Análisis de la Proliferación y Apoptosis. Lic. En Bioquímica Carolina Leimgruber

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1 Análisis de la Proliferación y Apoptosis Lic. En Bioquímica Carolina Leimgruber

2 El funcionamiento adecuado de cualquier organismo depende de su capacidad para producir nuevas células y de eliminar aquellas que no son capaces de cumplir su función. DIFERENCIACIÓN PROLIFERACIÓN MUERTE

3 Tejido sano MUERTE CELULAR MUERTE CELULAR MUERTE CELULAR Enfermedades Degenerativas Sida PROLIFERACIÓN PROLIFERACIÓN PROLIFERACIÓN Enfermedades Proliferativas Cáncer

4 La regulación de estos procesos, es el resultado de la interacción de programas de expresión génica, señales externas proporcionadas por hormonas, factores de crecimiento o de muerte y por contactos célula - célula. Las alteraciones de los mecanismos de control de estos procesos, son la base de anormalidades en el desarrollo y el crecimiento incontrolado de los tumores.

5 Muerte Celular Apoptosis Oncosis/ Necrosis

6 CLASIFICACIÓN MUERTE CELULAR NO PROGRAMADA MUERTE CELULAR PROGRAMADA

7

8 APOPTOSIS ONCOSIS/NECROSIS Estímulo Fisiológico o patológico Patológico Membrana plasmática Citoplasma y organelas Intacta Exposición de fosdfatidilserina Condensación Se destruye Edema ADN Fragmentos de pb Degradación inespecífica Requerimiento energético Otras características Activo Activación de proteasas específicas: caspasas Afecta células individuales Pasivo Activación de proteasas inespecíficas Afecta grupos de células Destino final Fagocitosis de cuerpos apoptóticos sin reacción inflamatoria Liberación del contenido con reacción inflamatoria

9

10 Apoptosis temprana Apoptosis tardía

11 Apoptosis Eventos morfológicos y bioquímicos Disminución del tamaño celular Condensación del citoplasma Fragmentación nuclear Formación de cuerpos apoptóticos Fagocitosis Técnicas de detección Microscopía Electrónica Microscopía Fotónica Microscopía de fluorescencia División intranucleosomal División del ADN en fragmentos múltiplos de pb Externalización de fosfatidilserina Técnica de TUNEL Electroforesis del ADN Citometría de flujo Detección de Proteínas que participan en el proceso apoptótico Inmunohistoquímica Western blot

12 Estudio Morfológico

13 Estudio Morfológico Permite la detección de cambios en la organización celular y la objetivación de las diferentes etapas de la apoptosis Microscopía Electrónica Microscopía Fotónica Microscopía fluorescencia Acompañar por otros métodos Fijación Deshidratación Aclaramiento Inclusión Corte y Coloración

14 Microscopía Electrónica

15 Microscopía Electrónica

16 Estudio Morfológico Ventajas Desventajas ME: Medio irrefutable para estudiar apoptosis Alta especificidad Debido a que la apoptosis es un proceso aislado y los fragmentos son rápidamente fagocitados, no siempre es factible detectarla por esta vía y no es un método muy adecuado para la cuantificación del fenómeno. Requiere personal especializado y el equipamiento es un factor limitante

17 Microscopía Fotónica

18 Microscopía Fluorescencia Tinciones con fluorescentes nucleares; los colorantes nucleares más usados son DAPI y Hoescht. HOESCHT

19 Detección In Situ Técnica De TUNEL

20 Técnica De TUNEL TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP Nick End Labeling) Fragmentación Del DNA Incubación con d-utp marcados al extremo OH3 y la enzima transferasa terminal Incubación con Ac conj con peroxidasa Revelado DAB

21 Técnica de TUNEL

22 Técnica de TUNEL

23 Técnica de TUNEL Ventajas Permite determinar presencia de fragmentación del ADN en células individuales (cuantitativa) Desventajas En algunos procesos de necrosis puede haber degradación del ADN dejando extremos 3 libres Se han desarrollado kits que facilitan su utilización

24 Electroforesis del ADN

25 Electroforesis del ADN En células apoptóticas el ADN se cliva en fragmentos de pb (el largo de la unión repetitiva del nucleosoma) Este ADN se observa como una escalera o bandeo en una electroforesis Digestión de la muestra con proteinasa K - Extracción del DNA - RNAsas - Corrida en gel de agarosa (con bromuro de etidio) -Sembrar - Transiluminación - Control negativo (células viables sanas) - Control positivo (células tratadas con estimulos proapoptóticos)

26

27 Electroforesis del ADN

28 Electroforesis del ADN

29 Electroforesis del ADN

30 Electroforesis del ADN Ventajas La degradación del ADN en patrón de escalera ocurre en forma específica Método confiable Desventajas Aparece en un proceso tardío Algunas estirpes celulares no presentan este tipo de degradación (epiteliales) Es posible perder fragmentos pequeños de ADN Poco sensible

31 Citometría de Flujo

32 Citometría de Flujo Cambios en la simetría de la membrana plasmática: mediante la incorporación de anexina (molécula con gran afinidad por la fosfatidilserina y que no difunde). Con yoduro de propidio puede verse la integridad de la membrana plasmática.

33 AnexinaV- Ioduro de propidio - Anexina-V se une a fosfatidil-serina expuesta en la membrana de células apoptoticas. - IP sólo entra a las células con la membrana plasmática dañada (necróticas y apoptoticas Tardías) IP Necrosis y apoptósis tardía Se hace doble marcación porque las células necróticas exponen fosfatidilserina Viables Controles: - Marcaciones simples - control de autofluorescencia Anexina V

34 Citometría De Flujo Ventajas Detección de apoptosis temprana y tardía Conocer la integridad de las membranas Cuantitativo Desventajas Requiere células íntegras

35 Western Blot Determinación de la expresión de proteínas involucradas en del proceso de apoptósis: Detección de la/s formas clivadas de caspasas (forma activa) y/o procaspasa mediante Wetern. Detección de clivado de sustratos fisiológicos (PARP) o exógeno de caspasas. Otras proteínas implicadas en la apoptosis: - Proteínas proapoptóticas: Bax, Bcl-xS, Bak, Bcl, Bid, Bim - Proteínas antiapoptóticas: Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1.

36 Western Blot Procaspasa Caspasa activa PARP PARP clivado

37 Ventajas Se puede evaluar la actividad de las caspasas en extractos proteicos de muestras de células en cultivo o biopsias de tejido. Se pueden comparar la expresión de diversas caspasas a la vez. Desventajas Alta calidad de anticuerpos. Técnica compleja requiere tiempo. La presencia de caspasa procesada no significa necesariamente activación. Se requiere estudios complementarios.

38

39

40 Proliferación Celular El grado de división celular está íntimamente relacionado con el crecimiento, los cambios adaptativos al medio, la diferenciación y la renovación de los tejidos. La multiplicación celular es un proceso inducido por factores de diversa naturaleza química, como factores ambientales, factores de crecimiento, citoquinas estimuladoras e inhibidoras, etc. En el control de la división celular intervienen: Ciclinas: D, E, A, B Quinasas dependientas de ciclinas: CDK

41 Ciclo Celular S

42 Métodos de estudio Eventos morfológicos y bioquímicos Aumento del número de células Evidencia de mitosis Detección de antígenos que participan en la proliferación o ciclo celular Síntesis y replicación del ADN Actividad Metabólica Técnicas de detección Microscopía Electrónica Microscopía Fotónica Microscopía de fluorescencia Inmunohistoquímica (PCNA, Ki-67) Incorporación de BrdU o Timidina 3 H Métodos Colorimétricos (MTT, XTT, WST-1)

43 Estudio Morfológico Morfometría

44 Microscopía Electrónica

45 Microscopía de Fluorescencia

46 Métodos Inmunohistoquímicos

47 Métodos Inmunohistoquímicos Detección de Ki-67 antígeno nuclear que se expresa exclusivamente en las células que entran al ciclo celular (fases G1, S, G2 y mitosis. Detección de PCNA (proliferating cell nuclear antigen) Proteína nuclear que se expresa durante la proliferación. Interactúa con la ADN polimerasa D

48 Métodos Inmunohistoquímicos Detección de Ki-67 para MO Detección de PCNA en MF

49 Incorporación de BrdU

50 Incorporación de BrdU Durante la fase S del Ciclo, las células sintetizan y replican sus genomas. Si se agregan precursores de ADN marcados (BrdU es un análogo de la timidina) en los sistemas celulares, éstos son incorporados al ADN de la célula. Esta incorporación puede detectarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales anti-brdu.

51 Incorporación de BrdU Puede ser utilizado en: Líneas celulares (cultivos o en células en suspensión) Tejidos congelados Tejidos incluidos en parafina

52 Centro de Microscopía Electrónica Universidad Nacional de Córdoba

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