-occurrence in cereal-based food from Catalonia (Spain). Food Control 22: Comisión Europea (CE) Reglamento (CE) N º 1881/2006 of 19/12/2006. Official Journal of the European Union, L364, Comisión Europea (CE) Reglamento (CE) N º 1126/2007 of 09/28/2007. Official Journal of the European Union, L255, Comisión Europea (CE). 2010a. Reglamento (CE) N º 105/2010 of 05/2/2010. Official Journal of the European Union, L35, 7-8. Comisión Europea (CE). 2010b. Reglamento (CE) N º 165/2010 of 02/26/2010. Official Journal of the European Union, L50, European Food Safety Authority (EFSA) Opinion of the scientific panel donde contaminantes in the food chain on a petición from the commission related to zearalenone as undesirable substance in animal feed. EFSA J

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