UN PROCEDIMIENTO AMIGABLE AL INVESTIGADOR Y A LA ECOLOGÍA: EL USO DEL ISOPROPANOL COMO SUSTITUTO DEL METANOL EN LA ELECTROTRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS

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1 Clave: UN PROCEDIMIENTO AMIGABLE AL INVESTIGADOR Y A LA ECOLOGÍA: EL USO DEL ISOPROPANOL COMO SUSTITUTO DEL METANOL EN LA ELECTROTRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS Marco A., Villanueva Méndez DIRECCIÓN DE LOS AUTORES Unidad Académica Puerto Morelos, Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, UNAM, Ave. Niños Héroes S/N, Puerto Morelos, Quintana Roo, C.P , México. Instituto de Biotecnología, UNAM, Ave. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, C.P , México. CORREO ELECTRÓNICO

2 INTRODUCCIÓN La inmunodeteccion de proteínas en membranas de nitrocelulosa u otros polímeros, por anticuerpos específicos, es actualmente una de las técnicas más usadas para su caracterización bioquímica a través de la técnica de western blot (Towbin et al., 1979). En este procedimiento las proteínas separadas en un gel de poliacrilamida son electrotransferidas en un buffer de transferencia que contiene el alcohol metanol (25 mm Tris HCl, 192 mm glicina, 20% (v/v) metanol, ph 8.3), que es altamente tóxico y que prácticamente no ha sido modificado desde que la técnica fue reportada por primera vez en 1979 (Towbin et al., 1979). El metanol en la solución se requiere para evitar una expansión en exceso del gel durante la transferencia y para ayudar a despegar el dodecil sulfato de sodio (SDS) de los complejos SDS-proteína (Mozdzanowski and Speicher, 1992). Se ha intentado únicamente reducir la concentración de metanol de 20 a 10%, pero no se han reportado sustituciones del metanol por algún otro solvente menos tóxico, y que a la vez, permitan una transferencia exitosa. La presencia de metanol en el buffer hace que estas soluciones se vuelvan tóxicas y por ello, además de requerir un manejo cuidadoso en el laboratorio, se requiere de un desecho especial de las mismas en muchos países pues su presencia contamina los mantos freáticos y salidas de drenaje. En este trabajo, se hizo una sustitución del metanol en la solución de transferencia por un alcohol mucho menos dañino, el cual puede manejarse con bajo riesgo de toxicidad por exposición y desecharse de forma segura en los drenajes sin riesgo de contaminar el medio ambiente. Esta sustitución se hizo con el alcohol común de farmacia, isopropanol (2-propanol) en el buffer y las electrotransferencias de proteína bajo estas condiciones fueron eficientes, tanto en membranas de nitrocelulosa, como de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Más aún, las proteínas transferidas pudieron ser inmunodetectadas por anticuerpos específicos en la técnica de western blot.

3 MATERIALES Y MÉTODOS La composición del buffer al cual se le denominó buffer amigable ( Friendly Buffer en inglés [Villanueva, 2008]), consistió de 25 mm Tris HCl, 192 mm glicina, 5-10% (v/v) isopropanol (Fermont; Monterrey, N.L., México; pureza del 99.8%). Las proteínas analizadas fueron proteínas de suero total de conejo en diluciones de 1/100, 1/75, 1/50, y 1/25. Marcadores de peso molecular preteñidos Kaleidoscope Precision Plus (BioRad Laboratories; Hercules, CA, USA) fueron usados como referencia. Las proteínas se corrieron en geles desnaturalizantes de 12% de poliacrilamida (Laemmli, 1970). Después de la corrida las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore; Billerica, MA, USA) o de PVDF (Immobilon-P, Sigma; St. Louis, MO, USA) por 1 h a 300-mA corriente constante. Las membranas de PVDF se humedecieron inicialmente en etanol y después en el buffer de transferencia correspondiente. Las transferencias se hicieron ya sea en una cámara húmeda Protean (Bio-Rad), o una cámara semi-seca modelo SemiPhor (Hoefer Scientific; San Francisco, CA, USA), con buffer de tranferencia de Towbin (25 mm Tris HCl, 192 mm glicina, 10% (v/v) metanol), o buffer amigable. Después de la transferencia las membranas se enjuagaron brevemente con agua y se tiñeron con 0.1% (w/v) Ponceau (Sigma). Para la inmunodetección de Inmunoglobulina G (IgG), las membranas se bloquearon con 3% albúmina sérica bovina (BSA) en buffer fosfato salino (PBS; 10 mm NaPi, 0.15 M NaCl, ph 7.5) por 1 h a 50 C. Las membranas bloqueadas se incubaron por 2 h a 25 C con una dilución de 1/5000 de anticuerpo de cabra anti-conejo IgG conjugado a fosfatasa alcalina (Zymed-Invitrogen Laboratories; Carlsbad, CA, USA) en PBS adicionado con 0.01% Tritón X-100 (PBST). Después se lavaron 5 veces 5 min en PBST, una vez en PBS, y se revelaron con una solución comercial de bromo cloro indolil fosfato (BCIP) y nitro azul de tetrazolio (NBT) (Sigma) hasta que aparecieron las bandas coloridas de proteína. Los geles transferidos se tiñeron con 0.2% (w/v) azul de coomassie en etanol-ácido acético-agua (40:10:50) y se destiñeron con etanol-ácido acético-agua (40:10:50), seguido de 10% (v/v) ácido acético.

4 Figura 1: Patrón de proteínas electrotransferidas en buffer amigable (A) e inmunodetección posterior de igg del suero de conejo (B). A. Diez µl por carril de suero de conejo fueron corridos en diluciones de 1/25 (carril 6), 1/50 (carril 5), 1/75 (carril 4), y 1/100 (carril 3) en un gel de 12% de poliacrilamida desnaturalizante que posteriormente fue electrotransferido a nitrocelulosa en buffer amigable y teñido con Ponceau. El patrón de proteínas fue claramente detectable siendo la albúmina (~ 67 kda) la proteína mayoritaria (carriles 3-6). Los marcadores de peso molecular preteñidos Kaleidoscope Precision Plus corridos y transferidos en el mismo gel fueron igualmente detectados claramente en cargas de 3 (carril 1), y 6 µl (carril 2). B. La misma membrana desteñida se procesó para western blot y los anticuerpos anti-igg de conejo revelaron clara y específicamente la banda de IgG de 55 kda en todas las diluciones del suero (carriles 1-4; flecha inferior). La albúmina delineada con un lápiz antes de desteñir en el carril con mayor concentración (carril 4; flecha superior) no dió reacción alguna a pesar de ser la proteína mayoritaria.

5 RESULTADOS Tanto los marcadores de peso molecular (Fig. 1A, carriles 1 y 2), como las proteínas del suero de conejo (Fig. 1A, carriles 3 6) fueron claramente detectados después de la electrotransferencia a nitrocelulosa de los geles en buffer amigable en una cámara húmeda. La transferencia fue igualmente eficiente cuando las membranas transferidas fueron nitrocelulosa en la cámara semi-seca, o cuando se usó PVDF bajo condiciones semisecas o húmedas (datos no mostrados). Adicionalmente, los geles electrotranferidos en todas las condiciones anteriores, y teñidos con azul de coomassie mostraron muy poca proteína remanente en los mismos (datos no mostrados), confirmando la transferencia eficiente bajo las condiciones del buffer amigable. Las proteínas del suero de conejo fueron claramente observadas en la dilución menor de 1/25 (Fig. 1A, carril 6), y fueron disminuyendo en intensidad a medida que la dilución se hizo mayor; por ejemplo, en la dilución de 1/100 de suero (Fig. 1A, carril 3). En todas las muestras de suero de conejo, la banda más intensa correspondió a la albúmina con un peso molecular de 67 kda (Fig. 1A, carriles 3-6), y en algunos casos antes de desteñirla se marcó su contorno con un lápiz (Fig. 1B, carril 4, flecha superior) para poder tenerla como referencia en la inmunodetección. Precisamente con el fin de probar la capacidad de las membranas electrotransferidas para inmunodetección, estas se destiñeron, se bloquearon, e incubaron con anticuerpos anticonejo IgG acoplados a fosfatasa alcalina. Después de lavar y revelar, se observó claramente una banda correspondiente a la cadena pesada de la IgG de 55 kda (Fig. 1B, carriles 1-4, flecha inferior), justo debajo del contorno de la banda de albúmina marcada previamente con lápiz (Fig. 1B, carril 4, flecha superior). Este resultado fue idéntico para todos los tipos de membranas electrotransferidas y en las diferentes condiciones húmedas o semi-secas. Estos resultados demostraron que la electrotransferencia con el buffer amigable es eficiente con diferentes tipos de membrana y bajo condiciones húmedas y semi-secas. Más aún, que estas membranas electrotransferidas son adecuadas para inmunodetección con anticuerpos específicos en la técnica de western blot.

6 DISCUSIÓN En varias décadas desde que se reportó por primera vez la inmunodetección de proteínas por western blot, no se había modificado prácticamente el buffer de Towbin reportado en este procedimiento (Towbin et al., 1979). El hecho que el metanol es necesario para mantener el gel sin expandirse demasiado durante la transferencia y para quitar el SDS de los complejos SDS-proteína durante la electrotransferencia (Mozdzanowski and Speicher, 1992), lo hacía difícil de sustituír a pesar de ser un solvente altamente tóxico. La sustitución de este solvente por el alcohol poco tóxico isopropanol, demostró ser apropiada para la electrotransferencia eficiente de proteínas marcadoras de peso molecular preteñidas y del suero de conejo. El hecho de que proteínas de alto peso molecular (>100 kda) hayan sido transferidas adecuadamente permite reforzar la conclusión de que la electrotransferencia es eficiente bajo estas condiciones. Más aún, porque no hubieron diferencias en el patrón de proteínas electrotransferidas ni en las proteínas residuales en los geles cuando se compararon las membranas y los geles teñidos entre transferencias con el buffer de Towbin y el buffer amigable (datos no mostrados). Las proteínas del suero de conejo mostraron un patrón bien definido pero siempre fue la albúmina la proteína mayoritaria en todas las muestras incluso en la más diluída. Esto es lógico porque se sabe que la albúmina es la proteína mayoritaria en el suero de los mamíferos (Chen et al., 2005). Las membranas electrotransferidas con el buffer amigable también demostraron ser adecuadas para la inmunodetección con anticuerpos específicos en la técnica de western blot pues la IgG pudo ser inmunodetectada claramente justo debajo de la posición de migración de la albúmina en todas las diluciones analizadas del suero de conejo (Fig. 1B). Aunque el etanol no fue un sustituto eficiente del metanol para electrotransferencia, este sí puede sustituirse por el metanol recomendado originalmente para pre-humedecer las membranas de PVDF y en las soluciones de teñido y desteñido de azul de coomassie (ver Materiales y Métodos), y así hacer a la técnica totalmente libre de metanol.

7 Este procedimiento permitirá el uso rutinario de la técnica de western blot sin el riesgo de la alta toxicidad del metanol para el usuario y para su desecho pues debido a esta alta toxicidad, el desecho de soluciones que contienen metanol contaminan los mantos freáticos y los sitios a donde finalmente va a parar este solvente. En países desarrollados usualmente hay métodos adecuados para su desecho apropiado pero en países en desarrollo representa un problema y este procedimiento amigable al medio ambiente puede ser una solución muy apropiada. CONCLUSIONES El isopropanol es un sustituto adecuado para el metanol en la electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa y PVDF. El uso del buffer amigable fue eficiente para electrotransferir con diferentes tipos de membrana y bajo condiciones húmedas y semi-secas. Las membranas electrotransferidas fueron adecuadas para inmunodetección con anticuerpos específicos en la técnica de western blot. El uso del buffer amigable permite un manejo menos riesgoso para la salud del usuario y para el desecho de los residuos de la solución de transferencia pues esta contiene el alcohol de baja toxicidad isopropanol en lugar del altamente tóxico metanol.

8 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Chen, Y.-Y.; Lin, S.-Y.; Yeh, Y.-Y.; Hsiao, H.-H.; Wu, C.-Y.; Chen, S.-T.; Wang, A.H.-J. (2005): A modified protein precipitation procedure for efficient removal of albumin from serum, Electrophoresis, 26(11), Laemmli, U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, Mozdzanowski, J.; Speicher, D.W. (1992): Microsequence analysis of electroblotted proteins: I. Comparison of electroblotting recoveries using different types of PVDF membranes, Anal. Biochem., 207(1), Towbin, J.; Stehelin, T.; Gordon J. (1979): Electrophorectic transfer of proteins from polyacylamide gels to nitrocellulose sheets, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(x), Villanueva, M.A. (2008): Electrotransfer of proteins in an environmentally friendly methanol-free transfer buffer, Anal. Biochem., 373(2),

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