LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE DENGUE InDRE RNLSP 2012

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1 LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE DENGUE InDRE RNLSP 2012 Versión 2.0 Página 1 de 62

2 SECRETARIA DE SALUD SALOMÓN CHERTORIVSKI WOLDENBERG SECRETARIO DE SALUD DR. PABLO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDÁN DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO LIC. JESÚS OMAR CASTILLO HERNÁNDEZ SUBDIRECTOR DE OPERACIÓN QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIA QC. ISRAEL PARRA ORTEGA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE PRUEBAS M. EN C. MAURICIO VÁZQUEZ PICHARDO COORDINADOR DE ENFERMEDADES VIRALES ZOONOTICAS Y POR VECTOR ENCARGADO DEL LABORATORIO DE ARBOVIRUS Página 2 de 62

3 Contenido I. OBJETIVO GENERAL 5 II. ANTECEDENTES DE LA RNLSP PARA EL DIAGNÓSTICO DE DENGUE 5 III. DIAGNÓSTICO POR LABORATORIO 7 IV. LINEAMIENTOS PARA SEGUIMIENTO DEL ALGORITMO PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE DENGUE 8 A. MUESTRAS RECIBIDAS EN EL LABORATORIO ENTRE 0-5 DÍAS DE HABER INICIADO LA FIEBRE 10 B. MUESTRAS RECIBIDAS EN EL LABORATORIO CON 6 DÍAS DE HABER INICIADO LA FIEBRE 11 C) ESTÁNDAR DEL SERVICIO 12 V. USO DE PRUEBAS RÁPIDAS PARA EL DIAGNÓSTICO 12 VI. CLÍNICA DE MONITOREO Y MUESTRAS DE DEFUNCIONES 13 VII. EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO 14 VIII. BANCO DE SUEROS 17 IX. VIGILANCIA VIROLÓGICA 17 X. LINEAMIENTOS PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DEL VIRUS DENGUE MEDIANTE RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL 18 A. LABORATORIOS ESTATALES QUE AÚN NO REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE 18 B. LABORATORIOS ESTATALES QUE YA REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE 18 Control de Calidad 18 Liberación de la Metodología 19 Reporte de Resultados 19 Evaluación del Desempeño 20 C. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS POR INMUNOFLUORESCENCIA 21 XI. SISTEMAS DE INFORMACIÓN 22 Página 3 de 62

4 A) INFORMACIÓN SEMANAL DE LOS LESP 22 B) INFORMACIÓN RELACIONADA CON LA PLATAFORMA ÚNICA PARA DENGUE 23 XII. DOCUMENTOS DE REFERENCIA 26 XIII. BIBLIOGRAFÍA 25 XIV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 28 XV. APARTADOS TÉCNICOS 29 SEROLOGÍA Determinación del antígeno viral NS1 de Virus Dengue por ELISA Determinación de anticuerpos IgM para diagnóstico de Dengue por ELISA Determinación de anticuerpos IgG para diagnóstico de Dengue por ELISA 42 BIOLOGÍA MOLECULAR Detección e identificación de serotipos del virus dengue por RT PCR Múltiplex en Tiempo Real 47 Página 4 de 62

5 I. Objetivo General Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico de Fiebre por Dengue (FD) y Fiebre Hemorrágica por Dengue (FHD) y establecer el manejo adecuado de la información generada por laboratorio, a través de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a la Vigilancia Epidemiológica de esta enfermedad. II. Antecedentes de la RNLSP para el Diagnóstico de Dengue La conformación de la red de diagnóstico de Dengue empezó en 1995 con 7 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP). El Laboratorio de Arbovirus del InDRE ha ofrecido a la red cursos de capacitación, capacitaciones en servicio, supervisiones y asesorías, incluyendo el apoyo con equipo e insumos en caso de emergencias epidemiológicas y desastres. El laboratorio de Arbovirus también envía reactivos para realizar la determinación de anticuerpos tipo IgM con MAC-ELISA y con reactivos comerciales. Desde 1999 el InDRE inició un programa de Control de Calidad en el que la red envía el 100% de las muestras positivas y un 10% de las muestras negativas a Dengue. En el 2002 la RNLSP se incorporó al Programa Caminando a la Excelencia para evaluar el desempeño de los estados respecto a los programas prioritarios de la salud para fomentar su desarrollo. En el año 2003 se empieza a realizar la evaluación del desempeño a través del envío de paneles de eficiencia y se establece el envío únicamente de probables FHD para control de calidad. El marco analítico de la Red para el diagnóstico de esta enfermedad está conformado por el diagnóstico serológico (31 Laboratorios Estatales realizan determinación de anticuerpos IgM y determinación de antígeno NS1, 23 realizan también determinación de IgG). Dos Laboratorios Estatales (Sonora y Veracruz) realizan aislamiento viral e identificación de serotipos por Inmunofluorescencia. Página 5 de 62

6 En marzo 2010, el Laboratorio de Arbovirus del InDRE, capacitó al personal de 28 Laboratorios Estatales que conforman la RNLSP para dar a conocer el protocolo Detección y Serotipificación de Virus Dengue Mediante RT-PCR Multiplex en Tiempo Real validado por el CDC-Dengue Branch de San Juan Puerto Rico, con la finalidad de que cada LESP realice la Vigilancia Virológica en su entidad. El seguimiento de la implementación de esta metodología se notificó mediante una cédula. Trece LESP iniciaron la etapa de control de calidad para RT- PCR Tiempo Real para Dengue durante el 2011: Baja California Sur, Chiapas, Guerrero, Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Tabasco, Chihuahua, Sonora, Jalisco, Veracruz y Yucatán y actualmente los primeros 11 ya tienen liberada la metodología al cumplir con los parámetros de concordancia requeridos por el Laboratorio de Arbovirus (95% de concordancia). Actualmente el LESP de Chihuahua ya cuenta con la implementación de la técnica, pero por ser un estado no endémico y por no tener muestras positivas a NS1, la liberación de la técnica se basó en la aplicación de un panel para la evaluación externa del desempeño, mismo que cumplió obteniendo un resultado sobresaliente (90-100% de concordancia); Este mismo lineamiento aplicará para aquellos LESP que este en la misma situación. De no pasar el panel en estos casos no se liberará el método. Esto último permitirá que estos estados tengan las herramientas listas para cualquier contingencia al presentarse casos positivos de NS1. Figura 1. Los estados de color rojo son aquellos que cuentan con la metodología liberada de RT- PCR Múltiplex en Tiempo Real. Los estados de color azul son los que actualmente se encuentran en la fase de control de calidad y los estados de color blanco están en fase de implementación. Página 6 de 62

7 III. Diagnóstico por laboratorio Para el diagnóstico de Dengue es necesario contar con suero del paciente, el cual es obtenido a través de una muestra de sangre completa extraída por venopunción (aprox. 5 mililitros) sin usar anticoagulante; aproximadamente 2.5 mililitros de suero serán obtenidos, los cuales deberán enviarse al LESP inmediatamente para realizar los ensayos correspondientes. La muestra debe mantenerse siempre en refrigeración (2-8 C) desde la toma hasta la llegada al LESP. La muestra deberá venir acompañada con el Formato Único de Envío de Muestras (F-REM-01) debidamente llenado, sin datos alterados o sobre escritos y en dado caso es conveniente que se indique la gravedad del paciente; las muestras que no cumplan con los requisitos establecidos en el Manual para la Toma, Envío y Recepción de Muestras (REM-MA- 03), serán rechazadas sin ninguna excepción. Cuando todos los estados estén capturando en el sistema de Plataforma Única para Dengue se requerirá únicamente el listado nominal y el número de folio otorgado por el mismo sistema. De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA-2002, para la Vigilancia Epidemiológica, Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por Vector, las técnicas alternativas para confirmar o descartar un caso probable en los primeros días de haber iniciado con la fiebre (0-5 días) es detectar y tipificar al virus mediante técnicas virológicas (aislamiento viral en cultivo de células e identificación por inmunofluorescencia indirecta) o moleculares (RT-PCR en tiempo real o punto final). A finales del año 2006 apareció una alternativa en formato de ELISA más fácil, rápida y oportuna para aplicar en los primeros días de evolución. Esta técnica se basa en la identificación de la glicoproteína no estructural 1 del virus dengue (NS1), implicada en los procesos de replicación viral, la cual es secretada permitiendo ser detectada en muestra de suero en fase aguda de la enfermedad. Esta técnica tiene reportada una sensibilidad entre el % (esta es dependiente del serotipo y genotipo responsable de la infección, además de la presencia de altas concentraciones de anticuerpos IgM o IgG) y una especificidad de 100%, y que junto con las técnicas comerciales ya existentes para determinación de IgM (sensibilidad de 94.7% y especificidad del 97.2%) y para determinación de IgG de segundas infecciones o reinfecciones por serotipos distintos (sensibilidad del 94.5% y especificidad del 97.3%) serán las pruebas consideradas como básicas en la realización del nuevo algoritmo. Para realizar los tres ensayos inmunoenzimáticos se necesita contar con: un lector de ELISA para placas completas con un filtro de 450 nm y otro de referencia entre nm, un lavador para placas completas, una incubadora o baño María (28-37 C) y micropipetas multicanales y sencillas con diferentes volúmenes variables, además de todo el material requerido no incluido en los estuches de diagnóstico. Los procedimientos se deben realizar como lo indican los insertos correspondientes para poder cumplir con la validación de cada ensayo. Es importante aclarar que las muestras a procesar por cualquiera de éstas técnicas se manejen en estricta red fría, es decir que no permanezcan a temperatura ambiente; se sugiere sacar las muestras del refrigerador hasta el momento de realizar cada procedimiento y una vez terminado el uso de las mismas se deben mantener almacenadas a 4 C. De ser posible, se recomienda que para el manejo de las mismas Página 7 de 62

8 (ya sea al momento de rotularlas, usarlas en cada técnica y separar en alícuotas) se coloque una la gradilla sobre una cama de hielo o de refrigerantes congelados. En caso de manejar un gran número de muestras por corrida (arriba de 50), deberá hacerse en bloques de 25 ó 30 muestras para asegurar la red fría y se deberá cambiar los congelantes y el hielo durante cada bloque. El énfasis para el manejo de muestras en estrictas condiciones de red fría, radica en aumentar las posibilidades de aislamiento viral y detección de material genético, ya que los cambios de temperatura promueven la degradación de las proteínas de superficie de la partícula viral y evitar la degradación del RNA del virus ya que es altamente termolábil e inestable. IV. Lineamientos para seguimiento del Algoritmo para diagnóstico serológico de Dengue La propuesta algoritmo para el diagnóstico de Dengue deriva de tres premisas básicas: 1) La necesidad de mejorar el porcentaje de casos confirmados por laboratorio con respecto de los casos probables utilizando una sola muestra. 2) La necesidad de contar con un diagnóstico oportuno, que promueva una completa y mejor vigilancia virológica en el país. La implementación del algoritmo apoyará al Programa Nacional de Prevención y Control del Dengue al contar con información veraz, oportuna y de calidad para iniciar las intervenciones adecuadas, y 3) Identificar aquellas muestras que no son Dengue y promover el diagnóstico diferencial. El algoritmo propuesto fue consensuado en cuatro diferentes reuniones celebradas en México entre los laboratorios de la RNLSP y el InDRE. También fue sometido a la crítica de expertos internacionales en la reunión: Americas Dengue Prevention Board Dengue Surveillance, celebrada en la Ciudad de México del 17 al 19 de enero de Durante los días 26 al 29 de febrero del mismo año, se realizó, en instalaciones del InDRE, el Taller teórico-práctico para la Implementación del nuevo algoritmo para el diagnóstico por laboratorio para Dengue, el cual fue dirigido a los 31 laboratorios estatales que conforman la RNLSP. Los últimos comentarios se discutieron durante la visita de Evaluación del Programa Nacional de Control y Prevención del Dengue en México por parte de la Organización Panamericana de la Salud, del 24 de marzo al 2 de abril de La solicitud por parte del InDRE a la RNLSP fue iniciar la implementación del algoritmo a partir del mes de abril de Este algoritmo involucra la calidad y la oportunidad de la información generada por el componente de laboratorio que coadyuva en la prevención y control del Dengue; el algoritmo se muestra en la siguiente figura: Página 8 de 62

9 Figura 2. Algoritmo de Diagnóstico por Laboratorio para Dengue Página 9 de 62

10 El algoritmo diagnóstico serológico inicia con: A) Muestras recibidas en el Laboratorio entre 0-5 días de haber iniciado la fiebre Determinación del antígeno viral (NS1) por ELISA (Platelia Bio-Rad, Catálogo ó Early ELISA NS1 Inverness Medical Innovations, Catálogo E-DEN02P) Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. En este momento se da por terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado (a excepción del serotipo identificado por RT-PCR, si es que fue seleccionada para la vigilancia virológica). El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 1.0 unidad. Negativo: El laboratorio NO reportará el resultado y se realizará la siguiente prueba indicada en el algoritmo: ELISA para IgG (cuando la muestra tenga 0-3 días de iniciada la fiebre) o ELISA para IgM (cuando la muestra tenga de 4-5 días de iniciada la fiebre). Determinación de IgM por ELISA (PanBio No. catálogo E-DEN01M), únicamente para las muestras que tengan entre 4-5 días de haber iniciado la fiebre. Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. En este momento se da por terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 11.0 unidades. Negativo: El laboratorio NO reportará el resultado y realizará la determinación de IgG. Determinación de IgG por ELISA (PanBio, No. de catálogo E-DEN02G), únicamente para muestras que estén entre 0-3 días, infección reciente (infecciones secundarias). Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. En este momento se da por terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 22.0 unidades. Negativo: El laboratorio reportará únicamente este resultado, dando por hecho que todas las pruebas antes mencionadas fueron realizadas y tuvieron un resultando negativo. En este momento se da por terminado el algoritmo. El valor reportado que representa a un negativo es menor o igual a 18.0 unidades. Una muestra negativa a las tres pruebas previas se considera negativa a Dengue y se deberá realizar diagnóstico diferencial para otras Arbovirosis, las muestras serán enviadas a InDRE con base en el diagnóstico clínico y previa solicitud de Vigilancia Epidemiológica Estatal (casos graves, defunciones), ya sea para identificación de flavivirus no Dengue o alfavirus como: Virus del Oeste del Nilo (VON), Encefalitis de San Luis (ESL), fiebre amarilla (YFV), Encefalitis Equina del Oeste (EEO), Encefalitis Equina del Este (EEE), Encefalitis Venezolana (EEV) y virus Chikungunya (CHKV); además de EFE s, Leptospira, Rickettsias o Hantavirus (en caso de signos hemorrágicos). A finales de 2012 la RLSP recibirá la capacitación para comenzar a realizar el diagnóstico diferencial de Arbovirosis. Página 10 de 62

11 Ante casos de fiebre icterohemorrágica, se sugiere realizar diagnóstico diferencial con Fiebre Amarilla a personas que viajaron a zonas endémicas. En zonas endémicas para leptospira se sugiere realizar la prueba rápida al mismo tiempo que se inicie con el algoritmo de Dengue. Una vez que se cuente con los diagnósticos implementados (finales del 2012), se ofrecerán al Sistema de vigilancia epidemiológica y en el momento que esté lo considere pertinente, se realizara en el InDRE la detección ampliada para otras familias de Arbovirus identificados en las Américas, como Bunyanvirus (virus Oropuche, La Crosse), Arenavirus hemorrágicos (virus Machupo, Guaranito, Junin, Lassa). B) Muestras recibidas en el Laboratorio con 6 días de haber iniciado la fiebre Se inicia el proceso con: Determinación de IgM por ELISA. Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso laboratorio reportará este resultado, en este momento se da por terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 11.0 unidades. Negativo: El laboratorio NO reportará el resultado y realizará la siguiente prueba indicada en el algoritmo. En este caso será determinación de IgG. Determinación de IgG por ELISA. Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará únicamente este resultado, en este momento se da por terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 22.0 unidades. Negativo: El laboratorio reportará únicamente este resultado, dando por hecho que todas las pruebas antes mencionadas fueron realizadas y tuvieron un resultando negativo. En este momento se da por terminado el algoritmo.. El valor reportado que representa a un negativo es menor o igual a 18.0 unidades. Una muestra negativa a las dos pruebas previas se considera se considera negativa a Dengue y se deberá realizar diagnóstico diferencial, las muestras serán enviadas a InDRE con base en el diagnóstico clínico y previa solicitud de Vigilancia Epidemiológica Estatal (casos graves), ya sea para identificación serológica de Flavivirus no Dengue o Alfavirus como: Virus del Oeste del Nilo, Encefalitis de San Luis, Fiebre Amarilla, Encefalitis del Oeste, del Este, Venezolana y Virus Chikungunya; además de EFE s, Leptospira, Rickettsias o Hantavirus (en caso de signos hemorrágicos). Ante casos de fiebre icterohemorrágica, se sugiere realizar diagnóstico diferencial con Fiebre Amarilla a personas que viajaron a zonas endémicas. En zonas endémicas para leptospira se sugiere realizar la prueba rápida al mismo tiempo que se Página 11 de 62

12 inicie con el algoritmo de Dengue. Se pueden solicitar que se realicen otros diagnósticos según las necesidades que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica considere pertinentes. En dado caso que se obtengan resultados indeterminados por alguna de las técnicas mencionadas anteriormente se procederá de la siguiente forma: Indeterminado para determinación de NS1 por ELISA. No se deberá reportar el resultado como indeterminado y se procederá a procesar nuevamente la muestra por duplicado como lo indica el inserto y si se obtiene el mismo resultado (indeterminado), realizar la siguiente prueba indicada en el algoritmo según corresponda. Indeterminado para determinación de IgM por ELISA. No se deberá reportar el resultado como indeterminado, y se procederá a procesar nuevamente la muestra por duplicado como lo indica el inserto y si se obtiene el mismo resultado (indeterminado), realizar la siguiente prueba indicada en el algoritmo según corresponda. Indeterminado para determinación de IgG por ELISA. No se deberá reportar el resultado como indeterminado, y se procederá a procesar nuevamente la muestra por duplicado como lo indica el inserto y si se obtiene el mismo resultado (indeterminado) se enviará al InDRE para diagnóstico. C) Estándar del servicio El tiempo máximo para el reporte de resultados hasta finalizar con el algoritmo es decir hasta la realización de IgG, será de 3 días hábiles. En caso de emergencia epidemiológica cada LESP deberá elaborar un plan de respuesta rápida en donde se incluya laborar todos los días de la semana. V. Uso de pruebas rápidas para el diagnóstico. Durante situaciones de emergencias e inundaciones hay sitios inaccesibles y el exceso de muestras satura el LESP, por lo que se requiere contar con un diagnóstico oportuno y confiable. Para ello, se propone un algoritmo que permita confirmar casos de una forma rápida y práctica con el uso de pruebas rápidas, las cuales reportan una sensibilidad y especificidad del 70%. La decisión de cuando usar esta prueba será con base al Manual de Vigilancia Epidemiológica y debe ser definido por Vigilancia Epidemiológica Estatal, previa autorización por la Dirección General Adjunta de Epidemiología, del Nivel Federal. Este tipo de metodología deberá ser realizada únicamente por los LESP. En situación normal se deberán realizar las pruebas indicadas en el algoritmo. Prueba rápida Dengue Dúo Cassette (Panbio, No. de catálogo E-DEN01D). Para las muestras desde 0 a 6 días de haber iniciado con fiebre. Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. Se realizará una selección aleatoria, para que uno de cada 10 casos positivos siga el procedimiento del nuevo algoritmo. Página 12 de 62

13 Negativo: La muestra deberá ser procesada siguiendo el nuevo algoritmo con base en los días de evolución. Si el InDRE tuviera la evaluación de cualquier otra técnica y que cumpliera con los estándares requeridos para ser usada en el diagnóstico de Dengue en México, se informara inmediatamente a los LESP. VI. Clínica de Monitoreo y Muestras de defunciones El funcionamiento de la clínica de monitoreo estará determinado por Vigilancia Epidemiológica Estatal y se establecerá únicamente cuando se presente un brote, por lo que en estos casos se establecerá una sola clínica en la que se deberá muestrear al 100% de los casos probables y permanecerá funcionando mientras dure la contingencia en un brote, por lo que Vigilancia Epidemiológica Estatal deberá notificarlo a el LESP correspondiente. El procedimiento del laboratorio para las muestras generadas en esta clínica se llevará a cabo siguiendo el algoritmo de diagnóstico y se deberá ingresar la información correspondiente de cada muestra recibida en la base de Dengue de cada LESP. Las muestras de defunciones por probable FHD (positivas y negativas) ya no se enviarán al InDRE a excepción de que se requiera realizar diagnóstico diferencial de algún diagnóstico que no tenga el LESP. Por lo que para la dictaminación de defunciones en los Comités de Vigilancia Epidemiológica, Estatal y Nacional (CEVE y CONAVE) se tomarán únicamente los resultados obtenidos en los LESP, a reserva de que se tengan resultados de diagnóstico diferencial mismo que se notificara a los LESP. Para aquellos laboratorios que obtengan clasificación No aceptable en la evaluación del desempeño, deberán enviar todas las muestras de defunciones al InDRE (100% de positivas y negativas), hasta que la clasificación en la evaluación del desempeño sea aprobatoria y se emita un documento al LESP en cuestión, en donde se le indicará que se suspende el envío de muestras de defunciones ya que el diagnóstico se realizara en el LESP nuevamente. Página 13 de 62

14 VII. Evaluación del Desempeño Dentro de los ensayos de aptitud se encuentran los Programas de Evaluación Externa del Desempeño (PEED), herramienta que utiliza el InDRE para la evaluación continua de la competencia técnica y la identificación de necesidades de fortalecimiento de un individuo, de un grupo de laboratorio o de las redes de diagnóstico específico mediante el envío a intervalos regulares continuos de paneles de muestras caracterizadas. El uso de los PEED como auxiliares en la evaluación del desempeño de los laboratorios de la RNLSP requiere que operen correctamente y en armonía con los requerimientos de desarrollo de las redes de diagnóstico. Dentro de este lineamiento para Dengue, se cuenta con paneles serológicos y moleculares, los cuales a partir de julio del 2012 se enfocaran como PANELES INTELIGENTES O ALGORITMICOS. Serología Laboratorios que pertenecen a la Red de Dengue (LESP y laboratorios de Apoyo al SINAVE) El procedimiento para estos laboratorios se realizará de la siguiente forma: Envío de un primer panel de eficiencia (En enero del año en curso). Conformado para la determinación de anticuerpos tipo IgM, IgG y antígeno NS1 (dependiendo de la regionalización del marco analítico). Envío de un segundo panel de eficiencia en (En julio del año en curso). Conformado para la determinación de IgM, IgG y de NS1 (dependiendo de la regionalización del marco analítico). El formato del panel estará basado en la determinación de los tres componentes antes mencionados, en el cual se pondrá a prueba el marco analítico de cada LESP (paneles inteligentes), lo que significa que a partir del segundo ciclo de la evaluación del desempeño en 2012, se enviaran paneles para evaluar del algoritmo vigente y no metodologías por separado. Se enviaran muestras de suero codificadas, las cuales deberán ser procesadas según el algoritmo, basándose en los días de evolución de la enfermedad que indique el instructivo del laboratorio de Arbovirus. A partir del primer ciclo de paneles del 2013 se incorporará en este tipo de paneles los de NAT-DEN (RT-PCR Multiplex en Tiempo real), en los cuales se incluirá la tipificación de virus dengue de aquellas muestras positivas a NS1, tal y como lo indica el algoritmo Con base en los resultados de concordancia obtenidos en los paneles se clasificará a los LESP como sigue: 1. LESP que hayan obtenido una calificación entre % de concordancia, se clasifican como SOBRESALIENTES. Página 14 de 62

15 2. LESP que hayan obtenido una calificación entre 81-89% de concordancia, se clasifican como SATISFACTORIOS. 3. LESP que hayan obtenido una calificación igual o menor al 80% de concordancia, se clasifican como NO ACEPTABLES. Para los laboratorios que obtengan clasificación SOBRESALIENTE o, SATISFACTORIA se procederá de la siguiente forma: Ya no enviarán muestras para Control de Calidad al InDRE de cualquier técnica empleada en el LESP (determinación de IgM, IgG, NS1 o de PCR). La evaluación del desempeño se realizará únicamente a través de paneles de eficiencia, que se enviarán 2 veces por año. Para los laboratorios que obtengan calificación No aceptable, se procederá de la siguiente forma: Se solicitará la elaboración de un plan de mejora que deberán enviar al InDRE en un tiempo no mayor a una semana después de la notificación de esta calificación. El InDRE analizará el plan de mejora y de no cumplir con las expectativas necesarias para solventar la contingencia, el InDRE realizará una auditoría y asesoría técnica al laboratorio implicado para evaluar la competencia técnica. Se enviará un tercer panel, a petición y compra del LESP, que de nuevo servirá para las acciones correctivas implementadas por el Laboratorio. Si se obtiene nuevamente un resultado No aceptable se solicitará el cambio del analista para el diagnóstico de Dengue en el LESP y se suspenderá inmediatamente el diagnóstico. El nuevo analista recibirá capacitación inmediata en el InDRE durante una semana, durante la cual se incluirá un examen teórico y practico al inicio y al final. Una vez capacitado el analista, se reanudará el diagnóstico inmediatamente. Derivado de los puntos anteriores y únicamente mientras dure el proceso de mejora deberán enviar para control de calidad el 100% de positivos y el 10% de negativos de todas las muestras de probables FD y FHD. Los Laboratorios de Apoyo al SINAVE que tienen Laboratorios Locales en donde se realizan las pruebas de Dengue, deberán: Regular las actividades de Diagnóstico. Supervisar la ejecución del algoritmo de Diagnóstico para Dengue. Implementar el Sistema de Evaluación del Desempeño (a través de paneles de eficiencia). Planificar supervisiones y capacitaciones en servicio. Solicitar la clave de acceso al Sistema de Captura, Plataforma única, módulo dengue, y así ingresar inmediatamente los resultados generados, cumpliendo así con los tiempos establecidos para los indicadores en servicio de cada prueba realizada. Página 15 de 62

16 Laboratorios que requieren ingresar a la Red de Dengue El procedimiento para la evaluación del desempeño de estos laboratorios se hará de la siguiente forma: Los laboratorios demostraran que cuentan con la infraestructura necesaria para llevar a cabo el Diagnóstico (instalaciones, equipo y reactivos). El laboratorio solicitara una capacitación y el o los analistas la recibirán durante una semana, durante la cual, se incluirá un examen teórico y practico al inicio y al final. La implementación del diagnóstico deberá ser en un lapso no mayor a 15 días naturales después de haber recibido la capacitación. Se enviará un primer panel de eficiencia un mes después de la implementación (previa solicitud oficial), para evaluar el desempeño en la determinación de antígeno NS1 y anticuerpos IgM e IgG. Como parte del proceso de Control de Calidad, deberán enviar al InDRE el 100% de los positivos y el 10% de los negativos durante 3 meses. Si con estos parámetros se obtiene la clasificación de sobresaliente o satisfactoria durante el periodo de evaluación, se suspenderá el envío de muestras para control de calidad y únicamente serán evaluados a través de paneles de eficiencia dos veces por año. Si se obtiene un resultado No aceptable se procederá a solicitar un plan de mejora que deberán enviar al InDRE en un tiempo no mayor a una semana, se realizará una auditoría y asesoría técnica para evaluar la competencia técnica; posterior a esto se enviará un segundo panel, a petición y compra del LESP, que de nuevo servirá para la evaluación del desempeño, si se obtiene de nuevo clasificación No aceptable entonces se procederá a solicitar el cambio del analista para el diagnóstico de Dengue en el LESP y se suspenderá inmediatamente el diagnóstico en tanto no se compruebe la competencia técnica en el Laboratorio. El nuevo analista recibirá capacitación inmediata en el InDRE durante una semana, durante la cual se incluirá un examen teórico y practico al inicio y al final. Una vez capacitado el analista, se reanudará el diagnóstico inmediatamente. Derivado de los puntos anteriores y únicamente mientras dure el proceso de mejora deberán enviar para control de calidad el 100% de positivos y el 10% de negativos de todas las muestras de probables FD y FDH. Aunado a estos sistemas de evaluación también se realizarán supervisiones a los laboratorios con la aplicación de una cédula estandarizada para la evaluación del proceso y así comprobar la competencia técnica, misma que deberá ser mayor del 90%. (Ver cronograma de actividades). En el momento que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica considere pertinente realizar alguna modificación en cualquiera de los puntos de la evaluación externa del desempeño, se informara a la RNLSP inmediatamente. Página 16 de 62

17 Control de Calidad Con la finalidad de evaluar la reproducibilidad y repetibilidad de cada método empleado, cada cuatro meses el InDRE solicitará a cada LESP (a través de correo electrónico) el envío continuo durante una semana, de los registros de proceso realizados, además de las lecturas obtenidas para cada determinación realizada. De no recibir el InDRE la información solicitada en tiempo y forma, el LESP recibirá un primer extrañamiento, que lo obligara a brindar explicación oficial en los siguientes cinco días, del motivo por el cual no envió información solicitada. VIII. Banco de Sueros Con el objetivo de mantener el banco de material biológico, que servirá para realizar paneles de eficiencia, para obtener controles de referencia, o para estudios que permitan implementación de nuevas técnicas de diagnóstico diferencial para otras Arbovirosis; cada trimestre todos los LESP enviarán: El 20% de muestras positivas y 20% de las muestras negativas para IgM e IgG, LESP que realizan identificación de serotipos mediante RT-PCR y que cuentan con la liberación del diagnóstico, deberán enviar el 40% de muestras positivas (que incluya todos los serotipos identificados en su estado) a esta técnica y 50% de muestras negativas para NS1. LESP que realizan identificación de serotipos mediante RT-PCR y que NO cuentan aun con la liberación del diagnóstico, deberán enviar el 25% de muestras positivas a esta técnica y 50% de muestras negativas para NS1. LESP que NO realizan identificación de serotipos, deberán enviar el 100% de positivas al inicio de los brotes y a los dos meses de estas actividades enviaran el 30% de muestras positivas y 50% negativas para NS1. Para el envío de estas muestras, se deberán usar viales de polipropileno tipo eppendorff o criotubos que deberán rotularse con el número de folio y la tapa deberá sellarse con papel parafilm, y que no estén contaminadas, lipémicas ni hemolizadas. El volumen mínimo será de 750 microlitros. Es necesario indicar en el oficio de envío que se trata de material biológico para Banco de Sueros para Dengue y otras Arbovirosis y se deberá anexar el siguiente formato con los datos solicitados y debidamente requisitados. Folio Fecha de inicio Fecha de toma Sexo Edad Localidad Resultados de IgM, IgG o NS1 con D.O. Resultados de PCR con serotipo y valor de Ct IX. Vigilancia Virológica. El InDRE y los estados que cuenten con el aval, según lo indicado en puntos anteriores, realizarán la detección e identificación de serotipos circulantes de virus dengue usando métodos de biología molecular como la RT-PCR Múltiplex en Tiempo Real, o en su caso, aislamiento viral, como pruebas de oro. El InDRE contará con otras metodologías que le permitan actuar como un verdadero Instituto de REFERENCIA. Página 17 de 62

18 La importancia de identificar los serotipos circulantes radica en tener la información para poder predecir brotes por serotipos relacionados con cuadros clínicos graves, identificar localidades de riesgo, comprender la dinámica de transmisión, que permitan fortalecer la vigilancia virológica en el país. Todos los Laboratorios Estatales de Salud Pública enviarán la base nominal completa acumulada de datos en formato electrónico los días martes antes de las 8 pm. En este se deberá incluir de manera obligatoria la existencia de estuches para diagnóstico serológico y de reactivos para vigilancia virológica, que permitan al InDRE identificar y actuar con acciones inmediatas, para anticipar retrasos en los resultados. *Si el InDRE implementa nuevas metodologías de biología molecular para la detección viral, que permitan mejorar la Vigilancia Virológica de Dengue en México, se promoverá un curso de actualización inmediatamente, dirigido a los LESP que el InDRE considere pertinentes. El formato del Curso quedara sujeto a las necesidades que promuevan una mejor difusión. X. Lineamientos para la Detección e identificación de serotipos de virus dengue mediante RT PCR Multiplex en Tiempo Real. A. Laboratorios Estatales que aún NO realicen RT-PCR Multiplex en Tiempo Real para detección e identificación de serotipos de virus dengue: Los LESP deberán enviar al InDRE, semanalmente (para una oportuna vigilancia virológica) y de manera obligatoria, el 10% de las muestras positivas a NS1 para FD y el 100% de las muestras positivas a NS1 para FDH, que serán procesadas para la detección y serotipificación de virus dengue por RT-PCR Múltiplex en Tiempo Real. Con el objetivo de aumentar el porcentaje de tipificaciones de las muestras analizadas para este fin; las muestras positivas a NS1 que envíen los LESP, deberán preferentemente ser aquellas que tengan entre 0-3 días de evolución de la enfermedad. La solicitud del porcentaje y características de las muestras, puede variar según las necesidades que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica considere pertinentes. Estas muestras deberán venir acompañadas con el Formato Único de Envío (F-REM- 01) debidamente requisado y un listado con los resultados obtenidos para el ensayo de antígeno NS1 en el LESP (densidad óptica de la muestra, valor de corte e interpretación de resultado). InDRE emitirá el informe de prueba por escrito y lo enviará para que cada LESP capture inmediatamente el resultado en su estado así como en Plataforma Única, Módulo Dengue. B. Laboratorios Estatales que ya realicen RT-PCR Multiplex en Tiempo Real para detección e identificación de serotipos de virus dengue: Control de Calidad. Los LESP que se estén incorporando al Control de Calidad supervisado por InDRE, deberán coordinarse perfectamente entre sus áreas de Página 18 de 62

19 serología (o virología) y biología molecular para trabajar conjuntamente de la siguiente manera: 1. Según algoritmo, procesar localmente las muestras para determinación de antígeno NS1, (no enviar al InDRE) y según el resultado obtenido, procesar el 10% de las muestras positivas de FD y el 100% de las muestras positivas de FHD mediante RT PCR en Tiempo Real. Con el objetivo de aumentar el porcentaje de tipificación, las muestras analizadas por RT-PCR preferentemente deberán tener entre 0-3 días de evolución. 2. El LESP enviará al InDRE, las muestras séricas originales, un listado con todos los resultados obtenidos para NS1 (densidad óptica de la muestra, valor de corte e interpretación de resultado) así como el resultado de RT-PCR especificando el serotipo, valor de Ct y resultados gráficos de amplificación de los ensayos realizados, del 100% de las muestras positivas y el 10% de negativas durante por lo menos 6 meses. Este proceso se realizará hasta obtener una concordancia entre resultados del 100% y esta deberá mantenerla el LESP durante los últimos dos meses consecutivos, para ser propuesto para la liberación de la metodología. 3. Así el InDRE, analizará el resultado de concordancia entre resultados para calificar la competencia técnica del LESP y en las siguientes semanas poder liberarles la metodología. 4. En caso de no cumplir con las concordancia requerida para liberación de la metodología durante los seis meses, será necesario realizar una supervisión y asesoría técnica vía webex o presencial a las instalaciones y personal técnico responsable de realizar la Vigilancia Virológica de Dengue en el LESP. Liberación de la metodología. Este informe se dará a conocer oficialmente al LESP mediante un documento que manifieste el resultado de concordancia obtenida durante el proceso de Control de Calidad así como la notificación correspondiente de la fecha de liberación de la metodología. Reporte de Resultados. El LESP realizará la RT PCR Múltiplex en Tiempo Real para Dengue con la finalidad de mantener la vigilancia virológica a nivel estatal y será responsable de emitir los informes de prueba especificando el resultado obtenido, negativo o positivo y el serotipo o serotipos identificados. Estos resultados deberán ser ingresados a la Plataforma única, módulo de Dengue, así como especificarlo en el informe que envían semanalmente al InDRE. *Todos aquellos LESP (NO IMPORTANDO SI TIENE LIBERADA LA METODOLOGÍA) que identifiquen algún serotipo que en ese momento no ha sido identificado en su localidad o que en México no se ha reportado su circulación, DEBERÁ SER INMEDIATAMENTE INFORMADO A LOS SITEMAS DE SALUD ESTATAL Y FEDERAL y la muestra de suero y RNA deberá ser enviada inmediatamente al InDRE para corroborar el resultado del LESP antes de subir el resultado a plataforma. *Todos aquellos LESP que realicen investigación o que estén realizando la Vigilancia Virológica de Dengue además del RT-qPCR Multiplex con algún otro método Página 19 de 62

20 molecular, deberán informar al InDRE para evitar problemas de concordancia y poder evaluar su uso. Evaluación del Desempeño. La evaluación del desempeño para RT PCR Múltiplex en Tiempo Real (NAT-DEN) se realizará mediante paneles de evaluación que InDRE enviará al LESP 2 veces por año (previa notificación). A partir del segundo ciclo de 2012 se enviaran PANELES INTELIGENTES, en los cuales se incorporará la Detección y Tipificación de virus dengue, los cuales incluyen evaluación de paneles algorítmicos. En base a los resultados obtenidos en los paneles se clasificará al LESP como sigue: 1. LESP que hayan obtenido entre % de concordancia, se clasifican como SOBRESALIENTES. 2. LESP que hayan obtenido entre 81-89% de concordancia, se clasifican como SATISFACTORIOS. 3. LESP que hayan obtenido menor o igual al 80% de concordancia, se clasifican como NO ACEPTABLES. Para los laboratorios que obtengan clasificación Sobresaliente o Satisfactoria, se procederá de la siguiente forma: Seguirán sin enviar muestras para Control de Calidad al InDRE para detección y tipificación viral por RT-PCR Múltiplex en Tiempo Real para Dengue. Estos LESP, el InDRE los identificará como laboratorios NAT-DEN-SS, con el objetivo de ser tomados en cuenta para implementar mejoras continuas y nuevas metodologías en la Vigilancia Virológica de Dengue y otros Arbovirus. Para los laboratorios que obtengan clasificación No aceptable, se procederá de la siguiente: Se solicitará la elaboración de un plan de mejora que deberán enviar al InDRE en un tiempo no mayor a una semana después de la notificación de esta clasificación. Se suspenderá inmediatamente la emisión de resultados por el LESP. Se enviará un tercer panel, a petición y compra del LESP, que de nuevo servirá para la evaluación del desempeño. Se realizará una supervisión y asesoría técnica al laboratorio implicado para evaluar la competencia técnica. El formato de la asesoria será vía webex. Si se obtiene nuevamente un resultado No aceptable se realizará una auditoria y asesoría técnica físicamente a instalaciones y personal responsable de la Vigilancia Virológica. Se solicitará el cambio del analista para la detección y tipificación de virus dengue en el LESP. El nuevo analista recibirá capacitación en el InDRE durante una semana. Página 20 de 62

21 Derivado de los puntos anteriores y únicamente mientras dure el proceso de mejora deberán enviar para control de calidad, durante los siguientes dos meses de haber suspendido la emisión de resultados, el 100% de positivos y el 10% de negativos de todas las muestras de probables FD y FHD procesadas por RT PCR Múltiplex en Tiempo Real. En la Vigilancia Virológica, el reporte de resultados de los serotipos identificados se puede realizar de la siguiente forma: C. Aislamiento e identificación de serotipos mediante inmunofluorescencia indirecta. Si el resultado obtenido es: Positivo: Se reportará el serotipo o serotipos identificado. El laboratorio que cuente con la metodología correspondiente, tendrá que informar el resultado obtenido al remitente de la muestra según sea el caso. Cabe aclarar que las muestras que resulten positivas para aislamiento viral ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que deberá ser considerado como un único caso confirmado. Negativo: El laboratorio deberá también informar el resultado. Cabe aclarar que las muestras que resulten negativas para aislamiento viral ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que se deberá considerar como un único caso confirmado. *Todos los resultados negativos por esta metodología deberán ser corroborados mediante RT-PCR en Tiempo Real. *Para aquellos laboratorios que estén realizando aislamiento viral como herramienta para la Vigilancia Virológica de Dengue y que requieran de una evaluación mediante PEED por parte del InDRE, deberán realizar la petición por escrito y dirigida a la Dirección de Servicios y Apoyo del InDRE, para que se les asigne un PEED especial para esta metodología. El estándar del servicio para emitir un resultado será de 15 días hábiles. Determinación de material genético mediante RT-PCR Múltiplex en Tiempo Real (en casos de extrema urgencia). Este tipo de muestras deberán de ser trabajadas bajo las mismas condiciones que marca el algoritmo, y el resultado deberá ser entregado en un lapso no mayor a 24 horas. Si el resultado obtenido es: Positivo: Se reportará el serotipo identificado. El laboratorio tendrá que informar el resultado obtenido al remitente de la muestra según sea el caso. Cabe aclarar que las muestras que resulten positivas por RT-PCR Múltiplex en Tiempo Real ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que se deberá considerar como único caso confirmado. Página 21 de 62

22 Negativo: El laboratorio deberá también informar este tipo de resultado. Cabe aclarar que las muestras que resulten negativas por RT-PCR Múltiplex en Tiempo Real ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que se deberá considerar como único caso confirmado. Debido a ser catalogado como caso de extrema urgencia, el estándar del servicio para emitir un resultado será de 24horas una vez recibida la muestra en el laboratorio de Arbovirus del InDRE o en el LESP. D. Vigilancia Entomo-Virológica Mediante RT-PCR En Tiempo Real. Esta nueva Vigilancia es resultado de las necesidades que plantea la enfermedad y son el resultado de la implementación de la Epidemiología Inteligente que permite coadyuvar con el programa de vectores para lograr una verdadera epidemiologia preventiva. Durante 2011 se capacitaron los LESP de Oaxaca, Morelos, San Luis Potosí, Nuevo León, Guerrero, Chiapas, Guanajuato y Zacatecas, los cuales fueron seleccionados por contar con los componentes entomológicos y virológicos. Una vez que otros LESP, hagan llegar al InDRE la indicación de que se cuenta con los dos componentes, estos serán seleccionados para la capacitación de este tipo de Vigilancia. 1. Esta Vigilancia será realizada únicamente por aquellos LESP que tengan liberada la metodología de RT-PCR Multipex en Tiempo Real y que cuenten con la contraparte entomológica, quien se hará cargo de la captura y clasificación de los especímenes, los cueles serán entregados en red fría o vivos según sea el caso al área responsable de la Vigilancia Virológica y estos poder llevar a cabo el macerado y clarificado de los especímenes. Este tipo de Vigilancia se realizará en grupos con número de especímenes menores a El tipo de muestra para la Vigilancia Entomo-Virológica aunque puede ser de larvas o de mosquitos adultos, esta última es la más indicada. 3. En caso de captura de huevecillos, estos deberán ser cultivados para obtener mosquitos adultos; análisis que servirá para determinar zonas con transmisión vertical. 4. El LESP es el responsable de notificar inmediatamente al InDRE y al Programa de Vectores de los resultados obtenidos, para la toma de acciones pertinentes. 5. Como seguimiento de los resultados, el LESP deberá enviar al InDRE el 100% de sus clarificados positivos y el 10 % de los negativos, esto NO representa un control de calidad, únicamente servirá para tener un banco de clarificados de mosquitos. XI. Sistemas de Información Con la única finalidad de conocer a nivel nacional toda la información generada en cada Laboratorio y que pueda ser conocida y consultada por las autoridades de este Instituto para los fines que el Programa Nacional de Vectores y la Dirección General Página 22 de 62

23 Adjunta de Epidemiología requieran, es obligatorio que se tengan y se apliquen correctamente los sistemas de información que a continuación se mencionan: A) Información semanal de los LESP. Además del envío de la base nominal, cada LESP deberá enviar el informe semanal en el formato correspondiente, donde se concentra toda la información generada por cada LESP, además de que incluye el reporte de la existencia de reactivos para serología y RT-PCR, además del reporte de los serotipos identificados para aquellos Laboratorios que tengan implementada la metodología. Este informe se debe llenar como a continuación se indica: - La información incluida será únicamente con base en la Fecha de recepción del laboratorio. - Se considerará un solo resultado por muestra recibida (ya sea positivo o negativo) con base en el procedimiento del Algoritmo. - Será responsabilidad de cada LESP actualizar semana a semana esta información, de existir alguna modificación. Se solicita que toda la información venga concentrada en el mismo formato, únicamente lo que diferenciará un archivo de otro será la fecha de elaboración. - Se deberá informar obligatoriamente el reporte de reactivos en existencia. - Se deberá notificar los serotipos identificados (únicamente para los LESP con metodología implementada), éstos ya deberán estar integrados en los confirmados y en la semana correspondiente; ya que en un inicio, se procesaron para determinación de NS1 y solo un porcentaje de positivos a NS1 son los que se incluyen como vigilancia virológica para serotipificación. B) Información relacionada con la Plataforma Única para Dengue En el caso del reporte en Plataforma Única para Dengue el LESP, el laboratorio local y el InDRE tienen acceso a este sistema mediante la solicitud de una clave que fue proporcionada por Vigilancia Epidemiológica Estatal o Federal, para reportar los resultados correspondientes. El apartado correspondiente al laboratorio se describe a continuación. Estudios de Laboratorio. La posibilidad del análisis de laboratorio está en función de las técnicas empleadas para el diagnóstico. Se deberá llenar el procedimiento de laboratorio específico para cada caso, por lo que es necesario ingresar la fecha de toma de la muestra y el LESP tiene la atribución de ingresar el resultado obtenido y la fecha en que se está reportando, así como la obligación de revisar que tenga toda la información que se requiere para poder realizar el diagnóstico de forma oportuna. Las fechas de toma de muestra y de resultado son obligatorias. El LESP recibirá el oficio de solicitud para el diagnóstico junto con el listado de muestras enviadas (con número de folio de identificación para la plataforma y nombre). Con estos datos el laboratorio realizará la Página 23 de 62

24 búsqueda en la opción de Seguimiento al ingresar con su clave en Plataforma Única, ya habiendo ingresado podrá reportar un solo resultado (positivo o negativo) por cada muestra recibida, obtenido por cualquiera de las técnicas siguientes: Determinación de NS1, determinación de IgM, determinación de IgG; según se aplique en su momento con base en el nuevo algoritmo. También se podrá reportar Aislamiento, RT PCR Múltiplex Tiempo Real o prueba rápida (previa autorización de su uso). La variable muestra se refiere al paciente que ya cuenta con muestra para realizar el diagnóstico por laboratorio. Es importante mantener actualizado este dato ya que la plataforma considera este rubro para estimar el porcentaje de muestreo además del porcentaje de positividad. ELISA para determinación de NS1: 1. Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra. 2. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado. 3. Seleccionar el resultado: 4. Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más. 5. Si resulta negativo NO se reportará. El laboratorio deberá realizar la siguiente prueba indicada en el nuevo algoritmo. ELISA para determinación de IgM: 1. Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra. 2. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado. 3. Seleccionar el resultado: 4. Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más. 5. Si resulta negativo NO se reportará. El laboratorio deberá realizar la siguiente prueba indicada en el nuevo algoritmo. ELISA para determinación de IgG: 1. Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra. 2. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado. 3. Seleccionar el resultado: 4. Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más. 5. Si resulta negativo se selecciona (-) y NO se reportará nada más dando por terminado el algoritmo, por lo que se debe interpretar que todas las pruebas antes mencionadas ya se realizaron resultando negativas;, por lo tanto el caso se descarta por laboratorio. Aislamiento Viral y RT PCR en Tiempo Real: En el caso que se requiera ingresar resultados en este rubro la fecha de toma de muestra será la misma que la fecha que se anotó o seleccionó en el rubro de NS1, ya que será la misma muestra para identificar serotipo. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado, que será emitido por el InDRE o por el LESP que tenga implementadas las técnicas para identificar serotipos. Seleccionar el o los serotipos identificados (1, 2, 3 ó 4). Página 24 de 62

25 Prueba rápida: (Siempre y cuando esté aprobado el uso de esta) Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado. Seleccionar el resultado (+ ó -). Es responsabilidad del LESP revisar la información de plataforma semanalmente y checar que las muestras asignadas por epidemiología estatal se encuentren en el laboratorio o de lo contrario solicitarlas para realizar el diagnóstico, ya que aparecen como no realizadas. Página 25 de 62

26 XII. Documentos de Referencia Secretaria de Salud de México (SSA). Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA- 2002, para la vigilancia epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por vector. Publicada en el Diario Oficial de la Federación. Julio de Manual para la Toma, Manejo y Envio de Muestras al InDRE, Procedimiento de Operación Estándar. Aplicación de RT-PCR multiplex en tiempo real, para detección y serotipificación de virus dengue. Centers for Disease Control and Prevention CDC, Dengue Branch de San Juan, Puerto Rico XIII. Bibliografía Halstead SB. Dengue. 2007, Lancet; 370(9599): Dussart P., Labeau B., Lagathu G., et. al. Evaluation of an Enzyme Immunoassay for detection of Dengue Virus NS1 Antigen in Human Serum. Clinical and Vaccine Immunology, 2006, p Kumarasamy V., Chua S. K., et. al. Evaluating the sensitivity of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for early diagnosis of acute dengue virus infection. Singapoure Med. J. 2007; 48(7):669. Pei-Yun S., Li-Kuang C., Shu-Fen C., et. al. Comparison of capture Immunoglobulin M (IgM) and IgG Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Nonstructural Protein NS1 Serotype-Specific IgG ELISA for Differentiation of Primary and Secondary Dengue Virus Infections. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2003, p Pei-Yun S., Shu-Fen C., et. al. Current Status of Dengue Diagnostics as the Center for Disease Control, Taiwan. Dengue Bulletin-Vol. 28, Burke DS, Nisalak A, Ussery MA. Antibodies capture immunoassay detection of japanese encephalitis virus immunoglobulin M and G antibodies in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 1982; 16(6): Bundo K, Igarashi A. Antibody-capture ELISA for detection of immunoglobulin M antibodies in sera from Japanese encephalitis and dengue hemorrhagic fever patients. J Virol Methods. 1985; 11(1):15-22 Li-Jung Chien, Tsai-Ling Liao, Pei-Yun Shu, Jyh-Hsiung Huang, Duane J. Gubler and Gwong-Jen J. Chang2. Development of Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assays To Detect and Serotype Dengue Viruses. J Clin Microbiology. 2006; 44 (4): Areerat Sa-ngasang, Sasitorn Wibulwattanakij, Sumalee Chanama, Et al. Evaluation of RT-PCR as a tool of diagnosis of secondary dengue virus infections J. Infec. Dis. 56, Página 26 de 62

27 Day-Yu Chao, Brent S. Davis, and Gwong-Jen J. Chang. Development of Multiplex Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assays for Detecting Eight Medically Important Flaviviruses in Mosquitoes Journal of Clinical Microbiology Prevention Board, Seoul: International Vaccine Institute. Accelerating Progress in Dengue Control, Dengue Diagnostics in the Americas. A PDVI publication on behalf of the Americas Dengue Instructions for collecting, preparing and mailing specimens for dengue testing at the CDC Dengue Laboratory Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control A joint publication of the World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases (TDR). Página 27 de 62

28 XIV. Cronograma de actividades ACTIVIDAD ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC Envío del primer panel (Serología) a la RNLSP X Recepción de resultados en el InDRE del primer panel X (serología) Envío de resultados a la RNLSP del primer panel X (serología) Envío del segundo panel (Serología) a la X RNLSP Recepción de resultados en el InDRE del segundo panel X (serología) Envío de resultados a la RNLSP del segundo X panel (serología) Envío del primer panel (RT PCR Tiempo Real) a X la RNLSP Recepción de resultados en el InDRE X X del primer panel (RT PCR Tiempo Real) Envío de resultados a la RNLSP del primer panel X (RT PCR Tiempo Real) Envío del segundo panel (RT PCR Tiempo X Real) a la RNLSP Recepción de resultados en el InDRE del segundo panel (RT X PCR Tiempo Real) Envío de resultados a la RNLSP del segundo panel (RT PCR Tiempo X Real) Recepción de muestras para identificación de X X X X X X X X X X X X serotipos Supervisión a la RNLSP X X X Envío de muestras para Banco de Sueros Curso de actualización Vía Webex a LESP con liberación de RT-PCR Curos para la Detección de Arbovirus no dengue mediante RT-PCR Multiplex en Tiempo Real X X X X X NOTA: Para un mejor servicio, el envío y recepción de información, resultados, dudas, etc. será a través de correo electrónico: laboratorioarbovirusindre@yahoo.com.mx. X Este cronograma aplica para 2012, el cronograma para otros años será enviado oportunamente vía la Coordinación de la RNLSP. Página 28 de 62

29 XV. APARTADOS TÉCNICOS SEROLOGÍA Página 29 de 62

30 1. Determinación del antígeno viral NS1 de Virus Dengue por ELISA ELISA PLATELIA NS1 El estuche comercial (Platelia NS1), es un método inmunoenzimántico en una etapa, tipo sándwich, en formato de microplaca de 96 pozos, útil en la detección cualitativa o semicuantitativa del antígeno NS1 del virus del Dengue en suero o en plasma humano. La prueba utiliza anticuerpos monoclonales de ratón (AcMo) para su captura y revelación. Las muestras de pacientes y los controles son incubados directa y simultáneamente con el conjugado diluido durante 90 minutos a 37ºC. El antígeno NS1 presente en la muestra, formará complejos inmunes: AcMo - NS1 - AcMo - Peroxidasa. Después de los lavados practicados al final de cada incubación, la presencia del complejo inmune es revelada mediante la solución de revelado enzimática, la cual induce el desarrollo de una reacción coloreada (azul). A los 30 min. de incubación a temperatura ambiente, la reacción enzimática es interrumpida mediante la adición de una solución acida (solución de paro). La densidad óptica obtenida a 450/620 nm es proporcional a la cantidad de antígeno NS1 presente en la muestra. La presencia del antígeno en una muestra individual se establece mediante la comparación de la densidad óptica leída en esta muestra con la obtenida en el suero del valor umbral. Equipo Baño de agua o Incubadora a 37ºC. Micropipeta, 50 a 200 µl. Micropipeta multicanal de 20 a 200 µl. Espectrofotómetro. Sistema de lavado manual o automático (si se cuenta con él, en caso contrario se pueden hacer los lavados manuales utilizando piseta). Materiales Puntas adecuadas para los volúmenes de cada una de las micropipetas Gasas Cristalería general para laboratorio Agua bidestilada o desionizada estéril. Probeta graduada de 1000 ml Guantes desechables Contenedor de residuos contaminantes Toallas de papel Reactivos Los reactivos siguientes vienen incluidos en el estuche comercial Platelia NS1 Dengue, el volumen utilizado de cada uno de ellos dependerá de la cantidad de sueros que se procesen. Están etiquetados con un símbolo (letra y número) para su fácil identificación. Microplaca (R1) (listo para su uso): 12 tiras de 8 pozos cada una sensibilizada por AcMo anti-ns1, en bolsas herméticas al vacio. Página 30 de 62

31 Solución de Lavado concentrado 10x (R2): Solución amortiguadora Tris- NaCl (ph 7.4) y 1% de Tween 20. Control negativo (R3) Suero humano negativo para el antígeno NS1 Dengue. Control valor de corte (R4): Suero con antígeno NS1 Dengue que contiene solución reguladora TRIS-NaCl (ph 8.0), suero albúmina bovina y glicerol. Control positivo (R5): Suero con antígeno NS1 Dengue que contiene solución reguladora TRIS-NaCl (ph 8,0), suero albúmina bovina y glicerol. Conjugado 50x (R6): AcMo anti-ns1 conjugado con peroxidasa. Diluyente (R7): Solución reguladora que contiene Tween 20 y suero de fetal de ternera. TMB (R8): Solución de ácido cítrico y de acetato sódico que contiene 0,015% de H 2 O 2 y 4% de dimetilsulfóxido (DMSO). Cromógeno concentrado 11x (R9): Solución que contiene 0,25% de 3,3, 5,5 tetrametilbenzidina. Solución de paro (R10) (listo para su uso): Ácido sulfúrico 1N. Películas adhesivas. Condiciones para tomar en cuenta a. La calidad de los resultados depende de la aplicación de las buenas prácticas de laboratorio: b. Diluir cuidadosamente los reactivos evitando su contaminación. c. No dejar secar la placa al final de los lavados y entre la distribución de los reactivos. d. No mezclar ni combinar de una misma serie de reactivos procedentes de cajas con números de lotes distintos, solo se puede utilizar la solución de lavado, el tampón de sustrato, cromógeno y de solución de parada. e. El lavado de cada pozo es una etapa fundamental de manipulación: por lo cual se debe respetar el número de ciclos de lavados, un lavado inadecuado puede modificar los resultados finales. Procedimiento Analítico 1. Antes de realizar la detección del NS1, deberá establecerse un plan de distribución e identificación de muestras y controles, así como de los sueros problema. 2. Para poder validar del ensayo se utiliza un control negativo, dos valores umbrales o calibradores y un control positivo (no deberá excluirse ninguno). 3. Sacar el soporte y las tiras del empaque protector. 4. Se realiza la siguiente secuencia de aplicación de los reactivos en cada uno de los pozos: Se añaden 50 μl de diluyente (R7) en cada pozo (color naranja). Se añaden 50 μl de muestras (controles y muestras problema). Se añaden 100 μl de conjugado diluido 1:50 a cada pozo (color verde). 20 µl de R6 + 1 ml de R7 representan un volumen suficiente para 8 pozos. *Es importante que la solución de conjugado se prepare antes de comenzar a diluir los sueros Tapar la superficie con la película adhesiva. Incubar la microplaca durante 90±5 minutos a 37±1ºC. Diluir la solución de lavado concentrada 10x en agua bidestilada (900 ml de agua bidestilada ml de sol. de lavado 10x). Página 31 de 62

32 Al finalizar la incubación, retirar la película adhesiva y verter el contenido de todos los pozos en un contenedor de residuos contaminantes que contenga Hipoclorito de sodio. Lavar los pozos 6 veces (lavado manual). Si el lavado es de manera automatizada, procurar verificar el equipo antes y después de su uso siguiendo las indicaciones del proveedor, terminado el último aspirado se deberá eliminar el exceso de sol. de lavado sobre papel absorbente. Añadir 160 µl de la solución de revelado, diluyendo 1:11 el cromógeno (R9) en solución de peróxido de hidrógeno (R8), 150 µl de R ml de R8 (volumen suficiente para 8 pozos). Dejar que la reacción se desarrolle incubando a temperatura ambiente, durante 30± 5 minutos y protegida de la luz. Los pozos con el testigo positivo, los calibradores y en aquellos donde la muestra presente antígeno NS1 Dengue, desarrollaran un color azul. *Es importante que la solución de revelado no presente coloración antes de adicionarla. Añadir 100 µl de solución de paro (R10) en cada pozo. Los pozos con el testigo positivo, los calibradores y muestras problema que presente antígeno NS1 Dengue, el color azul cambiará a amarillo. Cálculos Cálculo de valor de corte: El valor umbral (CO), corresponde a la media de las densidades ópticas de los duplicados del Control Valor de corte (R4). Cálculo de cada una de las muestras: Los resultados se obtienen con la relación siguiente: S (Densidad óptica obtenida de la muestra) CO (Valor de corte). Resultado de las muestras problema = S/CO Validación (control de calidad) Para validar el ensayo, deberá cumplir los siguientes criterios: Valor de densidad óptica del valor de corte: CO = >0.2 Relación del control negativo (R3) y control positivo (R5). Relación R3 = <0.4 Relación R5 = >1.5 (Relación R3 = DO R3 / CO) (Relación R5 = DO R5 / CO) *Si no se cumple con las especificaciones anteriores, se deberá repetir el ensayo. Página 32 de 62

33 Interpretación de los resultados Para seguir los criterios es necesario que los resultados estén dentro de la siguiente relación: NEGATIVO. Muestra con una relación menor a 0.5, es considerada no reactiva para el antígeno NS1 del virus del Dengue. DUDOSO. Muestra con una relación entre 0.5 y 1.0 y se considerada dudosa para el antígeno NS1 del virus del Dengue, por lo que la muestra debe de analizarse nuevamente. POSITIVO. Muestra con una relación mayor a 1.0 y se considera reactiva para el antígeno NS1 del virus del Dengue. NOTA: Las densidades ópticas obtenidas en las muestras altamente reactivas pueden alcanzar la densidad óptica máxima y presentarse como SOBRE. Reporte de resultados. 1. Indicar el valor obtenido de la muestra (densidad óptica real de la muestra). 2. Indicar el valor de corte para el ensayo. 3. Indicar la interpretación de resultados. 4. Indicar la marca del reactivo usado. Early ELISA NS1 El estuche comercial Early ELISA NS1, es un método inmunoenzimántico tipo sándwich en formato de microplaca de 96 pozos, que se desarrolla en una etapa, útil en la detección del antígeno NS1 del virus del Dengue en suero. El antígeno NS1, si está presente en el suero, se une al anticuerpo anti-ns1 que está fijado a los pozos de poliestireno. El exceso de suero se elimina por lavado y después se agrega un segundo anticuerpo anti.ns1 marcado con peroxidasa. Después de la incubación y un lavado para eliminar el exceso de reactivos, se adiciona el sistema sustrato-cromógeno (TMB-peróxido de hidrógeno). La reacción se detiene al adicionar la solución ácida de paro por lo que la solución final de color amarillo indica la presencia de antígeno. Equipo Baño de agua o Incubadora a 37ºC. Micropipeta, 50 a 200 µl. Micropipeta multicanal de 20 a 200 µl. Espectrofotómetro. Sistema de lavado manual o automático (si se cuenta con él, en caso contrario se pueden hacer los lavados manuales utilizando piseta). Página 33 de 62

34 Materiales Puntas adecuadas para los volúmenes de cada una de las micropipetas Gasas Cristalería general para laboratorio Agua bidestilada o desionizada estéril. Probeta graduada de 1000 ml Guantes desechables Contenedor de residuos contaminantes Toallas de papel Reactivos Los reactivos siguientes están incluidos en el estuche comercial Dengue Early ELISA (E-DEN02P), el volumen utilizado de cada uno de ellos dependerá de la cantidad de sueros que se procesen. Micropozos en tiras de 8 pozos cada una, sensibilizados con anticuerpo anti- NS1, listos para su uso. Conjugado anticuerpo monoclonal Anti-NS1-peroxidasa: Botella (color naranja) de 15 ml, listo para su uso. Estable a 2-8 C hasta su fecha de caducidad. Solución de lavado (20x). Botella de 60 ml con solución amortiguadora de fosfatos (ph ) con Tween 20 y conservador. Diluir una parte de solución en 19 partes de agua destilada, esta solución es estable por una semana a 2-25 C. Diluyente de la muestra: Botella (color café) con 22 ml de solución amortiguadora tris-salina (ph ), listo para su uso y estable a 2-8 C hasta fecha de caducidad. Solución cromógeno TMB: Botella de 15 ml con una mezcla de 3,3, 5,5 - tetramethylbenzidina y peróxido de hidrógeno en solución amortiguadora de citratos (ph ). Estable a 2-8 hasta fecha de caducidad. Control positivo: Vial de tapón morado con 1.2 ml de antígeno NS1 Dengue recombinante. Estable a 2-8 hasta fecha de caducidad. Calibrador: 2 viales de tapón naranja con 1.5 ml de antígeno recombinante. Estable a 2-8 hasta fecha de caducidad. Control negativo: Vial de tapón blanco con 1.2 ml de suero humano. Estable a 2-8 hasta fecha de caducidad. Solución de paro: Botella de tapón rojo, listo para su uso, Ácido fosfórico 1M. Estable a 2-25 C hasta fecha de caducidad. Precauciones Esta prueba usa solamente suero humano. No se ha establecido el uso de otro material biológico como plasma o sangre completa. No utilizar muestras con hemólisis, lipemia o contaminadas. No inactivar los sueros. Diluir cuidadosamente los reactivos evitando su contaminación. No dejar secar la placa al final de los lavados y entre la distribución de los reactivos. Los pozos sin usar pueden conservarse cubiertos en presencia de desecante. Página 34 de 62

35 Evitar la exposición de la luz directa ya que puede afectar el sistema de sustrato cromógeno. Procedimiento General Antes de realizar la prueba para NS1, deberá establecerse un plan de distribución e identificación de muestras y controles, así como de los sueros problema. Dejar a temperatura ambiente (20-25 C) los reactivos incluidos en el estuche Predilución de la muestra y controles 1. Retirar del estuche el número de tiras con micropozos a utilizar y colocarlas en los marcos. Se requieren 5 pozos para, el control positivo (P), control negativo (N) y el calibrador por triplicado (C) 2. Utilizar tubos para dilución del control positivo, control negativo, calibrador y muestras de pacientes, adicionando 75 ón del control positivo, control negativo, calibrador y muestras de pacientes, adicionando 75 ón del control positivo, control negativo, calibrador y muestras de pacientes, adicionando 75 microlitros de suero y 75 microlitros de diluyente de muestra. Mezclar bien. La dilución final es 1:2. 3. No mezclar los controles por agitación mecánica ya que contienen glicerol, solo mezclar por inmersión. ELISA 1. Agregar 100 microlitros de las respectivas diluciones de los controles, calibradores y muestras problema a los pozos de reacción. 2. Cubrir la placa e incubar durante 1 hora a 37 C. 3. Lavar 6 veces con la solución de lavado y aspirar el líquido (ver procedimiento) 4. Agregar 100 microlitros del conjugado anti-ns1-peroxidasa a cada pozo 5. Cubrir la placa e incubar durante 1 hora a 37 C. 6. Lavar 6 veces con la solución de lavado y aspirar el líquido (ver procedimiento) 7. Agregar 100 microlitros de solución TMB en cada pozo 8. Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Se desarrollará una coloración azul. 9. Agregar 100 microlitros de la solución de paro a cada pozo. Mezclar bien. La solución cambiará a color amarillo. 10. Leer la absorbancia de cada pozo a 450 nm utilizando un filtro de referencia de nm. 11. NOTA: Si el espectrofotómetro utilizado no cuenta con filtro dual o de referencia ( nm) puede provocar valores de absorbancia elevados. Lavado Automatizado 1. Completamente aspirar el volumen de cada pozo. 2. Llenar los pozos con un volumen máximo de 350 µl durante un ciclo de lavado. 3. Deberán completarse 6 ciclos de lavado. Una vez terminados los seis ciclos, eliminar el exceso de solución de lavado utilizando un papel absorbente, invirtiendo la placa sobre este. Página 35 de 62

36 4. El lavador de placas deberá tener mantenimiento frecuente para asegurar un lavado eficiente. Cada equipo tiene sus instrucciones de limpieza y mantenimiento. Cálculos para validación del ensayo 1. Calcular el promedio de las absorbancias obtenidas en los calibradores y multiplicar por el factor de calibración. Este será el valor de corte. 2. Se puede calcular el valor índice de cada muestra, dividiendo la absorbancia de la muestra entre el promedio de las absorbancias del calibrador. Alternativamente: 3. Las unidades Panbio puede ser calculadas multiplicando por 10 los valores obtenidos durante el paso 2. Valor índice = Absorbancia de la muestra / valor de corte. Ejemplo: Absorbancia de la muestra A = Absorbancia de la muestra B = Promedio de absorbancias del calibrador = Factor de calibración = 0.62 Valor de corte = x 0.62 = Muestra A = (0.949/0.497) = 1.91 Valor índice Muestra B = (0.070=0.032) = 0.14 Valor índice Unidades Panbio = Valor índice X 10 Muestra A = 1.91 X 10 = 19.1 Unidades Panbio Muestra B = 0.14 X 10 = 1.4 Unidades Panbio Interpretación de los resultados Índice Unidades Panbio Resultado Interpretación < 0.9 < 9 Negativo No existe antígeno NS1detectable. Si la muestra es negativa y aun se sospecha de la enfermedad, se deberá tomar una siguiente muestra antes de los 14 días de haberse tomado la inicial y ensayarla para determinación de antígeno Indeterminado Repetir la muestra < 1.1 < 11 Positivo Indica presencia de antígeno NS1. Página 36 de 62

37 Reporte de resultados 1. Indicar el valor obtenido de la muestra (densidad óptica real de la muestra). 2. Indicar el valor de corte para el ensayo. 3. Indicar la interpretación de resultados. 4. Indicar la marca del reactivo usado. 2. Determinación de anticuerpos tipo IgM para diagnóstico de Dengue por ELISA Los anticuerpos de la clase IgM, cuando están presentes durante una infección por virus del dengue, estos se combinan con anticuerpos anti-igm que se encuentran adheridos en la superficie de los pozos de la placa de poliestireno. Una mezcla de los cuatro serotipos del virus del dengue es usada para llevar a cabo la reacción antígenoanticuerpo. Los antígenos son producidos usando un sistema de expresión en células de insecto (recombinantes), inmunopurificados utilizando anticuerpos monoclonales específicos. Un volumen igual de anticuerpos monoclonales (Mab) conjugados con HRP es adicionado permitiendo que se formen complejos antígeno-mab/conjugado. El suero residual es removido por lavados con solución amortiguadora de fosfatos y el complejo antígeno-mab es adicionado a la placa. Después de la incubación los pozos son lavados y un sistema incoloro de tetrametilbencidina/peróxido de hidrogeno (TMB/H 2 O 2 ) es adicionado. El sustrato es hidrolizado por la enzima y el cromógeno cambia a un color azul. Después la reacción es parada con ácido y el TMB cambia de color azul a amarillo. El color desarrollado es indicativo de la presencia anticuerpos anti-virus del dengue en la muestra de suero problema. Materiales Proporcionados 1. Microplacas de 96 pozos con anti-igm humana adherida (placa de ensayo). Los pozos que no se utilicen deberán inmediatamente ser almacenados con el desecante. Es estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 2. Antígenos del virus del dengue de los cuatro serotipos (recombinantes). 150 µl de la mezcla de antígenos (color azul). El antígeno diluido que no se utilizará deberá ser descartado. El antígeno concentrado es estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 3. Solución amortiguadora de fosfatos para lavado. Una botella con 60 ml de solución de lavado concentrada 20x (ph ) con Tween 20 y conservador (0.1% de Proclin TM. La cristalización de sales puede ocurrir a temperaturas más bajas de lo indicado para su almacenamiento, incubar a 37 C hasta disgregar los cristales. Diluir un aparte de la solución concentrada con 19 partes de agua bidestilada. La solución diluida puede ser almacenada por una semana a temperatura ambiente (20-25 C). 4. Diluyente de muestra problema, testigos y calibrador. Dos botellas con 50 ml cada una (color rosa). Lista para usar. La solución tiene un ph de con conservador (0.1% de Proclin TM ) y aditivos. Es estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 5. Diluyente de antígeno. Una botella con 50 ml (incoloro). Listo para usar. La solución amortiguadora de fosfatos que contiene esta solución contiene conservadores (0.1% de Proclin TM y 0.005% de gentamicina). 6. Anticuerpo monoclonal conjugado a HRP. Una botella con 7 ml (color amarillo). Listo para usar, Horseradish peroxidase (HRP) con conservador (0.1% de Proclin TM ) y estabilizadores de proteína. Estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. Página 37 de 62

38 7. Tetrametilbenzidina (TMB). Una botella de 15 ml. Lista para usar. Una mezcla de 3,3,5,5 - tetrametilbenzidina y peróxido de hidrógeno en una solución amortiguadora de citratos (ph ). Estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 8. Suero control positivo para IgM. Un vial con tapón de color negro, 200 µl de suero humano (contiene 0.1% de azida de sodio y 0.005% de sulfato de gentamicina). Estable de de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 9. Suero calibrador (valor de corte) para IgM. Un vial con tapón de color naranja, 400µL de suero humano (contiene 0.1% de azida de sodio y 0.005% de sulfato de gentamicina). Estable de de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 10. Suero control negativo para IgM. Un vial con tapón de color blanco, 200 µl de suero humano (contiene 0.1% de azida de sodio y 0.005% de sulfato de gentamicina). Estable de de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 11. Solución de paro. Una botella con 15mL. Lista para usar 1M de ácido fosfórico. Estable de de 2-8 C hasta la fecha de expiración. Los controles y calibradores contienen azida de sodio, el cual es clasificado como de extremo manejo. El contacto con ácidos libera gases muy tóxicos., debe manejarse con precaución. Materiales Requeridos pero no suministrados 1. Micropipetas de volumen variable con puntas con capacidad de µl. 2. Agua bidestilada. 3. Sistema de lavado automático para microplacas. 4. Lector de placas con filtros de 450 y Cronometro. 6. Probetas 7. Matraces. 8. Tubos dilutores. 9. Tubos de vidrio o plástico para diluir el antígeno. Precauciones Esta prueba deberá ser ocupada únicamente en muestras de suero. El uso de sangre completa, plasma u otro tipo de muestra aún no ha sido establecido para su análisis. Muestras de sueros ictéricas, lipémicas o hemolizadas o con crecimiento bacteriano y fúngico (contaminadas) no deberán de ser analizadas. No inactivar los sueros mediante calentamiento. El ensayo estará afectado por los cambios de temperatura, por lo que todos los reactivos deberán llevarse a temperatura ambiente (20-25 C) antes de comenzar el ensayo. No remover la microplaca de la bolsa cerrada de almacenamiento hasta que se haya atemperado. Agregar los reactivos directamente de las botellas usando pipetas limpias y estériles. La transferencia de los reactivos puede provocar contaminación. La bolsa de almacenamiento en la presencia del desecante. Si no se tiene el cuidado, esto puede provocar errores en los resultados. Substrato: a. Como el TMB es fácilmente susceptible a contaminación por iones metálicos, no deberá de permitirse que el sistema substrato tenga contacto con superficies metálicas. Página 38 de 62

39 b. Nunca se deberá permitir la exposición prolongada a la luz directa. c. Algunos detergentes pueden interferir en la actividad del TMB. d. El TMB puede presentar un ligero color azul. Esto no afectará la actividad del substrato o los resultados del ensayo. e. PELIGRO. Algunos componentes contienen azida de sodio, el cual puede reaccionar formando componentes metálicos de azida, los cuales pueden ser explosivos. Para desechar este reactivo deberá procurarse desecharlo bajo el chorro de agua para prevenir que dañe las tuberías. La azida de sodio, inhibe la actividad del conjugado. Deberán usarse puntas limpias y estériles para cada reactivo. Procedimiento General Predilución del suero Remover las tiras de pozos que serán utilizados e insertarlos en la base. Cinco pozos serán requeridos para controles y calibradores. Asegurar que los pozos que no se utilicen sean incorporados en la bolsa de almacenamiento que contendrá el desecante. Usando tubos especiales para dilución de sueros, comenzar a diluir los testigos negativo (N) y positivo (P), los calibradores por triplicado y las muestras problema. Para la dilución de la muestra se pueden seguir dos alternativas: Adicionar 1000 µl de diluyente (color rosa) a los viales dilutores y adicionarle 10 µl de suero. Mezclar bien. Adicionar 90 µl de diluyente y adicionar 10 µl de suero. Tomar 20 µl de la dilución anterior y adicionar 180 µl del diluyente. Mezclar bien. ELISA 1. Antígeno Determinar el número requerido de tiras para el ensayo de acuerdo al número de muestras problema y controles. Diluir el antígeno 1:250 usando la solución diluyente de antígeno, esta dilución es recomendada como la dilución mínima ya que necesita 10 µl de antígeno concentrado diluido e 2.5 ml de diluyente de antígeno. Este volumen es suficiente para 40 pozos. Un volumen de 0.5 ml de antígeno diluido es necesario para una tira. Una vez que el antígeno es adicionado al diluyente de antígeno, la solución se torna de color azul claro. Asegurarse que el antígeno concentrado que no se ocupará se almacene en refrigeración (2-4 C). Remover el volumen requerido de antígeno diluido y mezclar bien con un volumen igual de anticuerpo monoclonal conjugado a peroxidasa (Mab Tracer) en un frasco limpio y estéril dejar a temperatura ambiente hasta que se requiera. Descartar el antígeno diluido que no se ocupará. Dentro de los siguientes 10 minutos después de mezclar el Mab Tracer y el antígeno diluido, pipetear 100 µl de muestra problema, de los testigos y de los calibradores dentro de sus respectivos pozos de la placa de ensayo. Cubrir la placa e incubar por 1 hora a 37 C. Lavar seis veces con solución de lavado diluida. Página 39 de 62

40 Agitar la solución de antígeno Mab antes de transferir la solución a los pozos. Pipetear 100 µl del complejo antígeno Mab a cada pozo. Cubrir la placa e incubar por 1 hora a 37 C. Lavar seis veces con solución de lavado diluida. Pipetear 100 µl de TMB a cada pozo. Incubar por 10 min. a temperatura ambiente, procurando tomar el tiempo desde el primer pozo o tira de pozos. Aparecerá un color azul en el testigo positivo, los calibradores y en las muestras positivas. Pipetear 100 µl de solución de paro a cada pozo en la misma secuencia en la que agregó el TMB. El color azul cambiará a amarillo. Dentro de los siguientes 30 minutos leer la absorbancia de cada testigo, calibrador y muestras a una longitud de onda dual de 450 nm con filtro de referencia de nm. NOTA: Si el espectrofotómetro utilizado no cuenta con filtro dual o de referencia ( nm) puede provocar valores de absorbancia elevados. Lavado Automatizado 1. Completamente aspirar el volumen de cada pozo. 2. Llenar los pozos con un volumen máximo de 350 µl durante un ciclo de lavado. 3. Deberán completarse 6 ciclos de lavado. Una vez terminados los seis ciclos, eliminar el exceso de solución de lavado utilizando un papel absorbente, invirtiendo la placa sobre este. 4. El lavador de placas deberá tener mantenimiento frecuente para asegurar un lavado eficiente. Cada lavador tiene sus instrucciones de limpieza y mantenimiento. Cálculos para validación del ensayo 1. Calcular el promedio de las absorbancias obtenidas e los calibradores. Este será el valor de corte. 2. Se puede calcular el valor índice de cada muestra, dividiendo la absorbancia de la muestra entre el promedio de las absorbancias del calibrador. Alternativamente: 3. Las unidades Panbio puede ser calculadas multiplicando por 10 los valores obtenidos durante el paso 2. Valor índice = Absorbancia de la muestra / valor de corte. Ejemplo: Absorbancia de la muestra A = Absorbancia de la muestra B = Valor de corte = Muestra A = (0.949/0.302) = 3.14 Valor índice Muestra B = (0.070=0.032) = 0.23 Valor índice Unidades Panbio = Valor índice X 10 Muestra A = 3.14 X 10 = 31.4 Unidades Panbio Página 40 de 62

41 Muestra B = 0.23 X 10 = 2.3 Unidades Panbio Interpretación de resultados Índice Unidades Panbio Resultado Interpretación < 0.9 < 9 Negativo No existen anticuerpos IgM detectables. Si la muestra fue tomada durante la fase aguda es necesaria otra toma a los 7-14 días de iniciados los síntomas Indeterminado Repetir la muestra < 1.1 < 11 Positivo Indica presencia de anticuerpos. Reporte de resultados 5. Indicar el valor obtenido de la muestra (densidad óptica real de la muestra). 6. Indicar el valor de corte para el ensayo. 7. Indicar la interpretación de resultados. 8. Indicar la marca del reactivo usado. Página 41 de 62

42 3. Determinación de anticuerpos tipo IgG para diagnóstico de Dengue por ELISA (identificación de segundas infecciones) Los anticuerpos de la clase IgG, cuando están presentes durante una reinfección por virus del dengue, estos se combinan con anticuerpos anti-igg que se encuentran adheridos en la superficie de los pozos de la placa de poliestireno. Una solución que reconstituye la mezcla de los cuatro serotipos del virus del dengue liofilizados, es usada para llevar a cabo la reacción antígeno-anticuerpo. Un volumen igual de anticuerpos monoclonales (Mab) conjugados con HRP es adicionado permitiendo que se formen complejos antígeno-mab/conjugado. El suero residual es removido por lavados con solución amortiguadora de fosfatos y el complejo antígeno-mab es adicionado a la placa. Después de la incubación los pozos son lavados y un sistema incoloro de tetrametilbencidina/peróxido de hidrogeno (TMB/H 2 O 2 ) es adicionado. El sustrato es hidrolizado por la enzima y el cromógeno cambia a un color azul. Después la reacción es parada con ácido y el TMB cambia de color azul a amarillo. El color desarrollado es indicativo de la presencia anticuerpos anti-virus del dengue en la muestra de suero problema. Materiales Proporcionados 1. Microplacas de 96 pozos con anti-igg humana adherida (placa de ensayo). Los pozos que no se utilicen deberán inmediatamente ser almacenados con el desecante. Es estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 2. Viales con antígeno liofilizado y estabilizado Dengue, cuatro serotipos. El antígeno reconstituido que no se ocupe puede ser a -20 C o menos. El antígeno liofilizado es estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 3. Solución amortiguadora de fosfatos para lavado. Una botella con 60 ml de solución de lavado concentrada 20x (ph ) con Tween 20 y conservador (0.1% de Proclin TM ). La cristalización de sales puede ocurrir a temperaturas más bajas de lo indicado para su almacenamiento, incubar a 37 C hasta disgregar los cristales. Diluir un aparte de la solución concentrada con 19 partes de agua bidestilada. La solución diluida puede ser almacenada por una semana a temperatura ambiente (20-25 C). 4. Diluyente de muestra problema, testigos y calibrador. Dos botellas con 50 ml cada una (color rosa). Lista para usar. La solución tiene un ph de con conservador (0.1% de Proclin TM ) y aditivos. Es estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 5. Reconstituyente de antígeno. Una botella con 7 ml (incoloro). Listo para usar. La solución amortiguadora que contiene esta solución tiene conservadores (0.1% de Proclin TM ). Estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 6. Anticuerpo monoclonal conjugado a peroxidasa de rábano (HRP) Una botella de peroxidasa de rábano (HRP) con 7 ml (color verde), listo para usarse, con conservador (0.1% de Proclin TM ) y estabilizadores de proteína. Estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 7. Tetrametilbenzidina (TMB). Una botella de 15 ml. Lista para usar. Una mezcla de 3,3,5,5 - tetrametilbenzidina y peróxido de hidrógeno en una solución amortiguadora de citratos (ph ). Estable de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 8. Suero control positivo para IgG. Un vial con tapón de color rojo, 200 µl de suero humano (contiene 0.1% de azida de sodio y 0.005% de sulfato de gentamicina). Estable de de 2-8 C hasta la fecha de expiración. Página 42 de 62

43 9. Suero calibrador (valor de corte) para IgG. Un vial con tapón de color amarillo, 400µL de suero humano (contiene 0.1% de azida de sodio y 0.005% de sulfato de gentamicina). Estable de de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 10. Suero control negativo para IgG. Un vial con tapón de color blanco, 200 µl de suero humano (contiene 0.1% de azida de sodio y 0.005% de sulfato de gentamicina). Estable de de 2-8 C hasta la fecha de expiración. 11. Solución de paro. Una botella con 15 ml. Lista para usar 1M de ácido fosfórico. Estable de 2-25 C hasta la fecha de expiración. Los controles y calibradores contienen azida de sodio, el cual es clasificado como de extremo manejo. El contacto con ácidos libera gases muy tóxicos, debe manejarse con precaución. Materiales requeridos pero no suministrados 1. Micropipetas de volumen variable con puntas con capacidad de µl. 2. Agua bidestilada. 3. Sistema de lavado automático para microplacas. 4. Lector de placas con filtros de 450 y 620 nm. 5. Cronómetro. 6. Probetas 7. Matraces. 8. Tubos dilutores. 9. Tubos de vidrio o plástico para diluir el antígeno. Precauciones Esta prueba deberá ser ocupada únicamente en muestras de suero. El uso de sangre completa, plasma u otro tipo de muestra aún no ha sido establecido para su análisis. Muestras de sueros ictéricas, lipémicas o hemolizadas o con crecimiento bacteriano y fúngico (contaminadas) no deberán de ser analizadas. No inactivar los sueros mediante calentamiento. El ensayo estará afectado por los cambios de temperatura, por lo que todos los reactivos deberán llevarse a temperatura ambiente (20-25 C) antes de comenzar el ensayo. No remover la microplaca de la bolsa cerrada de almacenamiento hasta que se haya atemperado. Sistema Substrato: Como el TMB es fácilmente susceptible a contaminación por iones metálicos, no deberá de permitirse que el sistema substrato tenga contacto con superficies metálicas. Nunca se deberá permitir la exposición prolongada a la luz directa. Algunos detergentes pueden interferir en la actividad del TMB. El TMB puede presentar un ligero color azul. Esto no afectará la actividad del substrato o los resultados del ensayo. PELIGRO. Algunos componentes contienen azida de sodio, el cual puede reaccionar formando componentes metálicos de azida, los cuales pueden ser explosivos. Para desechar este reactivo deberá procurarse desecharlo bajo el chorro de agua para prevenir que dañe las tuberías. La azida de sodio, inhibe la actividad del conjugado. Deberán usarse puntas limpias y estériles para cada reactivo. Procedimiento General Página 43 de 62

44 Predilución del suero Remover las tiras de pozos que serán utilizados e insertarlos en la base. Cinco pozos serán requeridos para controles y calibradores. Asegurar que los pozos que no se utilicen sean incorporados en la bolsa de almacenamiento que contendrá el desecante. Usando tubos especiales para dilución de sueros, comenzar a diluir los testigos negativo (N) y positivo (P), los calibradores por triplicado y las muestras problema. Para la dilución de la muestra se pueden seguir dos alternativas: Adicionar 1000 µl de diluyente (color rosa) a los viales dilutores y adicionarle 10 µl de suero. Mezclar bien. Adicionar 90 µl de diluyente y adicionar 10 µl de suero. Tomar 20 µl de la dilución anterior y adicionar 180 µl del diluyente. Mezclar bien. ELISA Viales con antígeno estabilizado Determinar el número requerido de tiras para el ensayo de acuerdo al número de muestras problema y controles. Remover el N 4 número de viales de antígeno liofilizado. Cada vial es suficiente para 16 pozos. Reconstituir cada vial con 1 ml de solución para P 5 reconstituir antígeno liofolizado. El antígeno reconstituido que no se ocupe deberá mantenerse en congelación a -20 C o menos. CO 6 Asegurarse que los viales de antígeno no reconstituido, que no se ocupará, se almacene en refrigeración (2-4 C). CO 7 Remover el volumen requerido de antígeno reconstituido y mezclar bien con un volumen igual de anticuerpo monoclonal CO 8 conjugado a peroxidasa (Mab Tracer) en un frasco limpio y estéril dejar a temperatura ambiente hasta que se requiera. 1 9 Dentro de los siguientes 10 minutos después de mezclar el Mab Tracer y el antígeno reconstituido, pipetear 100 µl de muestra problema, de los testigos y de los calibradores (todos 2 10 diluidos 1:100) dentro de sus respectivos pozos de la placa de ensayo Cubrir la placa e incubar por 1 hora a 37 C. Lavar seis veces con solución de lavado diluida. Agitar la solución de antígeno Mab antes de transferir la solución a los pozos. Pipetear 100 µl del complejo antígeno Mab a cada pozo. Cubrir la placa e incubar por 1 hora a 37 C. Lavar seis veces con solución de lavado diluida. Pipetear 100 µl de TMB a cada pozo. Incubar por 10 min. a temperatura ambiente, procurando tomar el tiempo desde el primer pozo o tira de pozos. Aparecerá un color azul en el testigo positivo, los calibradores y en las muestras positivas. Pipetear 100 µl de solución de paro a cada pozo en la misma secuencia en la que agregó el TMB. El color azul cambiará a amarillo. Dentro de los siguientes 30 minutos leer la absorbancia de cada testigo, calibrador y muestras a una longitud de onda dual de 450 nm con filtro de referencia de nm. NOTA: Si el espectrofotómetro utilizado no cuenta con filtro dual o de referencia ( nm) puede provocar valores de absorbancia elevados. Página 44 de 62

45 Lavado Automatizado. 1. Completamente aspirar el volumen de cada pozo. 2. Llenar los pozos con un volumen máximo de 350 µl durante un ciclo de lavado. 3. Deberán completarse 6 ciclos de lavado. Una vez terminados los seis ciclos, eliminar el exceso de solución de lavado utilizando un papel absorbente, invirtiendo la placa sobre este. 4. El lavador de placas deberá tener mantenimiento frecuente para asegurar un lavado eficiente. Cada lavador tiene sus instrucciones de limpieza y mantenimiento. Cálculos para validación del ensayo 4. Calcular el promedio de las absorbancias obtenidas e los calibradores. Este será el valor de corte. 5. Se puede calcular el valor índice de cada muestra, dividiendo la absorbancia de la muestra entre el promedio de las absorbancias del calibrador. Alternativamente: 6. Las unidades Panbio puede ser calculadas multiplicando por 10 los valores obtenidos durante el paso 2. Valor índice = Absorbancia de la muestra / valor de corte. Ejemplo: Absorbancia de la muestra A = Absorbancia de la muestra B = Valor de corte = Muestra A = (0.949/0.302) = 3.14 Valor índice Muestra B = (0.070=0.032) = 0.23 Valor índice Unidades Panbio = Valor índice X 10 Muestra A = 3.14 X 10 = 31.4 Unidades Panbio Muestra B = 0.23 X 10 = 2.3 Unidades Panbio Interpretación de resultados Índice Unidades Panbio Resultado Interpretación < 1.8 < 18 Negativo No existen anticuerpos IgG detectables. Si la muestra tiene unidades Panbio menores de 18, se puede recurrir a realizar la detección de anticuerpos tipo IgM con E-DEN01, para la detección de infecciones primarias Página 45 de 62

46 Indeterminado Repetir la muestra < 2.2 < 22 Positivo Indica presencia de anticuerpos IgG de una infección secundaria Reporte de resultados 9. Indicar el valor obtenido de la muestra (densidad óptica real de la muestra). 10. Indicar el valor de corte para el ensayo. 11. Indicar la interpretación de resultados. 12. Indicar la marca del reactivo usado. Página 46 de 62

47 BIOLOGÍA MOLECULAR Detección e identificación de serotipos del virus dengue mediante RT-PCR Múltiplex en Tiempo Real Página 47 de 62

48 Fundamento La RT-PCR Multiplex en tiempo real, es un ensayo que tiene la capacidad de monitorear en cada ciclo el progreso de la amplificación. Los datos son colectados desde el primer ciclo de reacción hasta el último, permitiendo realizar cuantificación relativa y absoluta de la carga viral presente en la muestra. La detección de la amplificación de una secuencia específica es monitoreada mediante la captación de señales de fluorescencia emitida durante los ciclos de la PCR. La presencia de altas concentraciones de RNA o de número de copias de material genético evidenciará un incremento en la fluorescencia en los primeros ciclos de la reacción. Por lo contrario, bajas concentraciones de RNA permitirán obtener un incremento de fluorescencia en los últimos ciclos de la reacción. Este método está basado en la técnica desarrollada por Jeff Chang y cols El virus dengue, se encuentra en circulación en concentraciones detectables durante la fase aguda de la enfermedad (0-5 días) y esta característica hace que este ensayo sea utilizado únicamente durante esta fase y en muestras con resultados positivo a antígeno NS1. Tipo de Muestras Debe usarse únicamente en muestras de suero, plasma, en fluidos libres de células; otra muestra diferente deberá ser evaluada con su ensayo de extracción específico. Actualmente muestras de moscos y clarificado de moscos pueden ser utilizadas para la vigilancia entomo-virologica. El uso de sangre completa u otro tipo de muestra no ha sido aún establecido para su análisis. El envió de ARN de los LESP al InDRE quedará sujeto a evaluación por el laboratorio de Arbovirus según necesidades identificadas (falta de muestra de suero, de plasma, de mosco y otros) Controles. Cada una de las cepas tipo de los cuatro diferentes serotipos del virus dengue; DENV-1 (HAWAII), DENV-2 (NUEVA GUINEA), DENV-3 (H-87 o PR-6) y DENV-4 (H-241) se inocularon en monocapa confluente al 90% de células C6-36 (donadas por los CDC, Dengue Branch, de San Juan, Puerto Rico). El medio de cultivo MEM para mantenimiento, es suplementado con 1% de vitaminas, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de L-glutamina y 2% de suero fetal de ternera (SFT). Los serotipos de estos cultivos de virus tipo, fueron demostrados, realizando inmunofluorescencia indirecta mediante la utilización de anticuerpos monoclonales serotipo específicos (Donados por CDC Dengue Branch, San Juan, Puerto Rico y producidos en CDC de Fort Collins, Colorado). Las cepas son cosechadas a los 6-7 días para DENV-2 y DENV-3 y a los 9 días para DENV-1 y DENV-4. Son enriquecidas con 10% de SFT para criopreservar y posteriormente son almacenadas a -80 C, hasta su uso. Cada vez que lo soliciten, estas cepas son enviadas a los LESP que realizan la vigilancia virológica para ser usados como controles positivos en sus ensayos. A partir del segundo semestre de 2012 estas cepas serán enviadas con su certificado de análisis (secuenciación, IFI y RT-PCR con blanco de amplificación en regiones diferentes del genoma). Actualmente ya existen casas comerciales que fabrican controles cuantificables y que sirven como controles internos de proceso de extracción y de amplificación; estos serán únicamente recomendados por el InDRE bajo previa avaluación de su desempeño. Muestras. Los sueros de fase aguda de pacientes con sintomatología compatible a Dengue, y clarificados de moscos, se deberán conservar en Página 48 de 62

49 refrigeración (4-6 C) desde la toma o colecta hasta él envió y recepción a los LESP o a el laboratorio de Arbovirus del InDRE. Los clarificados de mosquitos se obtendrán del macerado de máximo 35 especímenes, con mortero o macerador automático, en ml de medio MEM enriquecido con SFT al 10% y 0.1% de penicilina/estreptomicina. El producto del macerado deberá centrifugarse entre 2500 y rpm a 4ºC para obtener un clarificado, el cual será utilizado para extracción de RNA. Equipo El clarificado restante deberá alicuotarse y almacenarse a -70ºC. Estas muestras serán analizadas según el algoritmo; muestras de humano con resultado positivo a antígeno NS1 y los clarificados de moscos para Vigilancia Entomo-Virologica, se les realizará extracción de ARN mediante el método manual (QUIAGEN) o automatizado (ROCHE Magna Pure LC 2.0). Una vez extraído y purificado el ARN, se almacenará a -20ºC si se amplifica en la siguiente semana ó a -70ºC si se amplifica después de 8 días o mas. Área de extracción Gabinete de Bioseguridad tipo A2, Clase II Microcentrífuga Refrigerador Congelador (-20 C) Micropipeta de volumen variable entre µl Micropipeta de volumen variable entre µl Micropipeta de volumen variable entre µl Área de Preparación de la Mezcla Maestra de Reacción. Gabinete de Bioseguridad para PCR Microcentrífuga Minispin Agitador tipo Vortex Micropipeta de volumen variable entre µl Micropipeta de volumen variable entre µl Micropipeta de volumen variable entre µl Micropipeta de volumen variable entre µl Área de Adición de RNA S de muestras problemas Estación de trabajo con Flujo Laminar Microcentrífuga Minispin Micropipeta de volumen variable entre µl Micropipeta de volumen variable entre µl Materiales a. Puntas con filtro, estériles, libres de RNasa y DNasa, con capacidad de µl b. Puntas con filtro, estériles, libres de RNasa y DNasa, con capacidad de 2-20 µl Página 49 de 62

50 c. Puntas con filtro, estériles, libres de RNasa y DNasa, con capacidad de µl d. Puntas con filtro, estériles, libres de RNasa y DNasa, con capacidad de µl e. Puntas con filtro, estériles, libres de RNasa y DNasa, con capacidad de µl f. Tubos tipo Eppendorf, estériles, libres de RNasa y DNasa con capacidad de 1.7 ml g. Gasas estériles h. Guantes de nitrilo (libres de talco). i. Batas desechables j. Papel aluminio k. Gradillas de unicel para tubos tipo Eppendorf l. Estaciones para trabajo en frío para tubos tipo Eppendorf m. Placas de polipropileno con 96 pozos claros especiales para PCR en tiempo real con capacidad de µl n. Tiras con 8 tubos especiales para PCR en tiempo real con capacidad de 0.2 ml o. Tiras con 8 tapas ópticas ultra claras especiales para PCR en tiempo real p. Marcadores indelebles de punto fino q. Contenedores y bolsas para desecho de material biológico-infeccioso r. Pinzas Nota: Cada área de trabajo debe contar con material exclusivo. Reactivos y materiales biológicos a. Cepa de Referencia DEN-1 Hawaii b. Cepa de Referencia DEN-2 Nueva Guinea c. Cepa de Referencia DEN-3 H-87 o PR-6 d. Cepa de Referencia DEN-4 H-241 e. Estuche para extracción de RNA viral, (QIAamp Viral RNA Mini Kit) Marca QIAGEN, catálogo 52906, o estuche para extracción automatizada (MAGNA PURE 2.0 ROCHE) f. Enzima para amplificación: SuperScript One-Step RT-PCR con Platinum, Marca Invitrogen, catálogo o Marca Bio-Rad, catálogo g. Agua calidad PCR libre de RNasa, Marca Roche, catálogo: h. Iniciador mfu1: 5 TACAACATGATGGGAAAGCGAGAGAAA AA 3 i. Iniciador CFD2: 5 GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC 3 j. Sonda DEN-1: 5 FAM TCAGAGACATATCAAAGATTCCAGGGGG-BHQ1 3 k. Sonda DEN-2: 5 Texas Red- AAGAGACGTGAGCAGGAAGGAAGGGGGAGC- BHQ2 3 l. Sonda DEN-3: 5 CY5-TGAGAGATATTTCCAAGATACCCGGAGGAG-BHQ3 3 m. Sonda DEN-4: 5 HEX-TGGAGGAGATAGACAAGAAGGATGGAGACC-BHQ1 3 n. Etanol al 75%. o. Hipoclorito de sodio al 5%. p. Solución para eliminación de DNA, DNaZap, Marca Ambion, catálogo 9892G. Nota: i. Las cepas de referencia fueron donadas por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC), Dengue Branch, de San Juan, Puerto Rico. (se cuenta con carta de donación). Página 50 de 62

51 ii. Los fluoróforos pueden ser cambiados por otros, siempre y cuando se encuentren en el mismo canal de adquisición. Esto dependerá de la disponibilidad en la síntesis de cada empresa. Método Preparación del área de trabajo Cada una de las áreas de trabajo debe contar con material, equipo, reactivos y personal exclusivo. Antes de empezar, el gabinete de bioseguridad o flujo laminar de cada una de las áreas de trabajo (extracción de RNA, preparación de mezcla maestra de reacción y de RNA s de muestras problemas) deberá de limpiarse con hipoclorito de sodio al 5%, agua bidestilada y etanol al 75%, siguiendo ese orden. Irradiar con 20 minutos luz ultravioleta, antes y después de trabajar. Si se cuenta con soluciones inhibidora de RNA s y DNA s se recomienda realizar la limpieza con éstas soluciones antes y después de trabajar. El material necesario que se use debe estar listo en cada área de trabajo. Extracción de Acidos Nucléicos. Principio del método: El estuche de extracción simplifica la extracción de RNA viral a partir de fluidos libres de células mediante un procedimiento rápido de centrifugación en columna. No se requiere utilizar fenol-cloroformo. El RNA se une específicamente a la membrana de sílica-gel, por la cual pasan todos los contaminantes. Los inhibidores de PCR como los cationes divalentes y proteínas, son completamente removidos durante los pasos de lavado dejando el RNA puro y listo para ser eluído con la solución de elución. Preparación de reactivos. a. Agregar 310 μl de amortiguador AVE al tubo que contiene 310 μg de acarreador de RNA liofilizado, para obtener una solución de trabajo de 1 μg/μl. b. Disolver perfectamente, realizar alícuotas en volúmenes suficientes para trabajar 5-10 muestras y almacenar a 20 C. c. Evitar ciclos de congelación-descongelación más de tres veces. d. Preparar solución AVL, agregando acarreador de RNA en relación de: 0.56 ml de AVL μl de acarreador de RNA por cada muestra a procesar. (Anexo 1) e. La solución de lavado AW1, debe ser preparada agregando 125 ml de etanol (96-100%) grado biología molecular y marcar el frasco para indicar que se le agregó etanol. f. La solución de lavado AW2, debe ser preparada agregando 160 ml de etanol (96-100%) grado biología molecular y marcar el frasco para indicar que se le agregó etanol. Extracción y purificación de ARN (manual QIAGEN). a. Pipetear 560 μl de solución AVL/acarreador de RNA a un tubo tipo Eppendorf de 1.5 ml. Se deberá agregar el acarreador de ARN durante cada proceso de extracción, esto asegura no se pierda a actividad de este reactivo y asegure la máxima obtención de material genético. b. Agregar 140 μl de suero o plasma agitar durante 15 segundos. Página 51 de 62

52 c. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugar brevemente 1500 rpm por 30 segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos. d. Agregar 560 μl de etanol, agitar durante 15 segundos y centrifugar brevemente 1500 rpm por 30 segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos. e. Remover del empaque las columnas/tubo colector a utilizar y etiquetarlas. f. Tomar 630 μl de la solución anterior y agregar cuidadosamente dentro de la columna, centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto a 4 C. g. Cambiar la columna a un tubo colector limpio y repetir el paso anterior. h. Cambiar la columna a un tubo colector limpio y agregar 500 μl de solución de lavado AW1, centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto a 4 C. i. Cambiar la columna a un tubo colector limpio y agregar 500 μl de solución de lavado AW2, centrifugar a rpm durante 3 minutos a 4 C. j. Cambiar la columna a un tubo etiquetado tipo Eppendorf de 1.7 ml limpio, estéril, libre de RNasa y DNasa y agregar 60 μl de solución de elución (AVE). Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto y centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto a 4 C. k. Descartar la columna, cerrar el tubo tipo Eppendorf que contiene el RNA de interés. l. Almacenar a -20 C si se lleva a cabo la amplificación dentro de las primeras 48 horas, de no ser así se almacena a -70 C, hasta su uso. (Anexo 2) Notas: i Todos los desechos de los tubos colectores se deben descartar en un recipiente exclusivo para su posterior eliminación. ii Las soluciones de extracción AVL y AW1 contienen sales de guanidina, las cuales pueden formar compuestos altamente reactivos cuando se combinan con cloro. iii En caso de incorporar un control interno, este deberá adicionarse junto con el acarreador a la solución AVL. El control interno debe tener al menos 200 nucleótidos, moléculas más pequeñas no promueven un buen rendimiento de RNA. Extracción y purificación de ARN (automatizado MAGNA PURE LC 2.0 ROCHE) El método de PCR tiene la facultad de producir una gran cantidad de copias de DNA de doble cadena y en conjunto con la Reacción de Retrotranscripción (RT) es posible obtener moléculas de DNA complementario, a partir de una muestra de RNA. El RNA extraído de las muestras de suero, plasma o fluidos libres de células, es convertido en cdna y posteriormente amplificado para obtener una gran cantidad de copias. El método de extracción automatizada por perlas magnéticas, simplifica la extracción de RNA viral a partir de fluidos libres de células. No se requiere utilizar fenolcloroformo. El RNA se une específicamente a la superficie de sílica de las perlas magnéticas, mientras que todos los contaminantes son removidos durante los pasos de lavado. En seguida, el RNA es separado de las perlas magnéticas utilizando altas temperaturas, con lo que queda completamente purificado en la solución de elución. Posteriormente, a través del método de RT-PCR, se puede detectar la presencia de altas o bajas concentraciones de RNA, extraído a partir de la muestra primaria. Página 52 de 62

53 Preparación de las muestras Se hará en la cabina de bioseguridad 2 del área de extracción de ácidos nucleicos. a. Anotar la ubicación de las muestras en el formato de trabajo así como todos los datos solicitados en el mismo b. Etiquetar los tubos tipo Eppendorf de 1.7 ml necesarios dependiendo del número de muestras a procesar. c. Pipetear 200μL de solución de lisis a cada uno de los tubos tipo Eppendorf. d. Agregar 200 μl de suero o plasma agitar durante 10 segundos. e. Centrifugar brevemente 1500 rpm por 20 segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos. f. Tomar 350 μl de la solución anterior y agregar cuidadosamente dentro del cartucho para muestras que ingresará al robot de extracción. g. Tapar el cartucho para muestras con el sello adhesivo y almacenarlo a 4ºC hasta su ingreso al robot de extracción. Preparación del anaquel de reactivos Se hará en la mesa de trabajo del área de extracción de ácidos nucleicos. a. Colocar los recipientes en el anaquel de reactivos. b. Agregar en su respectivo recipiente (para procesar 32 muestras): 32 ml de solución de lavado 1 (tapa negra); 33 ml de solución de lavado 3 (tapa roja); 16.5 ml de solución de lavado 2 (tapa azul); 7 ml de solución de elución (tapa amarilla); 5 ml de proteinasa K (tapa rosa) previamente diluida con 5 ml de solución de elusión; y 6 ml perlas magnéticas (tapa café). Finalmente, colocar las tapas de los recipientes (Anexo 2). Preparación del robot e inicio de la extracción a. Asignar un número o nombre de corrida, registrar en la base de datos electrónica del robot. b. Colocar los insumos, el anaquel de reactivos y las muestras en el robot. c. Verificar que el volumen del contenedor de líquidos y que el contenido de la bolsa de desechos de puntas, no rebasen tres cuartas partes de su capacidad. d. Iniciar la corrida del robot Obtención del RNA purificado a. Marcar con la clave asignada los tubos eppendorf en los cuales serán envasados los extractos de RNA. b. Al terminar la corrida, tapar con el sello adhesivo el cartucho donde se colectaron los extractos. En la campana de bioseguridad, envasar los extractos. Registrarse en la bitácora de la campana de bioseguridad. c. Almacenar a -20 C si se lleva a cabo la amplificación dentro de las primeras 48 horas, de no ser así se almacena a -70 C, hasta su uso. d. Retirar del robot los insumos utilizados y desecharlos en la bolsa roja. Página 53 de 62

54 e. Con una gasa humedecida con etanol al 75%, limpiar la superficie interna del robot y la resbaladilla de desecho de puntas. f. Descontaminar el robot por 30 min. Después de este tiempo apagar el equipo. Amplificación Notas: 1. El robot procesa las muestras en 4 filas para 8 muestras cada una. El software del equipo calcula automáticamente la cantidad de reactivos e insumos (cartuchos, puntas) necesarios para procesar diferentes cantidades de muestras. 2. Todo el volumen de la proteinasa K reconstituida se utiliza para la extracción de 32 muestras, en caso de extraer un número menor de muestras, tomar el volumen necesario de acuerdo al número de muestras, y el resto de la proteinasa K almacenarla a -20ºC, hasta su utilización. 3. En caso de incorporar un control interno, este deberá adicionarse junto con el acarreador a la solución AVL. El control interno debe tener al menos 200 nucleótidos, moléculas más pequeñas no promueven un buen rendimiento de RNA 4. En caso de que se requiera realizar la extracción de menos de 24 muestras, se deberá seguir el método de extracción manual de ácidos nucleicos. Calculo de reactivos y ubicación de muestras. a. Con base al número de muestras y controles (positivos y negativos) se realizan los cálculos correspondientes para preparar la mezcla maestra de reacción, estos datos se deben anotar en la hoja de trabajo correspondiente. La persona encargada de realizar la mezcla maestra de reacción, determinará el número requerido de tubos/pozos, de acuerdo al número de muestras problema y controles. b. Realizar los cálculos de cada uno de los reactivos, de acuerdo al número de muestras y controles. Considerar un excedente suficiente para una muestra más. c. Anotar la ubicación de las muestras y controles en la hoja de trabajo así como todos los datos solicitados en la misma. La ubicación de los controles debe estar lo más alejado posible de las muestras problema. d. Abrir el programa del termociclador para crear un nuevo documento (placa) basándose en el formato existente ( Plantilla Dengue ) para ubicar en la misma posición las muestras y controles en la placa del programa como en la hoja de trabajo. e. Guardar el documento elaborado con la fecha (ddmmaa) en la carpeta correspondiente. f. El uso de la plataforma de BIORAD CFX96, no es exclusiva, la estandarización de este método también se realizo en la plataforma de Applied Biosystem 7500 Fast, obteniéndose los mismos resultados. El uso de otra plataforma requerirá ser evaluada. Página 54 de 62

55 Preparación de mezcla maestra de reacción. a. Descontaminar el gabinete con solución ZAP para eliminar RNasa y DNasa. b. Sacar del congelador los reactivos a utilizar, manteniéndolos siempre en frío. c. Trabajar siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio para Biología Molecular. d. Agregar cada uno de los reactivos que conforman la mezcla maestra de reacción con base en la hoja de trabajo realizada. e. Agregar 20 µl de la mezcla maestra de reacción a cada tubo/pozo a utilizar. f. Agregar 5 µl de agua calidad biología molecular al tubo/pozo que contendrá el control negativo de reactivo y taparlo. g. Pasar al área de adición de RNA s de muestras problema, los tubos/pozos que contienen la mezcla maestra de reacción evitando exponerlos al ambiente, para ello se deben trasladar en una caja limpia cerrada y libre de RNasas y DNasas. Adición de los RNA de muestras problemas a. Descontaminar el gabinete con solución ZAP para eliminar RNasa y DNasa. b. Limpiar el área, sacar los RNA s de las muestras problema del congelador, manteniéndolos en frío. c. Trabajar siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio para Biología Molecular. d. Agregar 5 µl del RNA de la muestra problema a cada tubo/pozo siguiendo la ubicación de la hoja de trabajo correspondiente, en primer lugar se agrega el RNA de la muestra problema, al final los controles positivos y estándares (en caso de cuantificación). Al terminar de colocar una hilera esta deberá de taparse usando tiras de tapas. Evitar el contacto directo de los guantes al momento de tapar. e. Ingresar los tubos/pozos al termociclador, seleccionar en el programa el protocolo de amplificación e iniciar la corrida. Interpretación de las curvas de amplificación. a. Los valores de amplificación se expresan en valores de Ct (del inglés Cycle threshold). Donde un Ct es el ciclo a partir del cual los valores de fluorescencia relativa rebasan el punto de corte o umbral. El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de RNA presente en la muestra. b. A cada uno de los fluoróforos se le asignó un color para diferenciar los cuatro serotipos, como se indica a continuación: Fluoróforo FAM, color verde para identificar virus dengue serotipo 1 Fluoróforo Rojo Texas, color rojo para identificar virus dengue serotipo 2 Fluoróforo Cy5, color azul para identificar virus dengue serotipo 3 Fluoróforo HEX, color negro para identificar virus dengue serotipo 4 c. Para que la muestra sea considerada positiva deberá presentar claramente curvas sigmoides bien definidas. d. Muestras con valor de Ct menor o igual a 35 son positivas para el o los serotipos correspondiente. e. Muestras con valor de Ct mayor o igual a 39 son negativas. Página 55 de 62

56 f. Muestras con Ct menores a 35, pero con curvas NO sigmoides (artefactos), no deben reportarse y deben repetirse por duplicado. g. Muestras con valor de Ct entre 36 y 38, repetir por duplicado. Si se obtiene nuevamente el mismo resultado se debe repetir el ensayo desde la extracción de RNA, en caso de obtener el mismo resultado se reporta como positivo, haciendo la aclaración que presenta ciclos altos (positivo bajo) h. Muestras con más de un serotipo identificado, se deben repetir desde la extracción de RNA. Esto para descartar posible contaminación. Si se obtiene el mismo resultado se reportan los serotipos identificados. Notas: i. En caso de incorporar un control interno se deben seguir las instrucciones de uso del fabricante. ii. Los controles positivos y negativos sirven para monitorear alguna falla en alguno de los reactivos del ensayo y para validar el ensayo. iii. El ensayo se debe repetir si alguno de los controles positivos no amplifica o si estuvieran fuera del rango esperado ó sí el control negativo amplificara. Durante los procesos antes mencionados se deberán seguir las siguientes prácticas de laboratorio: - Manejo adecuado de reactivos. Asegurarse que los reactivos se usen y manejen siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio para Biología Molecular. Mantenerlos en red fría durante su uso. - Manejo adecuado del equipo. Usar adecuadamente el equipo siguiendo las instrucciones de uso descritas en los manuales de operación de los mismos. - Áreas de trabajo. Se debe contar con áreas separadas para extracción, preparación de mezcla maestra de reacción, adición de RNA s problema y adición de controles positivos. Al finalizar el trabajo en cada área, se deberá descontaminar perfectamente el área de trabajo. Se deberá sacar y desechar todo el material sucio, de no hacerlo se puede provocar contaminación. - Personal. Contar con personal capacitado para el adecuado desarrollo del método e interpretación de resultados. - Evitar la contaminación del área con DNA de las reacciones realizadas, por lo que se recomienda desechar las placas/tubos en el contenedor de biológicoinfeccioso en otra área diferente. Si se requiere almacenar el DNA para realizar análisis posterior a la amplificación, se recomienda hacerlo en otra área independiente. Interpretación de resultados Negativo: No existe presencia de RNA viral o existe carga viral extremadamente muy baja, relacionada con la sensibilidad del método. Se confirma infección por dengue (Por tener resultado NS1 positivo) Positivo: Es indicativo de infección reciente y presencia de RNA viral del o (de los serotipo (s) detectado (s). Página 56 de 62

57 La RT-PCR multiplex en tiempo real determina la presencia de RNA de los cuatro serotipos del virus dengue en suero y plasma. Un resultado positivo es indicativo de infección reciente provocada por el serotipo o serotipos identificados. Medidas de bioseguridad Toda muestra recibida en el laboratorio se considera potencialmente infecciosa. Los mecanismos de contención dependen de la metodología practicada, en el caso de extracción de material genético y amplificación se requiere de áreas exclusivas, con gabinetes de bioseguridad nivel 2 para extracción y para preparación de reactivos e incorporación de RNA s de muestras problema, se requieren gabinetes con especificaciones para trabajar reacciones de PCR. Cada gabinete deberá estar ubicado en áreas delimitadas y separadas. El manejo de virus en biología molecular, requiere personal altamente capacitado y protección específica para el analista. El personal emplea guantes libres de talco y batas desechables. Para sanitizar las áreas y superficies de trabajo, es necesario utilizar, hipoclorito de sodio al 7.5%, agua bidestilada y etanol al 75% (siempre utilizar en ese orden para no promover vapores que se forman con el contacto de hipoclorito y etanol) o en su caso usar las soluciones correspondientes para eliminación de RNasas y DNasas. Página 57 de 62

58 ANEXO 1 Relación de solución AVL, RNA AVE por muestra Página 58 de 62

59 ANEXO 2 Guía rápida de extracción manual de ácidos nucleicos (QIAGEN) Lisis de 140 µl de muestra µl de buffer AVL- acarreador RNA Muestra Incubar 10 min a T.A. Agregar 560 µl de etanol a la mezcla anterior y tomar 630 µl y centrifugar 8000 rpm, durante 1 minuto a 4 C Agregar nuevamente 630 µl de la mezcla anterior y centrifugar 8000 rpm, durante 1 minuto a 4 C Agregar 500 µl de Buffer AW1 y centrifugar a 8000 rpm, durante 1 minuto a 4 C Agregar 500 µl de Buffer AW2 y centrifugar a rpm, durante 3 minutos a 4 C Agregar 60 µl de buffer de elución y centrifugar 8000 rpm, durante 1 minuto a 4 C Página 59 de 62

60 ANEXO 3 Distribución de muestras en placa de amplificación. Este diseño de placa es el recomendado e incorpora hasta 84 muestras problema, pero puede ser rediseñado según necesidades del usuario. Se recomienda que una vez incorporados las muestras y controles, estos deberán taparse inmediatamente. Página 60 de 62

61 ANEXO 4 Protocolo de amplificación de ensayo. Temperaturas, tiempo, número de ciclos y colección de datos ANEXO 5 Tiempo de corrida para Detección y serotipificación de los cuatro serotipo de virus dengue por RT PCR Múltiplex en Tiempo Real (3:58 horas) en el equipo CFX96 BIORAD Página 61 de 62

62 ANEXO 6 Resultados de amplificación. En color verde se observan las muestras identificadas para serotipo DEN-1; en rojo, para serotipo DEN-2; en azul, para serotipo DEN-3 y en negro para serotipo DEN-4. Graficas de amplificación presentadas en formato logarítmico. ANEXO 7 Equipo CFX96 BIORAD Unidad óptica CFX96 Pantalla Unidad termina C1000 Teclado Página 62 de 62