Crecimiento y Cultivo Celular CULTIVO IN-VITRO DE RAÍCES TRANSFORMADAS

Transcripción

1 CULTIVO IN-VITRO DE RAÍCES TRANSFORMADAS Las raíces de plantas superiores tienen la capacidad de sintetizar gran diversidad de metabolitos secundarios y adaptar su metabolismo en respuesta al estrés causado por factores bióticos como abióticos. El estudio del metabolismo rizosférico es de particular interés para comprender la interrelación entre las plantas y otros organismos del suelo ya sean beneficiosos o perjudiciales. Entre los metabolitos de interés farmacéutico que se producen o acumulan en sistemas radiculares se puede citar a los venenos y alucinógenos de raíces de mandrágora, a los componentes de Atropa belladona que antiguamente tenía uso cosmético. Otros compuestos alcaloidales de los cuales hyosciamina y escopolamina son los ejemplos mas conocidos son sintetizados casi exclusivamente en raíces. Su mecanismo de acción se basa en su capacidad de unirse a receptores de acetilcolina, justificando su extendido uso como relajantes de musculatura lisa. Otros alcaloides que se hallan principalmente en raíces son nicotina y sus derivados. El alcaloide emetina proviene de las raíces de Cephaelis ipecacuana. Algunos nematicidas como tirabrina y terthienil, que son compuestos policétidos, se aíslan a partir de raíces de Calendula officinalis y otras especies de la familia Asteraceae. Shikonina y otras naftoquinonas estructuralmente relacionadas se acumulan en raíces de plantas de la familia Boraginaceae y presentan, entre otras actividades acción antimicrobiana de amplio espectro. La rotenona es un isoflavonoide de las raíces de varias legumbres leñosas y se usa como pesticida. Los diterpenos que producen las raíces de Ginkgo biloba se utilizan para tratar enfermedades cardíacas, demencia y senilidad. La forscolina, un labdano diterpeno, de raíces de Coleus forscolii, se usa para tratar el asma bronquial porque es activadora de la adenilato ciclasa. Las raíces de Camptotheca acuminata producen el alcaloide camptotecina que es una droga anticancerígena. El estudio de la bioquímica y la química de las raíces ha sido siempre acotado debido a las dificultades técnicas derivadas de los hábitos subterráneos de este órgano. La posibilidad de contar con un sistema de cultivo "in-vitro" se a tornado en una herramienta sumamente útil a los fines de investigación. La infección de muchas especies in-vitro con el microorganismo patógeno Agrobacterium rhizogenes permite obtener clones de raíces estables y en condiciones axénicas. Mayoritariamente, los clones preservan la capacidad biosintética de las raíces de las plantas que les dieron origen, tal es el caso de las raíces de Hyoscyamus muticus que

2 acumulan hyoscyamina a niveles que superan la capacidad biosintética de las plantas silvestres, mostrando además un alto grado de crecimiento in-vitro. La capacidad biosintética de los cultivos de raíces transformadas esta estrechamente relacionada con la diferenciación celular, esto contrasta con los sistemas de cultivos indiferenciados y además permite manejar material genéticamente estable a través de un número indefinido de subcultivos. Actualmente se ha reportado que el cultivo de raíces transformadas de alrededor de doscientas especies de plantas superiores mayoritariamente dicotiledóneas se ha realizado en forma exitosa y con altos rendimientos en lo referente a biosíntesis de metabolitos específicos. Además los cultivos de raíces transformadas constituyen modelos ideales para realizar estudios metabólicos y regulatorios. Por ejemplo con estos sistemas se ha demostrado que las raíces pueden expresar capacidad fotosintética, llegando en algunos casos a desarrollarse en ausencia de fuentes hidrocarbonadas, en total fotoautotrofía. Ya que la asimilación de carbono esta estrechamente afectada por la producción de metabolitos secundarios estos sistemas son aptos para analizar interacciones entre metabolismo primario y secundario. Las raíces transformadas son también capaces de biotransformar compuestos y permiten establecer sistemas de co-cultivos con otros organismos. Por ejemplo raíces transformadas de Daucus carota pueden ser infectadas con varias especies de Glomus, que son hongos que naturalmente se desarrollan simbióticamente con plantas superiores constituyendo un modelo de producción a gran escala de micorrizas. Además que la simbiosis in-vitro induce a la acumulación de metabolitos secundarios, por ejemplo en Hordeum vulgare dónde se incrementa notablemente la cantidad de glicósidos terpénicos. Otro caso interesante es el co-cultivo de raíces de Catharanthus roseus con Acaulospora scrobiculata, donde el consumo de gran parte de los fosfatos del medio de cultivo por parte de los microorganismos revierte el efecto inhibitorio que ejerce este anión sobre la acumulación de alcaloides indólicos. También se han co-cultivado nemátodos y áfidos, lo cual constituye un apropiado modelo para el estudio de interacciones y mecanismos de defensa. Otra aplicación de los cultivos de raíces transformadas es la producción de proteínas bioactivas; dentro de las que puede hacerse mención a la producción de exoenzimas como peroxidasas en Brassica napus, quitinasas de acción antifúngica, glucanasas y proteínas activantes de ribosomas (RIPs). También es posible acumular proteínas de almacenamiento,

3 como es el caso de sporamina en batata que también ha demostrado jugar algún rol en procesos de defensa. Las principales ventajas de utilizar cultivos de raíces transformadas, en cabellera o hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar de cultivos dediferenciados son: Con estos sistemas no son necesarios medios suplementados con fitorreguladores para desarrollar biomasa. Las raíces transformadas crecen rápidamente, son robustas y vigorosas. Sintetizan metabolitos secundarios característicos de las raíces de las plantas de las cuales provienen. La síntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles puesto que, a diferencia de los cultivos de células indiferenciadas, son genéticamente estables por períodos prolongados de cultivo. El cultivo masivo de raíces transformadas es sencillo y se desarrolla muy bien en biorreactores, ampliando la posibilidad de aplicación industrial de estos procedimientos. A modo de resumen de lo anteriormente citado el cuadro que se expone a continuación muestra algunos ejemplos de metabolitos secundarios sintetizados en raíces, aunque a veces en plantas silvestres se acumulen en otros órganos. Muchos de ellos presentan potencial o comprobado uso industrial o terapéutico y pueden producirse a escala por cultivos de raíces transformadas. Metabolito Especie vegetal Aplicación Atropina Hyoscyamus Anticolinérgico Berberina Hydratis canadensis Antihemorrágico uterino Esteres de bornilo Valeriana Sedante Ginsenósidos Panax Tónico, estimulante Rotenona Derris elliptica Insecticida Vincristina, vinblastina Catharantus roseus Antileucémico Quinina, quinina Cinchona Antimalárico, antirreumático Reserpina Rauwolfia Antihipertensivo

4 Algunos metabolitos secundarios sintetizados por raíces de plantas El cultivo in-vitro de raíces transformadas. La enfermedad vegetal denominada raíz en cabellera o Hairy roots afecta a plantas dicotiledóneas el fitopatógeno causal es la bacteria Gram negativa Agrobacterium rhizogenes. El microorganismo posee un plásmido llamado Ri (inductor de raíces) que integrado al genoma vegetal induce la producción de raíces a partir de cualquier órgano. El plásmido, de

5 aproximadamente 250 kb, es el factor patogénico que ocasiona la expresión de la enfermedad, caracterizada por la producción de raíces en cabellera y la síntesis de metabolitos específicos llamados opinas. El T-ADN es el sector del plásmido que se transfiere a las células huésped, por lo que esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb esenciales para la transferencia. En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (TR) y la izquierda (TL). Ambas codifican para funciones rizogénicas una vez integradas a la célula huésped. La región TR especifica la síntesis de agropinas y auxinas, mientras que la TL porta cuatro loci que contienen los genes rol (A,B,C y D), implicados en el desarrollo morfológico de las raíces mediante la sensibilización de las células al efecto auxínico. El gen rol D induce la formación de tejido de callos mientras que los genes rol A, B y C regulan el tamaño, grado de ramificación, alteraciones de tropismo y demás características de las raíces en cabellera. Como fue mencionado en la región TR del T-ADN se encuentran los genes que codifican para la producción de opinas. Estos metabolitos son aminoácidos no usuales derivados de carboxietil o dicarboxipropilarginina (series octopina y nopalina) y del ácido glutámico y manitol (agropinas). Los genes codificados en el T-DNA presentan secuencias regulatorias eucarióticas que permiten su expresión en las plantas infectadas. En la región Ri hay también genes vir cuya transcripción induce la síntesis de compuestos fenólicos como los que liberan las plantas mecánicamente injuriadas como las acetosiringonas. En ausencia de TR DNA los genes Ri del TL-DNA dirigen la diferenciación hacia raíces en cabellera si hay suministro de auxinas exógenas.

6 Opinas sintetizadas por plantas infectadas con Agrobacterium rhizogenes Las opinas son utilizadas como fuente de C y N por el Agrobacterium pero no por la planta y su síntesis determina una desviación energética del vegetal en provecho de la bacteria. En muchos casos las opinas son el metabolito más importante de las células afectadas, constituyendo hasta un 7 % del peso seco total. En un proceso de infección normal las opinas son secretadas al suelo y son catabolizadas por los Agrobacterium de vida libre.

7 Tecnología básica para el desarrollo y mantenimiento de raíces transformadas. 1. Establecimiento de cultivos. Se deben preparar suspensiones de A. rhizogenes de 48 h. de edad cultivado entre C, puesto que a temperaturas mayores de 28 C pueden provocar la cura de la bacteria de su plásmido. Acondicionar los explantos a infectar que pueden ser órganos de plantas silvestres o preferentemente plántulas estériles. Provocar cortes con una jeringa hipodérmica conteniendo la suspensión de A. rhizogenes sobre la superficie de los explantos y cultivar. A los 7-14 días, cuando las raíces emergentes tengan de 5-10 mm de longitud, seccionarlas, separarlas del explanto y colocarlas en medio de cultivo apropiado (B5, LS o MS de media fuerza (La mitad de la concentración salina) con 30g/l de sacarosa y 0.5 mg/ml de sulfato de ampicilina). Subcultivar cada dos semanas en el mismo medio utilizando inóculos de 3 a 4 cm de longitud con ramificaciones laterales. Luego de 8 subcultivos suprimir el agregado de antibiótico al medio. La proliferación celular solo ocurre en las zonas meristemáticas apicales. La composición de los medios de cultivo afecta tanto a crecimiento como a la producción de metabolitos. Algunas variables son los niveles de sacarosa, el agregado de fitoreguladores, la naturaleza de la fuente de nitrógeno y sus proporciones, la luz y la temperatura. Las raíces transformadas son capaces de sintetizar una cantidad estable de fotoquímicos pero su capacidad de liberación al medio suele ser limitada. Esto constituye una dificultad tecnológica para la recuperación y además limita la biosíntesis por retrocontrol. Ciertas manipulaciones de las condiciones de cultivo favorecen la excreción. Por ejemplo la privación de oxígeno en cultivos de raíces de Beta vulgaris incrementa la liberación a los medios de betacianina. La permeabilización con Tween 20 libera al medio hyosciamina a partir de raíces de Datura inoxia. La adición a los cultivos de resinas como XAD-2 o parafina líquida aumenta la producción de shikonina y la liberación de alcaloides del tropano se ve transientemente incrementada con el agregado de 5 mm de H 2 O 2. Una vez establecidos los cultivos de raíces transformadas se pueden desarrollar a partir de pequeños inóculos y obtener buenos índices de crecimiento. El principal problema es el

8 cambio de escala a niveles industriales ya que la agitación mecánica causa injurias que conducen a la formación de callos. Las características del crecimiento, dependiente y a partir de los tejidos meristemáticos, hace que en los medios líquidos, en grandes volúmenes se formen esferas de raíces con las raicillas jóvenes en crecimiento sobre la periferia y un corazón de tejido viejo en el interior. La restricción nutricional que soporta esta parte interna, principalmente en lo referido al oxígeno da origen a un bolsillo de tejido senescente. Debido a las ramificaciones las raíces forman una matriz que ofrece resistencia al flujo, siendo el principal problema nuevamente el suministro de oxígeno. Perspectivas futuras del uso de raíces transformadas El reconocimiento de que la función de las raíces vegetales excede ampliamente la captación de nutrientes y el establecimiento de asociaciones simbióticas abre muchas posibilidades de investigación. Las raíces son órganos con un metabolismo único y propio. Producen metabolitos y enzimas bioactivas que ayudarán a comprender y utilizar importantes interacciones rizosféricas. La posibilidad de desarrollar raíces in-vitro de numerosas especies permitirá manipular el metabolismo mediante la caracterización de las enzimas involucradas en las rutas específicas y el posterior clonado de sus genes. El potencial de la ingeniería metabólica ha sido demostrado mediante la expresión de un anticuerpo monoclonal que se une a una proteína de superficie del Streptococcus mutanns agente causal de las caries dentales en raíces transformadas de Nicotiana tabacum. A partir de raíces transformadas se regeneran rápidamente plantas transgénicas o clones con estabilidad genética, constituyendo este un buen sistema para la propagación clonal de plantas de elite, muy aplicable a la biotecnología de especies arbóreas. Con excepción de las secuencias border, ninguna de las otras se requiere para la transferencia de T-DNA en A. rhizogenes, por lo tanto el resto puede ser reemplazada por DNA extraño e introducido a células para que se desarrollen las raíces transformadas transformantes. Plantas enteras pueden regenerarse a partir transfiriendo las raíces a medios con suplemento de fitorreguladores. Las transformaciones mediadas por Agrobacterium tumefaciens presentan una lata frecuencia de escapes, hecho que no es habitual en las mediadas por A. rhizogenes debido a que el hecho de que los tejidos que presentan morfología de raíz son los transformantes constituye una herramienta de selección adicional. Como la regeneración es posible sin

9 atravesar el estado de callo se evitan las variaciones somaclonales y se pueden lograr vástagos sin anormalidades citológicas, si bien se han logrado regeneraciones de algunas especies, particularmente ornamentales, con fenotipos alterados como abundancia de raíces adventicias, reducción de la dominancia apical y cambios morfológicos en hojas y flores que en definitiva han resultado favorables. En algunos casos la producción de metabolitos secundarios en hojas de plantas regeneradas a partir de raíces transformadas ha aumentado considerablemente. Recientemente se ha reportado la producción de anticuerpos monoclonales en raíces transformadas que fueron iniciadas a partir de plantas de tabaco transgénicas que expresaban una IgG monoclonal. Semillas artificiales se han desarrollado encapsulando segmentos de raíces, siendo este un buen sistema para la propagación clonal con uniformidad genética.