ANOMALÍAS EN EL PERFIL DE METILACIÓN COMO BIO-MARCADOR EN EL CÁNCER DE MAMA

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1 TESIS DOCTORAL ANOMALÍAS EN EL PERFIL DE METILACIÓN COMO BIO-MARCADOR EN EL CÁNCER DE MAMA JOAQUINA MARTÍNEZ GALÁN Oncología Médica y Radioterápica UNIVERSIDAD DE GRANADA DEPARTAMENTO DE RADIOLOGÍA Y MEDICINA FÍSICA

2 Editor: Editorial de la Universidad de Granada Autor: Joaquina Martínez Galán D.L.: GR ISBN:

3 Índice ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN EPIDEMIOLOGÍA ETIOLOGÍA Historia familiar Edad Historia menstrual y reproductiva Terapia hormonal Exposición a radiación ionizante Historia de lesiones benignas Otros Factores de Riesgo a) Dieta.. 18 b) Ingesta de alcohol 18 c) Obesidad FACTORES PRONÓSTICOS Y PREDICTIVOS DE RESPUESTA EN EL CÁNCER DE MAMA Factores dependientes del paciente. Edad Factores dependientes de las características histológicas del tumor. 23 a) Estadio ganglionar N. 23 b) Tamaño tumoral T. 25 c) Grado histológico G 26 d) Invasión linfovascular. 27 e) Tipo histológico Factores dependientes de las características moleculares del tumor. 29 a) Expresión de receptores hormonales.. 30 b) Expresión de Her-2/neu (erb-2).. 30 c) Proteína p53 31 d) Ki-67 (mi 1). 32 e) Otros factores moleculares pendientes de validar. Perfil génico 33 tumor ii

4 Índice 1.4. PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EMPLEADAS EN EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER DE MAMA. LIMITACIONES ACTUALES EN EL DIAGNÓSTICO PRECOZ Autoexploración Exploración mamaria por un clínico experto Ecografía mamaria Mamografía Resonancia Nuclear Magnética ALTERACIONES EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER Biología de las regiones CpG, metilación del ADN y acetilación/desacetilación de las histonas 46 acetilación/desacet Aplicación del estudio del perfil de metilación aberrante del ADN en el cáncer de mama Muestras y fluídos en los que se puede estudiar el perfil de metilación a) Detección de ADN libre extraído de suero o plasma.. 56 b) Detección del ADN tumoral a partir del lavado de los conductos galactóforos Posibles campos de aplicación del estudio del ADN metilado de forma patológica.. 58 a) ADN metilado como marcador de riesgo en cáncer. 58 b) ADN metilado como marcador pronóstico en cáncer. 60 c) ADN metilado como factor predictivo de respuesta clínica en cáncer.. 61 d) Aplicación del ADN metilado a la terapéutica del cáncer GENES UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN. RUTAS METABÓLICAS EN LAS QUE INTERVIENE Metilación en genes supresores de tumores Metilación en genes relacionados con los mecanismos de control celular Metilación de genes implicados en la reparación del ADN Metilación de genes implicados en la adhesión celular Metilación en genes implicados en la prolferación celular 71 iii

5 Índice 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS HIPÓTESIS OBJETIVOS MATERIAL Y MÉTODOS DISEÑO PERIODO DE ESTUDIO.. pág MATERIAL Fuentes del material de estudio 82 a) Fuentes de los datos biográficos, clínicos y anatomopatológicos b) Fuente de datos analíticos Instrumentación. 85 a) Centrífugas. 85 b) Baño termostatizado 86 c) Congeladores.. 86 d) ph-metro 87 e) Balanza de precisión. 87 f) Termociclador g) Sistema de electroforesis.. 87 h) Transiluminador. 87 i) Sistema de reproducción fotográfica y video.. 88 j) Análisis de imagen. 88 k) Otros REACTIVOS QUÍMICOS. 88 a) Etanol 99%, Pellets de NaOH, β-mercaptoetanol y Buffer TE 88 b) Agarosa c) Tampón de carga. 88 d) Bromuro de etidio.. 89 e) Otros reactivos químicos.. 89 f) Solución de ClONa al 10% REACTIVOS BIOLÓGICOS PARA PCR 89 a) DNA estándar CpGenome TM 89 b) Extracción del ADN 89 c) Modificación del ADN metilado.. 90 d) Amplificación iv

6 Índice MATERIAL FUNGIBLE.. a) Material plástico para el aislamiento del ADN, modificación bisulfítica del ADN metilado y amplificación por PCR- RT MÉTODO Obtención de las muestras sanguíneas incluidas en el estudio Extracción del ADN de la muestra de suero de los sujetos Modificación Bisulfítica Procedimiento experimental PCR en tiempo Real QMS-PCR utilizando SYBR Green Análisis estadístico RESULTADOS CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO CASOS Y CONTROLES INCLUIDOS EN ESTE ESTUDIO Análisis descriptivo univariante del grupo control a) Datos Epidemiológicos-biográficos 107 b) Datos histopatológicos en grupo control con patología benigna Análisis descriptivos univariante del grupo casos. 110 a) Datos Epidemiológicos-biográficos 110 b) Datos referentes a las características clínicas del tumor 113 c) Datos referentes al tipo de cirugía. 114 d) Datos referentes al resultado anatomo-patológico 115 e) Datos referentes al tratamiento Adyuvante f) Datos del seguimiento METILACIÓN DE LOS PROMOTORES DE LOS GENES ESTUDIADOS EN ESTE TRABAJO Determinación del estado de metilación en el grupo control Determinación del estado de metilación en el grupo de pacientes con cáncer de mama Análisis inicial de los resultados Determinación del estado metilación en el grupo de mujeres afectas de cáncer de mama Estadística descriptiva general por grupo v

7 Índice 4.3. ESTUDIO DE LA RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES EPIGENÉTICAS Contraste de la hipótesis Análisis multivariante Validación de la capacidad discriminatoria del test Sensibilidad y especificidad del test diagnóstico CORRELACIÓN PERFIL METILACIÓN DE RE METILADO (+) EN SUERO CON EL SILENCIAMIENTO DE EXPRESIÓN RE EN TUMOR VARIACIÓN PERFIL DE METILACIÓN PRE Y POST-TRATAMIENTO ESTUDIO CORRELACIÓN VARIABLES CLÍNICO-PATOLÓGICAS CON EL PERFIL DE METILACIÓN DE LOS GENES RE, SIGMA, E- CADHERINA, APC Y RAR- BETA ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA Análisis univariante de los factores pronósticos clínicopatológicos relacionados con la supervivencia libre de enfermedad Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y sigma en relación con la supervivencia libre de enfermedad Análisis univariante de los factores pronósticos clínicopatológicos relacionados con la supervivencia global del cáncer de mama Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y sigma en relación con la supervivencia global del cáncer de mama cáncer de mama Modelo de regresión multivariante de Cox DISCUSIÓN DIAGNÓTICO PRECOZ EN EL CÁNCER DE MAMA. JUSTIFICACIÓN Despistaje del cáncer de mama mediante las técnicas actuales. Sus ventajas, limitaciones, costes y riesgos Papel de los Marcadores Tumorales empleados actualmente en la clínica, sus ventajas y limitaciones NECESIDAD DE BUSCAR NUEVOS BIOMARCADORES EN EL CÁNCER DE MAMA. 182 vi

8 Índice 5.3. JUSTIFICACIÓN DEL ADN METILADO COMO BIOMARCADOR EN EL CÁNCER DE MAMA Discriminación entre casos - controles y entre controles sanos/controles con patología benigna Monitorización y respuesta biológica de los biomarcadores en sangre periférica tras tratamiento Correlación de los Biomarcadores hipermetilados y las variables clínico patológicas 5.4. CORRELACIÓN DE FENOTIPOS LUMINALES EN CÁNCER DE MAMA Y METILACIÓN CONCLUSIONES 211 variables clínico pa PUBLICACIONES Y COMUNICACIONES EN CONGRESOS ABREVIATURAS BIBLIOGRAFÍA 229 vii

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10 INTRODUCCIÓN

11 Introducción 1. INTRODUCCIÓN Hace veinte años el cáncer era considerado una enfermedad maligna de etiología desconocida y de carácter invariablemente mortal. Esta concepción fatalista se ha modificado en las últimas décadas gracias al avance producido especialmente en el campo de la biología molecular, que han permitido encontrar nuevas dianas moleculares sobre las que desarrollar nuevos fármacos, lo que ha a su vez ha permitido una mejor aproximación al pronóstico de la enfermedad y un mejor manejo en el tratamiento de los pacientes diagnosticados de cáncer. La palabra cáncer, es un término genérico que se emplea para designar un grupo de entidades que difieren de forma variable en su histogénesis, morfología, evolución clínica, pronóstico y tratamiento, presentando particularidades morfológicas y biológicas que permiten clasificar e identificar por separado diferentes tipos de tumores. Hoy día y como consecuencia del desarrollo de la proteómica, genómica y la incorporación de técnicas de biología molecular a la práctica clínica y asistencial, se ha podido encontrar una explicación genética y molecular para muchas de las alteraciones celulares que acontecen en esta patología, con la consiguiente repercusión en los aspectos clínicos que afectan al diagnóstico, pronóstico y el tratamiento de los pacientes con cáncer. Uno de los avances más relevantes en el estudio de la carcinogénesis ha sido poder conocer y explorar las diferentes rutas de señalización y transducción de señales que tiene lugar en la célula en respuesta a un estímulo inicial y como esta puede ocasionar en determinadas circunstancias la pérdida de equilibrio entre genes encargados de velar por el correcto funcionamiento del ciclo celular y aquellos otros de cuya transcripción se deriva la activación desorganizada y patológica de cascadas moleculares que pueden favorecer el desarrollo de un proceso tumoral. Por tanto, identificar las vías y rutas de señalización específicas que las células tumorales utilizan para promover procesos relacionados con proliferación, supervivencia y capacidad metastásica junto con la identificación de - 1 -

12 Introducción nuevos marcadores moleculares en suero u otros fluídos corporales que puedan ser de utilidad en el diagnóstico precoz y en la predicción de respuesta tumoral al tratamiento oncológico establecido, supondría un importante objetivo que podría ayudar a alcanzar un diagnóstico más temprano con el consiguiente mejor pronóstico de los pacientes así como aplicar tratamientos más personalizados y por tanto menos tóxicos a los pacientes diagnosticados de cáncer. En la práctica habitual se dispone de la posibilidad de poder realizar en algunos tipos de tumores, determinaciones de sustancias que, conocidas como marcadores tumorales, son producidas o inducidas por las células neoplásicas, o por células del huésped, y cuya presencia anómala puede ser detectada en el suero o en otros fluídos corporales. Su concentración en el suero o su detección en el tejido pretenderían reflejar el crecimiento o la actividad del tumor y así ser de utilidad para establecer el pronóstico, realizar el seguimiento o comprobar la eficacia del tratamiento realizado. Sin embargo la mayoría de estas sustancias no son específicas de un tumor, por lo que se sabe que su utilidad en el diagnóstico es relativa aunque en algunos casos se ha demostrado su valía en la detección temprana de recidiva y en el control evolutivo de la enfermedad. Por tanto, dada la alta prevalencia de cáncer a nivel mundial y la importancia de realizar un diagnóstico precoz, se hace necesaria la búsqueda de nuevos marcadores moleculares que ayuden a discernir pacientes afectados de cáncer, conocer mejor el grado de extensión de su enfermedad, y diferenciarlos de los sujetos sanos o de aquellos afectos de procesos tumorales benignos EPIDEMIOLOGIA El cáncer sigue siendo un problema de salud de primer orden en Europa donde, aunque las tasas de incidencia específicas por edad se mantienen estables, el número total de casos aumenta lentamente debido a las mejores técnicas diagnósticas y sobre todo al envejecimiento de la población. En 2008, se diagnosticaron aproximadamente 3.2 millones de nuevos casos de cáncer en - 2 -

13 Introducción Europa; esto supone un aumento del número anual de nuevos casos de cáncer del orden de casos desde el 2004 (10.5%) [1]. Considerando la incidencia global de cáncer tanto en hombres como en mujeres, el cáncer más frecuentemente diagnosticado en Europa en el año 2008 fue el cáncer colo-rectal con una incidencia aproximada de nuevos casos (13.6% del total), seguido del cáncer de mama con casos (13.1%), el cáncer de pulmón con casos (12.2%) y finalmente el cáncer de próstata con un total de casos de (11.9%). Gráfica 1. Colo-rectal Mama Pulmón Próstata Estómago Vejiga Páncreas C. oral y Faringe Riñón LNH Melanoma Endometrio Leucemia Ovario SNC Hígado Cérvix Tiroides Esófago Laringe Mieloma Múltiple Vesícula L.H. Testicular Casos Muertes Gráfica 1. Número estimado de casos y muertes por cáncer en Europa en

14 Introducción No obstante si analizamos solamente la incidencia ocurrida en el sexo femenino, el cáncer más frecuentemente diagnosticado fue el cáncer de mama con una incidencia aproximada del 28.2% en toda Europa y del 23% en España [1, 2]. Gráfica 2. Casos de Cáncer en mujeres ; 3% ; 3% ; 4% ; 4% ; 4% ; 28% ; 28% ; 14% ; 7% ; 5% Mama Colo-rectal Pulmón Endometrio Ovario Estómago Cérvix Páncreas Melanoma Otros Gráfica 2. Distribución de los casos de cáncer más frecuentes esperados en el año 2008 en Europa. En cuanto a las tasas de mortalidad por cáncer en global en Europa, el tipo de cáncer con mayor mortalidad fue el cáncer de pulmón con muertes lo que representa el 19.9 % del total, seguido del cáncer colo-rectal con casos de muerte por cáncer (12.3 %), el cáncer de mama con casos (7.5 %) y por último el cáncer de estómago con (6.8 %), gráfica 1. Sin embargo cuando analizamos lo que sucede en el género femenino, el cáncer de mama se sitúa como la principal causa de muerte por cáncer siendo su porcentaje del 17 % en Europa y del 18.4 % en España [2]. Gráfica

15 Introducción Muerte por Cáncer en mujeres ; 3% 9.964; 1% ; 6% ; 33% ; 6% ; 17% ; 13% ; 12% ; 3% ; 6% Mama Colo-rectal Pulmón Endometrio Ovario Estómago Cérvix Páncreas Melanoma Otros Gráfica 3. Distribución de los tipos de cáncer más frecuentes esperados en el año 2008 en Europa por mortalidad. La epidemiología por tanto del cáncer de mama adquiere una gran relevancia por tratarse de la neoplasia maligna más frecuente entre las mujeres y tener una morbi-mortalidad que si bien no es de las más elevadas sí constituye un importante problema de salud pública. El cáncer de mama representa la primera causa de muerte por cáncer en la mujer en los países industrializados siendo en los países latinoamericanos y africanos la segunda causa de muerte por cáncer tras el cáncer de cérvix uterino. También en los países del continente asiático el cáncer de mama es el segundo tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado, seguido del cáncer gástrico [3]. Concretamente en España, el cáncer de mama representa la neoplasia maligna más frecuente entre las mujeres exceptuando el cáncer de piel no melanoma, estando la probabilidad de que una mujer española desarrolle esta enfermedad antes de los 75 años de edad comprendida entre un 5% y un 8%, lo que significa que aproximadamente 1 de cada mujeres desarrollarán la enfermedad [4]. En los países industrializados, en las últimas décadas, se ha producido un incremento estable e importante en la incidencia de esta enfermedad. Quizás este incremento en la incidencia esté en relación con la mejora de la atención sanitaria y - 5 -

16 Introducción con una mejor estrategia diagnóstica que permite una detección de la enfermedad más eficaz. Los datos recopilados entre 1988 y 1990 indican que el riesgo de desarrollar cáncer de mama a lo largo de la vida de las mujeres es del 12.2% [5]. El número de casos nuevos estimados a nivel mundial viene a ser de por año, cifra que representa un 20% de todos los casos de cáncer, concretamente en 2006, se diagnosticaron unos de nuevos casos de cáncer de mama. En términos de mortalidad, el cáncer de mama representa el tumor que más mortalidad causa en el sexo femenino. En el año 2006, un total de mujeres diagnosticadas de cáncer de mama fallecieron por esta causa, lo que equivale a un 16.7% de todas las causas por cáncer. Es la primera causa de muerte por neoplasia en las mujeres de 35 a 65 años, siendo también en mujeres norteamericanas la neoplasia diagnosticada con más frecuencia y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer. El riesgo de muerte por cáncer de mama a lo largo de la vida es del 3.6%, o lo que es lo mismo una de cada 282 mujeres. Esta relativa constancia en la mortalidad a pesar del incremento en la incidencia puede deberse a los mejores programas de detección precoz y a los avances en el tratamiento [4, 6]. Datos recopilados en EEUU en cuanto a mortalidad han puesto de manifiesto una disminución anual del 2% en el índice de mortalidad lo que ha supuesto una reducción total del 25% de muertes de cáncer en 2007 comparadas con 1990 [7]. Por tanto y a pesar de existir una tendencia gradual de aumento en la incidencia del cáncer de mama, datos derivados de la vigilancia personal, programas de screening y avances en el diagnóstico, así como en el correcto seguimiento de la enfermedad y los avances terapéuticos han dado como resultado una disminución en la mortalidad por cáncer de mama del 2% por año [8]. Por tanto parece claro que el diagnóstico más temprano de la enfermedad nos conduciría a una disminución de la mortalidad por cáncer de mama y por ello es necesario insistir en la importancia de obtener mejores programas de screening, con mayor - 6 -

17 Introducción capacidad para detectar potenciales casos de cáncer de mama y de esta forma poder anticiparnos a su abordaje terapéutico probablemente de forma menos agresiva y con mayores porcentajes de curación ETIOLOGÍA El cáncer se considera una patología compleja resultado de múltiples alteraciones debidas al acúmulo de distintos acontecimientos genéticos dentro de una célula. La célula en su proceso de crecimiento y proliferación carente de regulación hacia el desarrollo tumoral adquiere nuevas características tanto funcionales como morfológicas distintas a las que caracterizan a la célula de la que derivaba, dando lugar a un clon celular con capacidad de crecer de forma desorganizada, carente de control y progresivamente con mayor grado de displasia celular hasta que finalmente, puede desencadenar el desarrollo del proceso canceroso [9]. Estudios en el campo de la carcinogénesis apoyan la hipótesis que propone que estos cambios neoplásicos se desarrollan durante un largo periodo de tiempo en el cual se van acumulando mutaciones somáticas en la célula, resultando de todo ello un paso progresivo desde un fenotipo celular normal a un fenotipo hiperplásico, posteriormente displásico y finalmente neoplásico [10]. Este daño genético que se va acumulando en la célula, ocasiona cambios transcripcionales a favor de genes que inducen proliferación y supervivencia celular incontrolada conocidos como oncogenes, suprimiendo la expresión de otro grupo de genes llamados genes supresores de tumores que por el contrario actuarían regulando el ciclo celular, inhibiendo el crecimiento e induciendo fenómenos apoptóticos [11]. Sin embargo la genética por sí sola no puede explicar la diversidad de fenotipos que se encuentran dentro de una misma población así como tampoco puede explicar cómo seres homocigotos o clonados a pesar de tener secuencias de ADN idénticas, pueden tener fenotipos y susceptibilidades diferentes a una enfermedad. Hoy día sabemos que el cáncer también puede ser resultado de acontecimientos epigenéticos que conducirían al desarrollo de un tumor por producir cambios - 7 -

18 Introducción hereditarios de la expresión génica de la célula sin que con ello se deriven cambios en la secuencia del ADN [12]. Molecularmente este hecho se relaciona con un patrón de metilación aberrante que ocurre en la región promotora del gen, que está fuertemente vinculada con la represión transcripcional de la cromatina y, consecuentemente, con la pérdida de función de este gen sin producirse por ello cambios en la secuencia de nucleótidos [13]. Este evento conocido como epigenético que fue acuñado por primera vez en 1939 por C.H. Waddington y fue definido como Interacciones ocasionales entre los genes y sus productos que determinan el fenotipo celular, no fue hasta años más tarde cuando se entendió que este tipo de alteraciones hereditarias de la expresión génica no son debidos a cambio alguno en la secuencia del ADN [14]. De todos los eventos epigenéticos el más conocido es el de la metilación del ADN cuyo descubrimiento, unido a su relación con la falta de actividad de genes tumor supresor permitió la identificación de distintos genes supresores de tumores cuyos promotores se encontraban metilados en el tumor y no metilados en los tejidos peritumorales sanos, así como más recientemente su relación con la inactivación génica mediante microarn (miarn) por metilación de su material genético [15]. No obstante, además de las alteraciones genéticas y epigenéticas que explican la cascada de eventos que median en el desarrollo de un proceso neoplásico, se han descrito otros factores conocidos como factores de riesgo que por estar en relación con la exposición a carcinógenos ambientales, o ligados a cierta predisposición genética, se les considera como factores que aumentan la probabilidad de que la persona expuesta o predispuesta desarrolle el cáncer. En este sentido son varios los factores de riesgo descritos como parcialmente responsables del desarrollo del cáncer de mama, aunque ninguno de ellos ha sido identificado como causa fundamental de la misma. Entre los factores que, etiológicamente han sido relacionados con el cáncer de mama se describen los siguientes: - 8 -

19 Introducción Historia familiar La mayoría de los cánceres de mama, se desarrollan en mujeres sin antecedentes familiares considerándose por ello esporádicos. Sin embargo el presentar antecedentes familiares de primer grado (madre o hermana), y a una edad de presentación inferior a 40 años, o la existencia de varios casos en la familia, se asocia con un mayor riesgo para desarrollar esta enfermedad [16]. De hecho entre un 15% a un 20% de los casos de cáncer de mama se presentan en pacientes con antecedentes familiares de esta enfermedad, aunque desconocemos en qué medida esta agregación familiar es fruto del azar, de una susceptibilidad genética, de determinados factores ambientales o de alguna combinación de todos estos factores. En estos casos hablamos de cáncer de mama familiar [17, 18]. Dentro de este subgrupo de pacientes con cáncer de mama familiar, alrededor de un 5-10% de los casos se atribuyen a mutaciones en células de la línea germinal que se transmiten con carácter autosómico dominante y alta penetrancia [19]. Estas mutaciones producen la falta de expresión de genes tumor supresor y de genes implicados en la reparación del ADN dañado, lo que ocasiona un acúmulo de mutaciones en oncogenes y pérdida de control en sitios claves del ciclo celular lo cual se asocia al desarrollo de un tumor. Entre los genes implicados en este subgrupo de pacientes con mayor susceptibilidad al cáncer de mama se encuentran el gen BRCA1 y BRCA2 [20]. Cuando tal anomalía genética se encuentra hablamos de cáncer de mama hereditario. Generalmente, se trata de casos de cáncer de mama que se caracterizan por presentarse a edades más tempranas y/o estar asociados a antecedentes familiares muy importantes [21]. Por tanto en la historia del cáncer de mama distinguimos: a) Cáncer esporádico: Pacientes sin historia familiar en dos o más generaciones. Representa el 68% de todos los cánceres de mama. b) Cáncer familiar: Cuando en una determinada familia aparece dicha neoplasia en dos o más casos en parientes de primer grado (madre o - 9 -

20 Introducción hermana) o segundo grado (abuela, tía o prima) en ausencia de cáncer de mama hereditario. Representa el 23%. c) Cáncer de mama hereditario: Presentan varias características distintivas cuando se compara con el cáncer de mama no hereditario o somático. Así, se asocia con mutaciones en la línea germinal que se transmiten con un patrón autosómico dominante y fuerte penetrancia [22, 23]. Representa un 5-10% [24] de todos los casos de cáncer de mama y la edad de presentación es considerablemente inferior a la que corresponde a los casos esporádicos. Otra de las diferencias es que la prevalencia de cáncer de mama bilateral es más alta, y suelen ser tumores preferentemente con pobre grado de diferenciación celular, receptor de estrógenos negativos y tener con mayor frecuencia afectación ganglionar [25]. En las familias de los individuos con este tipo de herencia se pueden presentar otros tipos de tumores asociados, entre ellos: cáncer de mama y ovario relacionados con la mutación en BRCA1 [26] y alteraciones en BRC2 asociadas al síndrome del cáncer de mama en el varón. La suma de todos estos casos suponen el 85% de todos los cánceres de mama hereditarios [27]. Otros síndromes asociados a mutaciones genéticas son el síndrome Li-Fraumeni debido a mutaciones del gen TP53 [22], y el síndrome de Cowden debido a mutaciones del gen PTEN [28] entre otros. De los estudios epidemiológicos también sabemos que alrededor de un 5-10 % de las pacientes con cáncer de mama tienen un familiar de primer o segundo grado diagnosticado también de cáncer de mama. Estas pacientes tienen un riesgo relativo >50% de padecer cáncer de mama antes de los 70 años [29]. Este riesgo varía en función de la edad en el momento del diagnóstico y número de familiares afectos. Así para pacientes con edad al diagnóstico inferior a 40 años y familiares de primer grado afectadas antes de los 50 años de edad este riesgo es mayor [30]. Dicho de otra manera en los países donde el cáncer de mama es frecuente, el riesgo de desarrollarlo, aumenta el riesgo en un 5.5% para mujeres con un familiar de

21 Introducción primer grado afecto y en un 13% para mujeres con dos familiares afectos de cáncer de mama [31] Edad El riesgo acumulado de desarrollar cáncer de mama aumenta con la edad. La incidencia más alta de cáncer de mama ocurre después de los 35 años; en edades posteriores la frecuencia aumenta progresivamente hasta alcanzar una meseta entre los años para finalmente aumentar de forma manifiesta. No obstante en mujeres con mayor carga genética, el cáncer tiende a ocurrir en edades más tempranas que en los casos esporádicos [16, 32] con el 83 % de los casos en mujeres mayores de 50 años y sólo el 1.5 % en mujeres con menos de 30 años [33]. Es importante conocer que la edad, en el momento del diagnóstico, se considerada como uno de los factores pronósticos más importantes en el cáncer de mama. En efecto se ha observado que la presentación del cáncer en mujeres menores de años se asocia con factores pronósticos negativos, como son: tumores que no expresan receptores hormonales y sobreexpresan HER-2/EGFR, y sabemos que ambas circunstancias se asocian con mayores porcentajes de recaída y con una menor supervivencia global [34]. Todo esto ha hecho pensar que el cáncer en pacientes jóvenes sea una entidad biológica distinta con sus propias rutas de señalización [35] Historia menstrual y reproductiva Muchos son los estudios epidemiológicos que han analizado el papel de la historia menstrual y reproductiva de la mujer en la historia natural del desarrollo del cáncer de mama. La mayoría de ellos, han proporcionado datos que apoyan que factores reproductivos como son la edad de la menarquía temprana, edad de la menopausia tardía, la edad del primer embarazo a término precoz, el número de hijos y el haber dado o no lactancia materna son factores asociados con la modulación del riesgo de desarrollar cáncer de mama [36, 37]

22 Introducción Esta asociación podría estar relacionada con el periodo de tiempo de exposición de la mujer a niveles de estrógenos endógenos a lo largo de su vida y por ello, en relación con el número de ciclos ovulatorios y por tanto con factores hormonales que están firmemente relacionados con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama [38]. Los estrógenos actuarían estimulando la proliferación del epitelio ductal así como la angiogénesis ocasionando una hiperplasia e hipertrofia de las células ductales mamarias durante la primera fase del ciclo menstrual, pudiendo así contribuir a la transformación neoplásica que puede derivar en el desarrollo del cáncer de mama a lo largo de su vida [39]. La importancia que la influencia estrogénica tiene como inductor de proliferación celular en la mama se observó al comprobar que aproximadamente 1/3 de las pacientes con cáncer de mama experimentaban una remisión del tumor cuando se las sometían a tratamientos que implicaban el descenso en los niveles de estrógenos circulantes en sangre periférica [40]. Así mismo, en células en cultivo se ha observado que los estrógenos estimulan la secreción de factores de crecimiento mitogénicos (TGF-α, IGF-1, EGF) e inhiben la secreción de factores represores de la mitosis como el TGF-β mediando como factores paracrinos a nivel del estroma mamario y favoreciendo la proliferación celular sobre la mama [41]. También se ha descrito que la exposición en etapas concretas de la vida de una mujer a altos niveles estrogénicos ventana estrogénica de Koreman, como ocurre al inicio de ciclos ovulatorios y durante los periodos anovulatorios que suceden a lo largo de la vida menstrual o durante la perimenopáusia por insuficiencia luteínica, podría ser otro factor favorecedor en la carcinogénesis del cáncer de mama. En cambio otras variables como serían la edad temprana de paridad y la lactancia materna, favorecen la diferenciación de los conductos terminales del lobulillo que se produce durante el embarazo y la liberación de hormonas autocrinas y paracrinas asociadas a cada embarazo a término, fenómenos que pueden explicar los efectos beneficiosos que de la paridad temprana y la lactancia tienen sobre el riesgo de padecer cáncer de mama [38]. Sin embargo estas ideas siguen siendo controvertidas por existir estudios que no han encontrando relación entre paridad y factor pronóstico del cáncer de mama [42, 43] mientras que otros

23 Introducción en cambio sí han encontrado asociación al describir que el desarrollo de un cáncer de mama en una mujer nulípara se asocia con un factor pronóstico adverso al igual que el tener un primer embarazo a una edad tardía [44]. Otros factores de riesgo relacionados con la historia reproductiva son; la nuliparidad, el nacimiento del primer hijo después de los 30 años y la ausencia de lactancia materna [45]. En resumen entre los factores que pueden aumentar la probabilidad de desarrollar cáncer de mama están; edad temprana de presentación de la menarquia (antes de los 12 años) y edad de presentación de la menopausia tardía (después de los 55 años), ambos asociados a mayor exposición estrogénica. Por el contrario, entre los factores reproductivos que se relacionan con una disminución en la probabilidad de desarrollar cáncer de mama están la presentación de la menarquia a una edad tardía (después de los años) y la presentación precoz de la menopausia (antes de los 45 años), ambos relacionados con una menor exposición a niveles de estrógenos prolongados [46]. En recientes revisiones de la literatura, y a pesar que esta asociación sigue estando confusa, es cada vez con más frecuente la publicación de nuevos datos que demuestran un posible incremento del riesgo de desarrollar cáncer de mama en relación con factores hormonales en función de la expresión de los receptores de estrógenos (RE) y receptores de progesterona (RP) en el tumor [47]. Así algunos autores [48] han descrito que la multiparidad y la edad temprana del primer embarazo se asocian con una disminución del riesgo relativo de desarrollar tumores RE/ RP (+) pero no mostraba ninguna relación con el desarrollo de tumores RE/ RP (-) mientras la lactancia se asociada con un riesgo reducido para el desarrollo de tumores que fuesen RE/ RP (+) y RE/ RP (-), lo que podría sugerir que paridad y lactancia actúan por mecanismos diferentes [47, 49] Terapia hormonal Son muchos los estudios epidemiológicos que han analizado la relación entre la terapia hormonal sustitutiva (THS) y el riesgo de desarrollar cáncer de mama. La mama no hay duda que es un órgano estrógeno-dependiente y muestra de ello es

24 Introducción que durante las etapas del desarrollo puberal y durante el embarazo, son altas las tasas de hormonas circulantes intervienen de forma activa [50]. Concretamente en relación con el cáncer, existen datos que apoyan la teoría según la cual la exposición a tratamientos basados en estrógenos y especialmente cuando se administran a mujeres postmenopáusicas y durante periodos de tiempo superiores a 5 años, puede aumentar el riesgo relativo de desarrollar cáncer de mama hasta en un 1.3 y un 1.7 [51]. Este hecho parece que está en relación con una mayor sensibilidad de las células de la mama en las mujeres postmenopáusicas, a causa de su deprivación estrogénica previa lo que ocasiona un proceso reactivo que incrementa el índice de proliferación y favorece la atipia celular que podría conducir al desarrollo del proceso tumoral [52]. Se ha sugerido que este proceder sustitutivo triplica el riesgo relativo de padecer cáncer en mujeres con antecedentes familiares de esta enfermedad [53]. Así y de acuerdo con los resultados recientemente publicados del estudio HABITS tras un seguimiento de 5 años se observó que el empleo de THS en mujeres que habían sido tratadas previamente por un cáncer de mama provocaba un incremento significativamente superior del riesgo de desarrollo de segundos tumores de mama con un HR = 2.4 (95% CI = 1.3 a 4.2) del respecto a las mujeres que no realizaban este tratamiento y una incidencia acumulada en 5 años del 22.2 % en el brazo que habían recibido HT frente al 8.0 % del grupo control [54]. Sin embargo este hallazgo no ha podido ser confirmado en otros de los muchos estudios que se han realizado en los últimos 25 años de una manera concluyente. Por ello son numerosos los autores que opinan que seguir esta terapia durante 10 años, o menos, no implica riesgo de cáncer, o es tan pequeño que merece la pena asumirlo, dado los beneficios que aporta la THS en la mujer menopáusica. Otros investigadores indican que a partir de los 10 años de la toma de THS es cuando puede aumentar el riesgo de cáncer, mientras que otros destacan que es indiferente el tiempo de administración por afirmar que el riesgo de cáncer existe entre las que siguen la terapia hormonal [55]. No obstante la actualización del ensayo clínico Women s Health Initiative, en el que se incluyeron mujeres de edades comprendidas entre años de

25 Introducción centros diferentes entre y en el que se aleatorizaban a recibir tratamiento con estrógenos equinos y acetato de medroxiprogesterona frente a placebo, se observó un exceso de riesgo para el desarrollo de cáncer de mama para las pacientes expuestas al tratamiento hormonal [56]. Las conclusiones que pueden extraerse de los estudios y metaanálisis realizados es que actualmente no está suficientemente establecido el riesgo asociado al empleo de hormonas exógenas y el desarrollo de cáncer de mama, si bien parece que hay una mayor frecuencia de presentación de tumores de mama en mujeres que han utilizado terapia hormonal sustitutiva durante más de 5 años que entre las mujeres que no lo han hecho, y que esta circunstancia se describe fundamentalmente en pacientes con tumores de mama que expresan receptores hormonales [49]. En cualquier caso, la terapia hormonal sustitutiva, requiere de un análisis preciso de los beneficios y los riesgos que puedan derivarse de su prescripción y solicitar de la persona a la que se le vaya a indicar el tratamiento su consentimiento. Esto exige una postura responsable tanto por parte del médico como del paciente [57] Exposición a radiación ionizante El conocimiento que hoy día se posee sobre el mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama que presentan las mujeres expuestas a radiación ionizante a lo largo de su vida procede fundamentalmente de los estudios epidemiológicos realizados en pacientes que recibieron radiación con fines diagnósticos o terapéuticos así como de aquellos sujetos que sobrevivieron a catástrofes nucleares [58]. De estos estudios se ha derivado que la exposición reiterada a radiaciones ionizantes, principalmente en etapas de la vida donde existe gran proliferación y recambio celular como ocurre con edades inferiores de 20 años, se acompaña de mayor riesgo de daño sobre el ADN y esto es un factor de riesgo para el desarrollo de un carcinoma de mama especialmente en aquellas personas que reciben radiación en la región torácica [59, 60]. Los datos epidemiológicos disponibles han precisado que esta asociación entre dosis de radiación y cáncer sigue un modelo lineal tal que el riesgo es mayor cuanto mayor es la dosis recibida

26 Introducción [61]. Sin embargo otros factores emergieron como posibles factores involucrados y moduladores del efecto lesivo que podría tener la exposición a la radiación ionizante prolongada, si bien no existe unanimidad en las conclusiones de los estudios publicados [62]. Entre estos factores se ha descrito que la presencia de patología benigna de la mama o historia familiar de cáncer de mama podría estar asociada al incremento de riesgo de padecer cáncer tras la exposición a radiación ionizante a dosis relativamente bajas [63-65], también se ha publicado un incremento del riesgo asociado a la exposición de la radiación durante el embarazo [66] y una mayor susceptibilidad genética en relación con polimorfismos de los genes encargados de la reparación del ADN [67, 68]. Por tanto múltiples factores como dosis total de radiación recibida, la edad al inicio de la exposición, y el tiempo desde la primera exposición, son parámetros relacionados con la incidencia de cáncer de mama después de la exposición a la radiación ionizante. Sin embargo, estos riesgos han de ser considerados en el contexto individual de sujetos que se pueden beneficiar de pruebas de cribado poblacional para la detección precoz de un tumor de mama en situaciones en donde el beneficio aportado por dichas pruebas es superior a los riesgos estadísticos descritos [65] Historia de lesiones benignas El hallazgo de lesiones benignas en la mama representa la histopatología más frecuentemente diagnosticada en el curso del diagnóstico de un tumor de mama. La frecuencia de presentación a partir de análisis realizados en muestras de autopsia dada la dificultad para conocer su prevalencia real por tratarse en la mayoría de los casos de lesiones asintomáticas, se estiman que ésta podría ser superior al 50% a partir de los 20 años de edad [69], existiendo una gran variedad histológica. Dentro de esta gran variedad de tipos histológicos podemos encontrar atendiendo al carácter proliferativo de las mismas; lesiones no proliferativas, como son fibroadenomas, quistes, ectasias ductales y metaplasia apocrina, que representarían el 66.7% de las lesiones encontradas, y un segundo grupo de patología benigna que estaría constituído por lesiones proliferativas sin atipia

27 Introducción como el papiloma intraductal, hiperplasia moderada y adenosis esclerosante (29.6%), y un tercer grupo que estaría representado por lesiones proliferativas con atipia entre ellas la hiperplasia ductal con atipia y a hiperplasia lobular con atipia (3.7%) [70]. Si bien la mayoría de estas lesiones no son precursoras de lesiones invasivas, en algunas ocasiones y especialmente cuando se trata de lesiones proliferativas, o con hiperplasia atípica, así como cuando se aíslan múltiples lesiones tras realizar una biopsia de una lesión benigna de mama, se ha descrito que eventualmente pueden evolucionar hacia el desarrollo de un cáncer de mama [71-75]. Autores como Page y Dupont han encontrado que las lesiones proliferativas con atipias tienen un riesgo relativo (RR) de 4-5 para cáncer de mama, en las lesiones proliferativas sin atipias este riesgo disminuye al valor de mientras que no han encontrado asociación entre las lesiones benignas de tipo no proliferativo y el riesgo de padecer cáncer de mama [70]. Sin embargo y a pesar de los múltiples estudios realizados en este campo, aún siguen existiendo algunos aspectos controvertidos [76]. Así en otros trabajos como los realizados por Wang y col. no se ha encontrado asociación entre la presencia de lesiones benignas de mama, cualquiera que sea su número y su histología, y el mayor riesgo para desarrollar cáncer de mama [74]. Recientemente se ha descrito que el riego para desarrollar cáncer a partir de lesiones benignas de mama podría estar influenciado no sólo por la multiplicidad y número de lesiones proliferativas y atípicas aisladas en una biopsia de mama, sino también por la edad de presentación. Esta relación se ha descrito al encontrarse un mayor riesgo de derivar en cáncer de mama las lesiones benignas cuando, asociadas a los factores anteriormente expuestos, se detectan en mujeres con edades comprendidas entre los años frente a presentarse en mujeres con edades menores a 45 años. Este hecho podría estar en relación con el mayor número de ciclos ovulatorios y por tanto con la mayor duración del ambiente de estímulo de la proliferación celular de la mama que conlleva un consiguiente incremento del riesgo para desarrollar atipias celulares [73, 77]

28 Introducción No obstante lo que sí parece estar claro, es que las lesiones no proliferativas no parecen incrementan el riesgo de cáncer de mama en mujeres sin historia de cáncer mamario o con una débil historia familiar. Tan solo en mujeres con importante carga familiar de cáncer de mama, estos hallazgos parecen asociarse al aumento del riesgo, aunque tal aumento se podría explicar por la historia familiar más que por la presencia de lesiones en la mama. Cabe sin embargo mantener que las lesiones proliferativas, particularmente aquellas con atipia, sí parecen predecir un sustancial aumento de riesgo de cáncer de mama [78] Otros factores de riesgo a) Dieta: El papel de la dieta y su relación con el cáncer, ha sido sugerido por distintos autores, debido a la importante variabilidad en la prevalencia de cáncer de mama entre distintos países. La hipótesis según la cual la obesidad, la ingesta elevada de productos derivados de grasas animales y el alcohol aumentan el riesgo del desarrollo de cáncer de mama mientras que la ingesta de frutas, fibra, antioxidantes y fitoestrógenos son factores protectores, puede ser atribuida en parte, a las propiedades antioxidantes de determinados alimentos, así como a la influencia de estos en la reparación del ADN [79, 80]. El aumento de los niveles circulantes de estrógenos endógenos, de insulin-like growth factor 1 y de otros factores de crecimiento, producidos por algunos nutrientes también han sido relacionados con el desarrollo del cáncer de mama. b) Ingesta de alcohol: La asociación entre el consumo de alcohol y el incremento del riesgo de desarrollar cáncer de mama ha sido una constante descrita en numerosos estudios epidemiológicos realizados en las últimas dos décadas, especialmente en mujeres postmenopáusicas [81]. Esta hipótesis parece que está sustentada por distintas teorías. Una de ellas se basa en la hipótesis según la cual el alcohol induciría un aumento de los niveles endógenos de estrógenos que estimularía la proliferación del epitelio mamario pudiendo favorecer el desarrollo de un cáncer de mama RE (+) pero no en casos de tumores RE (-) [82]. Otro de los posibles mecanismos por los que la ingesta de alcohol podría favorecer el desarrollo del cáncer de mama se apoya en la susceptibilidad de la mama al daño

29 Introducción producido al ADN por el alcohol [83, 84]. Sin embargo cuando se realiza una revisión sistemática de la literatura analizando los resultados obtenidos se observa que la asociación entre el consumo de alcohol y riesgo de desarrollar cáncer de mama es débil y que la precisión de la estimación del riesgo relativo es baja en la mayoría de los estudios [85]. Por tanto y como consecuencia de otros factores de confusión [86] no se pueden extraer conclusiones sobre el riesgo padecer de cáncer de mama en relación a la ingesta de alcohol. c) Obesidad: Es bien conocido que la obesidad tiene un papel importante en el desarrollo de graves problemas de salud, especialmente en enfermedades cardiovasculares y en enfermedades endocrino-metabólicas como la diabetes mellitus entre otras. Sin embargo su implicación en el desarrollo del cáncer si bien se ha descrito en numerosos trabajos, sigue siendo controvertida y aunque no está suficientemente probada parece que existe cierta relación entre el riesgo de padecer cáncer de mama y los hábitos dietéticos [87]. En estudios realizados en animales existe evidencia que las alteraciones en el equilibrio metabólico pueden influir en el riesgo de desarrollar cáncer de mama así como en el pronóstico de la enfermedad a través de distintos mecanismos relacionados con la producción de hormonas de esteroideas extragonadales/ováricas [1,2], en particular el estradiol, que han mostrado estar positivamente asociado con el riesgo de cáncer de mama [3,4]. Este hecho parece estar en relación con la variación en el perfil hormonal que ocurre en mujeres obesas especialmente durante la menopausia lo que podría representar un estímulo importante para el crecimiento de células tumorales [88]. De hecho en mujeres sanas con alto índice de masa corporal (IMC) se ha descrito que la obesidad se asocia con un estado de hiperinsulinismo e hiperandrogenismo que contribuye a aumentar los niveles de insulin-like growth factor 1 (IGF-1), implicado en procesos que inducen proliferación, crecimiento celular, mutagénesis y que activan fenómenos antiapoptóticos [89, 90]. Parece ser que tanto IGF-1 como los estrógenos actúan sinérgicamente aumentando los niveles de IGF-1 y su receptor (IGF-1R) estimulando cascadas de señalización intracelulares que estimulan la proliferación celular del epitelio mamario y con ello el aumento del

30 Introducción riesgo de desarrollar cáncer de mama [76]. En relación con ello se ha descrito, en mujeres premenopáusicas, un aumento en el riesgo de desarrollar cáncer de mama con peor supervivencia [87, 88, 90, 91]. De los estudios realizados puede extraerse que un elevado IMC en mujeres que han desarrollado cáncer de mama parece relacionarse con peor pronóstico, por lo que se aconsejan medidas destinadas a controlar el peso de estas pacientes aún cuando es necesaria la realización de nuevos estudios para clarificar esta cuestión [87] FACTORES PRONÓSTICOS Y PREDICTIVOS DE RESPUESTA DEL CÁNCER DE MAMA El cáncer de mama sigue siendo en la actualidad una importante causa de muerte en mujeres en los países industrializados, a pesar de los avances en el diagnóstico precoz y tratamiento que se han producido en las últimas décadas. Esto ha supuesto que junto a la necesidad de desarrollar tratamientos más efectivos y específicos que consigan mayores tasas de curación, sea importante y necesario la búsqueda y el estudio de nuevos marcadores pronósticos y predictivos de respuesta que, sumados a los ya conocidos, permitan predecir de forma individualizada cuál es el beneficio terapéutico de tratar a una paciente con cáncer de mama, así como conocer cuál es el riesgo que tiene de recaída y qué tratamiento es el más adecuado administrar de acuerdo no sólo con las características clínicopatológicas sino también de acuerdo con el perfil molecular del tumor. Históricamente la decisión terapéutica de aplicar un determinado tratamiento oncológico a una paciente ha estado determinada por factores clínicos como la edad y por factores anatomo-patológicos como son el tamaño tumoral, la afectación ganglionar, el grado de diferenciación tumoral y la expresión de receptores hormonales en el tumor [92, 93]. Sin embargo fue a partir del consenso de expertos celebrado en Saint Gallen en el año 2005 [94], y como consecuencia de los ensayos clínicos realizados al añadir al tratamiento estándar, un anticuerpo monoclonal humanizado (Trastuzumab) se pudo demostrar que esta asociación conseguía mejorar tanto el intervalo libre de enfermedad como la supervivencia global de aquellas pacientes con cáncer de mama en cuyo tumor se sobreexpresaba

31 Introducción el receptor del factor de crecimiento epidérmico HER2. Este resultado se ha explicado como una consecuencia de la inhibición de la proliferación tumoral, a través de un mecanismo de citotoxicidad dependiente de los anticuerpos utilizados que ha supuesto un cambio en la historia natural de uno de los tipos de cáncer de mama de peor pronóstico [95-97]. Este hallazgo ha supuesto un importante avance en el tratamiento del cáncer de mama al incorporar a la práctica clínica diaria las determinaciones moleculares por medio de métodos como la inmunohistoquímica (IHQ), técnicas de hibridación in situ (FISH) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permiten conocer marcadores moleculares que las células tumorales expresan y que representan potenciales dianas terapéuticas contra las que es posible diseñar fármacos biológicos que asociados a los tratamientos citotóxicos clásicos consiguen alcanzar una mejor tasa de respuestas tanto en supervivencia como en intervalo libre de enfermedad [98]. Desde entonces hasta nuestros días nuevas dianas moleculares han sido objeto de estudio dando como resultado el desarrollo de nuevos agentes biológicos y pequeñas moléculas que dirigiéndose contra los receptores de membrana que expresa la célula tumoral, consiguen bloquear la unión del ligando al receptor y con ello bloquean las distintas cascadas de transducción de señales que la célula tumoral pone en marcha, permitiéndonos así impedir la transcripción de genes implicados en supervivencia, proliferación celular y angiogénesis tumoral. Muestra de ello son fármacos como Lapatinib un anticuerpo monoclonal contra los dominios tirosín quinasa de HER1 y HER2 que ha demostrado ser eficaz en pacientes con cáncer de mama metastásico que sobreexpresan HER2 y no responden a Trastuzumab [99], o fármacos antiangiogénicos como bevacizumab un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento derivado del endotelio vascular VEGFR [100]. Algunos de estos factores tienen un doble papel pronóstico y predictivo, como es el caso del HER2/neu cuya amplificación se ha asociado por un lado a un peor pronóstico, a la resistencia al Tamoxifeno y una mayor sensibilidad a dosis altas de Antraciclinas y, por otro lado, a un factor predictivo de respuesta al Trastuzumab especialmente cuando se combina con quimioterapia

32 Introducción Paralelamente y gracias al desarrollo de tecnologías con microarrays de ADN se han efectuado estudios que, analizando el perfil génico del tumor, consiguen determinar aquellos genes que se correlacionan con el pronóstico y la respuesta terapéutica. Esto ha favorecido la creación de una nueva clasificación pronóstica del cáncer de mama de acuerdo con el llamado fenotipo molecular. En esta clasificación se han descrito 5 tipos de cáncer de mama en función a la expresión molecular de determinados receptores de membrana; Luminal A, Luminal B, Basal Like (triple negativo) y subtipo Her2+ [101]. Estos perfiles génicos están siendo utilizados en la actualidad como factores pronóstico y también como factores predictivos de respuesta a la quimioterapia y al tratamiento hormonal. Por tanto cada vez más nuevos factores pronósticos y predictivos de respuesta al tratamiento oncológico se van añadiendo a los establecidos por las recomendaciones consenso del National Institutes of Health Consensus Development Conference Statementun 2000 (NIH) [102] y de la conferencia consenso de St. Gallen 2009 [103]. Estos es consecuencia del mayor conocimiento y de la caracterización de las múltiples vías de transducción de señales y de las cascadas de señalización intracelular implicadas en la carcinogénesis que a su vez ha facilitado la identificación de nuevas dianas terapéuticas sobre las que desarrollar nuevos fármacos para aplicar al tratamiento del cáncer de mama. No obstante no todos los factores anteriormente comentados están validados en la actualidad como factores pronósticos a partir de los cuales poder estimar el riesgo de recidiva y mortalidad que tiene una paciente diagnosticada de cáncer de mama ni tampoco todos ellos son reconocidos como factores predictivos de respuesta al tratamiento oncológico. Por tanto y atendiendo a los factores pronósticos y predictivos de respuesta actualmente validados se pueden establecer tres 3 categorías de elementos que nos ayudan en la actividad clínica a planificar un tratamiento oncológico adecuado [102]

33 Introducción Factores dependientes del paciente. Edad El cáncer de mama se suele presentar en mujeres a partir de los 50 años de edad, siendo poco frecuente su diagnóstico en mujeres de menos de 35 años [104]. Son muchos los estudios epidemiológicos que relacionan este dato con un factor pronóstico adverso al correlacionarlo con una menor supervivencia global y una mayor tasa de recidiva tumoral en las pacientes jóvenes respecto a las mujeres con edad de presentación mayor a 35 años [105]. En este sentido y aunque no está suficientemente aclarada la relación entre edad de presentación menor a 35 años y mal pronóstico de cáncer de mama, algunos investigadores describen como posibles causas que el cáncer de mama que se presenta en mujeres más jóvenes, tienen una características biológicas comunes caracterizadas por tener un mayor grado de indiferenciación histológica, una fracción de proliferación celular más elevada, mayor frecuencia de invasión vascular así como mayor frecuencia de afectación ganglionar y una menor expresión de receptores hormonales de estrógenos y progesterona en comparación con los casos de cáncer de mama que se presentan en mujeres de mayor edad [34]. Todos ellos factores que le confieren mayor agresividad tumoral [106] Factores dependientes de las características histológicas del tumor a) Estadio ganglionar (N): El grado de afectación ganglionar en las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama con independencia del área ganglionar afecta (axilar, supraclavicular etc.) así como del número de ganglios infiltrados ( 4 vs <4) [107], se ha demostrado en numerosos estudios que representa el factor pronóstico más importante para predecir tanto la supervivencia global (SG) como la supervivencia libre de enfermedad (SLE) [ ]. Aquellas pacientes con afectación ganglionar tendrán un pronóstico más desfavorable que aquellas otras pacientes en donde no se haya producido tal infiltración. De hecho se estima que el 70% de las pacientes con ganglios axilares positivos recidivarán a los l0 años mientras que, en los pacientes con ganglios axilares negativos, el porcentaje de recidivas se reduce a un 20-30% [111]

34 Introducción Para establecer con rigurosidad cuál es el grado de afectación axilar en estas pacientes, se recomienda que sea examinado un número suficiente de ganglios. Los estudios dirigidos a dilucidar esta cuestión indican que se deben obtener al menos 10 ganglios de la axila para definir el estado ganglionar, especialmente si este resulta negativo [ ]. Hoy día gracias a los avances quirúrgicos y técnicos, se dispone de una técnica alternativa a la clásica disección axilar que se realizaba de forma sistemática en la cirugía oncológica del cáncer de mama que es la biopsia del ganglio centinela. Esta técnica actualmente ha reemplazado al vaciamiento ganglionar axilar como método de elección para el estadiaje ganglionar de las pacientes afectas de cáncer de mama en prácticamente la totalidad de los centros hospitalarios [115]. En los últimos años numerosos estudios realizados para analizar si el estudio del ganglio centinela podría reemplazar a la clásica estadificación por disección ganglionar, han concluido que el procedimiento es seguro, factible y con menor morbilidad que la técnica clásica de la disección ganglionar axilar [116]. Así estudios recientes en este campo como los realizados por Turner ó Weaver afirman que aislar un ganglio centinela negativo predice de forma significativa la ausencia de afectación del resto de ganglios por ser este el ganglio que con mayor probabilidad será positivo en el caso de existir afectación axilar, con una sensibilidad estimada en el 100% y una tasa de recurrencias del 0.3% [117]. Sin embargo aún quedan algunos aspectos controvertidos por analizar entre ellos es necesario saber cuál es el significado pronóstico de las micrometástasis aisladas en el análisis por inmunohistoquímica del ganglio centinela y cuál es su repercusión pronóstica [118]. Al analizar los ganglios extirpados en una disección ganglionar podemos hallar la presencia de focos microscópicos metastásicos que según su tamaño se definen como pn1mi cuando su tamaño está comprendido entre 2 mm y 0.2 mm y pn0 (i+) cuando éste es menor de 0.2 mm [115, 119]. Estos pequeños focos de células tumorales se han descrito que pueden detectarse entre el 9 y el 13% de los casos con "axila negativa" con el análisis por técnicas de hematoxilina-eosina, y entre un

35 Introducción 15% a un 20% de los casos con técnicas inmunohistoquímica [120]. Sin embargo, actualmente siguen existiendo controversias acerca del valor pronóstico de estos focos microscópicos metastásicos así como de la actitud terapéutica a seguir, si bien se ha observado que su presencia se asocia de forma significativa a una peor supervivencia cuando se compara con pacientes que no presentan afectación ganglionar [110, 121]. En estudios realizados en Europa se considera de importancia pronóstica el identificar la presencia de estos microscópicos focos metastásicos axilares; a esta característica se le atribuye un mayor riesgo relativo (RR= 1.7) de desarrollar metástasis a distancia en comparación con las pacientes sin metástasis ganglionares ocultas [122]. Así mismo en otras investigaciones realizadas se ha descrito una correlación significativa entre la presencia de micrometástasis en el ganglio centinela con tumores de tamaño superior a 2 cm (T2-T3), grado tumoral GIII y con invasión vascular como factores independientes para predecir la afectación del resto de ganglios [123]. Por ello hay autores que aconsejan cuando se detectan micrometástasis en el análisis del ganglio centinela, realizar una disección axilar reglada aunque este recomendación sigue siendo motivo de controversia [124]. Por lo tanto son necesarios nuevos estudios que investiguen factores moleculares que asociados a los factores clínico-patológicos conocidos, ayuden a identificar un subconjunto de pacientes en el grupo de pacientes con ganglio centinela negativo, con alto riesgo de afectación ganglionar microscópica y así omitir la disección axilar con la consecuente menor morbilidad en determinados subgrupos de pacientes [125]. b) Tamaño tumoral (T): Es uno de los factores pronósticos más importantes junto con la afectación ganglionar; en efecto el valor de T es uno de los tres criterios utilizados para el estadiaje TNM (T: tamaño tumoral, N: número de ganglios afectos y M: presencia de metástasis)

36 Introducción El tamaño tumoral se correlaciona con la presencia y el número de ganglios linfáticos afectos, siendo además un factor pronóstico independiente que influye sobre el riesgo de desarrollar metástasis a distancia en proporción directa al tamaño del tumor [126]. Así en pacientes con tumores menores a 1 cm la supervivencia global estimada a los 5 años es del 99 % comparado con el 89 % para tumores entre 1-3 cm y el 86 % para tumores entre 3-5 cm. Autores como Rosen han estudiado la relación entre el tamaño tumoral y el intervalo libre de enfermedad a los 20 años, encontrando una asociación significativa, con la supervivencia sin recurrencia a los 20 años del 88 % para tumores de 1 cm, del 72 % para tumores 1.1 cm a 3 cm, y el 59 % para tumores entre 3.1 cm y 5 cm [127]. Se acepta de manera generalizada que las pacientes en las que el tumor es de 2 cm o menos de diámetro máximo, tienen un pronóstico y una supervivencia significativamente mejor comparada con las pacientes con tumores de mayor tamaño [128, 129]. Así mismo en pacientes con tumores de pequeño tamaño se ha analizado el papel del vaciamiento axilar con la intención de predecir en qué casos se podrían evitar realizar disecciones axilares, observándose que tumores de tamaño < 0,5cm no suelen presentar metástasis axilares en las series estudiadas, de manera que son varios los autores que afirman que en estos casos, y en aquellos correspondientes a tumores de bajo grado nuclear y de 0,6 a 1cm, podría ser innecesario el vaciamiento axilar [130]. Por todo ello, la indicación precisa del tamaño tumoral debe de ser considerada obligatoria en los informes anatomo-patológicos de patología quirúrgica mamaria. c) Grado histológico (G): El grado histológico del tumor es otro de los factores pronóstico utilizados en la clínica como criterio para considerar la indicación de tratamiento adyuvante en las pacientes con cáncer de mama. Su importancia como factor pronóstico independiente del tamaño tumoral y de la afectación ganglionar, ha sido evaluada en números estudios tanto por la mayor frecuencia de aparición de metástasis a distancia como por la menor supervivencia global encontrada en aquellas pacientes que presentan tumores con mayor grado

37 Introducción histológico [131, 132]. Sin embargo y a pesar de requerir para su estudio de una técnica sencilla como es la técnica de hematoxilina-eosina, no está exenta de problemas derivados por un lado de los distintos sistemas de clasificación del grado histológico que han ido apareciendo conforme nuevas revisiones y criterios se han ido evaluando, así como de la subjetividad del observador a la hora de evaluar los resultados [133]. Desde el primer sistema de clasificación histológica establecido por Bloom y col. en 1950 [134, 135] que consideraba que el grado de formación tubular, regularidad en el tamaño, forma y carácter de tinción del núcleo, y la hipercromasia nuclear junto con la actividad mitótica, eran las características a considerar hasta nuestros días, han ido apareciendo sucesivas clasificaciones histológicas, la última de ellas la propuesta por Helpap en 1989 [136] que incluye hallazgos nucleolares tales como su frecuencia, tamaño, número y localización. De todas ellas una de las clasificaciones más usadas es la de Scarff-Bloom- Richardson [137] que incluye el análisis del índice mitótico, el grado de diferenciación y el pleomorfismo celular, asignando una puntuación de 1 a 3 a cada variable siendo la suma de estas la que definiría el grado histológico en; Grado 1 (Bien diferenciados): tumores con puntación final entre 3 a 5 puntos. Grado 2 (Moderadamente diferenciados): tumores con puntación final comprendida entre 6 a 7 puntos. Grado 3 (Pobremente diferenciados): tumores con puntación final de 8 a 9 puntos. d) Invasión linfovascular: La invasión linfovascular actualmente reconocida como factor pronóstico de riesgo intermedio a partir del consenso de Saint Gallen celebrado en 2007 [138], se sabe que representa uno de los eventos más tempranos que se ponen en marcha en la cascada de la progresión del tumor primario hacia los tejidos situados en su vecindad (invasión locoregional) como a distancia (metástasis) [139]. La capacidad que tiene el tumor primario para

38 Introducción desarrollar nuevos vasos sanguíneos a través de los ya existentes e infiltrarlos descrita inicialmente por Folkman en 1991, facilita que las células tumorales penetren a través de ellos bien en los vasos sanguíneos o en los vasos linfáticos que hay alrededor del tumor primario permitiendo que pequeños émbolos de células tumorales pasen al torrente circulatorio y/o linfático y den lugar al desarrollo de implantes metastásicos [100]. En diferentes estudios la identificación de este evento de invasión linfovascular en el tumor primario ha sido relacionada como un factor pronóstico independiente tanto para el riesgo de recidiva como para el riesgo de muerte por cáncer de mama [140]. De igual forma se ha relacionado con una mayor frecuencia de afectación ganglionar así como una mayor probabilidad de desarrollar metástasis a distancia y menor supervivencia global con independencia de la afectación ganglionar [141]. Sin embargo y a pesar de su importancia pronóstica, su determinación por la técnica de hematoxilina-eosina no está libre de dificultades especialmente relacionadas con la variabilidad inter-observador que existe en la identificación de los pequeños racimos de células tumorales que se pueden aislar entre el espacio vascular y las células endoteliales. Por ello nuevos estudios actualmente en curso están evaluando el empleo de técnicas de inmunotinción para nuevos marcadores antigénicos específicos de endotelio y vasos linfáticos, como D2-40 que hagan posible diferenciar entre invasión vascular y linfática y ayuden a unificar y estandarizar criterios de interpretación y análisis [142]. e) Tipo Histológico: El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea constituida por múltiples entidades histopatológicas asociadas cada una de ellas con distintos factores biológicos y clínicos que le confieren significados pronósticos diferentes [143]. La Organización Mundial de la Salud ha reconocido hasta la fecha un total de 17 entidades histológicas cada una de ellas con características moleculares distintas que le otorgan un comportamiento biológico y pronóstico variable de acuerdo con el tipo histológico [101, 144]. No obstante para simplificar y llevar a la práctica clínica esta clasificación, los parámetros que en ella se incluyen se agrupan en 4 categorías que ayudan a precisar, e informar, del pronóstico clínico en función de los datos histológicos [145];

39 Introducción Pronóstico Excelente: Supervivencia a 10 años > 80%. Incluye a los subtipos: Tubular, Cribiforme, Mucinoso, Carcinoma Túbulo-lobulillar y Adenoide Quístico. Buen Pronóstico: Supervivencia a 10 años 60-80%. Comprende a los subtipos: Tubular Mixto, Ductal Mixto y Lobulillar Clásico. Pronóstico Intermedio: Supervivencia a 10 años 60-50%. Constituído por: Lobulillar Mixto, Medular y Medular Atípico. Mal Pronóstico: Supervivencia a 10 años > 50%. Incluye; Ductal Infiltrante, Ductal Mixto, Carcinoma Lobulillar Sólido, Micropapilar Infiltrante y Carcinoma Inflamatorio Factores dependientes de las características biológicas y moleculares del tumor a) Expresión receptores hormonales (RH): La determinación de receptores estrogénicos (RE) y receptores de progesterona (RP) por técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) en el estudio anatomopatológico del cáncer de mama, se ha convertido en la actualidad en una práctica obligada por la repercusión tanto pronóstica como predictiva de respuesta que tiene a la administración de tratamientos hormonales [146, 147]. Aproximadamente entre un 55% a un 65% de los carcinomas primarios de mama diagnosticados en la actualidad y entre un 45% a un 55% de las metástasis derivadas del tumor primario expresan receptores hormonales. Clínicamente este hallazgo se ha correlacionado con un moderado factor pronóstico a la vez que un importante factor predictivo de respuesta al tratamiento hormonal tanto en adyuvancia como en pacientes en estadio metastásico por ayudar a predecir la probabilidad de recidiva y supervivencia de estas pacientes [148]. De hecho han sido muchos los estudios que han relacionado el estado de expresión de receptores estrogénicos en el tumor como factor pronóstico al asociar su falta de expresión con tumores de mayor grado histológico, mayor

40 Introducción riesgo de recidiva, menor supervivencia global y resistencia a terapia hormonal [149], aunque existen algunas excepciones como ocurre con el carcinoma adenoide quístico [150] y el carcinoma medular que a pesar de ser RH (-) tienen buen pronóstico[151]. En relación a este parámetro se acepta que aquellas pacientes con ausencia de expresión de RE (-) y/o RE-/RP- tienen un supervivencia a los 5 años entre un 8% a un 35% más baja que aquellas pacientes con tumores RE (+) [148, 152]. De igual forma y aunque algunos autores cuestionan el valor del RP [153] se ha descrito la importancia que tiene la expresión de RP como factor pronóstico ya que los datos extraídos de los estudios clínicos realizados sugieren que en aquellos pacientes que expresan RE+/RP- frente a los que expresan RE+/RP+ se observa una menor respuesta al tratamiento hormonal con fármacos como el Tamoxifeno describiéndose que sólo el 40% responden a dicho tratamiento [147]. Así mismo se cree que la expresión de sólo uno de ellos en comparación con la positividad para ambos receptores, se relaciona con tumores de mayor grado y mayor porcentaje de expresión de HER2, por lo que se consideran entidades clínicopatológicas distintas [154]. b) Expresión de Her-2/neu (erb-2). Oncogen cerb2: El oncogén HER2/neu es un oncogén localizado en el cromosoma 17q21 que codifica una proteína de membrana de 185 kd denominada p185, perteneciente a la familia de los receptores tirosín quinasa del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Consta de 4 miembros denominados HER1 (EGFR), HER2, HER3 y HER4 y la proteína que forma el receptor del factor de crecimiento epidérmico [155]. Posee un dominio extracelular de 650 aminoácidos con dos regiones ricas en cisteína, que se enlazan con el ligando, una región transmembrana y otro dominio intracelular de 580 amino ácidos con actividad de tirosín quinasa involucrada en la transducción de señales relacionadas con procesos de proliferación y diferenciación celular [156]. Cuando el dominio extracelular de HER2 es ocupado por su ligando se produce una dimerización del mismo que permite que se una a otro miembro de la familia HER formando un complejo homo/ heterodímero que posibilita su fosforilación y

41 Introducción puesta en marcha de la cascada de transducción de señales responsable de un determinado efecto biológico [157]. En el cáncer de mama esta proteína se ha observado que se encuentra amplificada en alrededor del 20-30% de los casos, estableciéndose tras los resultados obtenidos en múltiples estudios como un factor pronóstico independiente tanto para la supervivencia global como para el intervalo libre de enfermedad en pacientes con cáncer de mama, especialmente si presentan ganglios linfáticos positivos [158]. La sobreexpresión de HER2 está relacionada con mayor frecuencia con tumores RE (-) [159], con pobre grado de diferenciación histológica y con una mayor proporción de pacientes con afectación axilar e invasión vascular, todo lo cual explica el menor intervalo libre de enfermedad y menor supervivencia global que caracterizan este grupo de pacientes [160]. También se ha descrito que la expresión de esta proteína se relaciona con la respuesta al tratamiento con quimioterapia y hormonoterapia [161], especialmente con la sensibilidad del tumor a tratamientos citotóxicos que contengan Antraciclinas y Taxanos así como con la respuesta a terapias dirigidas contra HER2; por otra parte los tumores que expresan esta macromolécula son menos sensibles a esquemas con Ciclofosfamida, Metotrexate y 5-Fluorouracilo, y muestran mayor resistencia al tratamiento con radioterapia y mayores niveles de expresión de VEGF [162]. c) Proteína P53 (p53): El gen p53 se encuentra localizado en el brazo corto del cromosoma 17 en la banda 17p. Es un gen tumor supresor que interviene en la reparación del ADN por lo que se le ha denominado "guardián del genoma" actuando como regulador negativo del crecimiento celular. Codifica una fosfoproteína nuclear de 393 aminoácidos, cuya expresión se induce cuando se ocasiona un daño en el ADN cualquiera que sea el mecanismo por el que tal daño se induce -substancias carcinogénicas, radiaciones u otros-; tras este proceso la proteína p53 que produce ocasiona la parada de la célula en fase G1 del ciclo celular, induce la reparación del ADN y estimula la apoptosis de la célula cuando no es posible la reparación del daño ocasionado al ADN. Por tanto alteraciones en

42 Introducción la función de p53 podrían dar lugar a que células que presentan alguna aberración génica, proliferen y adquieran el carácter de transmisibilidad del daño a sus descendientes dando como resultado el desarrollo del cáncer [163]. La mutación del gen p53 se ha descrito en el 20-50% de los cánceres de mama aumentando su frecuencia en aquellos pacientes con antecedentes familiares. Se asocia con un factor de mal pronóstico por causar la pérdida de la función supresora y permitir el crecimiento celular ilimitado. d) Ki-67 (mib 1): Es una proteína nuclear de 349kD que se aísla en aquellas células que se encuentran en fases activas del ciclo celular como son la fase G1, S, G2 y M, mientras que es imperceptible en aquellas células que se encuentran en fase G0 ó quiescentes [164]. Por tanto su marcaje permite la identificación de la proporción de células de un tumor que se encuentran en fase de proliferación celular. Es decir, a través de su determinación por citometría de flujo nos informa de cuál es la fracción de células de un tumor que se encuentran en división o que se están preparando para duplicar su ADN, y es fácil entender que su presencia sea un marcador de la actividad proliferativa celular [165]. Por esa razón se entiende su valor como factor pronóstico adverso de la enfermedad, puesto que a mayor proporción de Ki-67 aislado en una pieza tumoral, mayor índice mitótico y de proliferación celular tienen las células del tumor y por tanto se considera que la mayor agresividad y peor pronóstico se asocian con la presencia de este marcador en niveles elevados mientras que un pronóstico más favorable podría asignarse a los tumores que expresan Ki-67 en baja proporción [166]. También se sabe que la positividad de Ki-67 está relacionada con tumores mal diferenciados, con la presencia de invasión vascular y metástasis en los ganglios linfáticos mientras que es poco frecuente en tumores con receptores hormonales positivos [167]

43 Introducción e) Otros factores moleculares pendientes de validar. Perfil Génico La mama está formada por unidades funcionales denominadas unidad terminal ducto-lobular (UTDL), constituidas por dos grupos principales de células; las células epiteliales (luminales) y las células mioepiteliales (basales) yuxtapuestas a la membrana basal denominadas así porque expresan características tanto de células epiteliales como de músculo liso [168]. Las células luminales se caracterizan desde el punto de vista inmunohistoquímico (IHQ) por expresar citoqueratinas (CK) del epitelio simple como son CK7, CK8, CK18 y CK19, integrina α6 y moléculas de adhesión epitelial. En cambio las células basales se caracterizan por expresar una serie de marcadores propios como son las citoqueratinas 5 y 14, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), actina del musculo liso, S-100, p63 y sigma entre otros y no expresar las CK que expresan las células luminales como tampoco expresan receptor de estrógenos ni receptor de progesterona [ ]. Recientemente diversos trabajos publicados en la literatura han puesto de manifiesto como los cánceres de mama asociados a expresión de marcadores tipo basal se relacionan con peores resultados en términos de supervivencia y recaídas más precoces frente a aquellos que expresaban marcadores tipo luminal [171, 172]. Atendiendo a estos hallazgos se ha desarrollado una clasificación molecular del cáncer de mama que ayuda a predecir a partir de características moleculares del tumor el pronóstico y sensibilidad a los tratamientos administrados y por lo tanto contribuye a seleccionar tratamientos más personalizados. Esta clasificación distingue 4 subtipos de cáncer de mama que se caracterizan por persistir después de los tratamientos administrados y correlacionarse con las características moleculares entre el tumor primario y las metástasis que puedan aparecer secundariamente: [173, 174]:

44 Introducción Subtipo Basal (Triple negativo): Representan el 15-20% de los cánceres de mama [175]. Se caracterizan por ser tumores de alto grado (G III), no expresar receptores hormonales (RE y RP negativos) ni sobreexpresar HER2, presentar marcadores mioepiteliales en la mayoría de los casos [176] y sobreexpresar EGFR (HER1) y p53 [177, 178]. Se asocian a resistencia a tratamientos contra dianas HER2 como Trastuzumab así como a terapia hormonal, tanto con Tamoxifeno como con inhibidores de la Aromatasa, por lo que son tumores donde la quimioterapia representa el pilar del tratamiento sistémico. Se dice que hasta el 29% de los tumores RE (-) expresan receptores tipo mioepitelial [179, 180]. Los cánceres de mama relacionados con mutaciones en BRCA suelen tener este fenotipo molecular [181]. Subtipo Luminal A: Junto con el subtipo Luminal B representan el subgrupo de mejor pronóstico. Se caracteriza por expresar RE y RP fuertemente positivos y ser HER2 negativos [182], por lo que son muy sensibles a tratamientos hormonales. Expresan marcadores de células epiteliales fundamentalmente CK 7,8, 18, y 19 [183]. Subtipo Luminal B: Se caracterizan por una expresión moderada de RE y una expresión baja o negativa de RP. Pueden sobreexpresar HER2 y muestran marcadores epiteliales. Se asocian a peor pronóstico [184, 185]. Subtipo HER2: Junto con el subtipo triple negativo se asocia a peor pronóstico. Desde el punto de vista inmunohistoquímico se caracteriza por sobreexpresar HER2 por lo que son tumores sensibles a terapia contra dianas HER y ser negativo para la expresión de RE y RP [185]

45 Introducción 1.4. PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EMPLEADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE CÁNCER DE MAMA. LIMITACIONES ACTUALES EN EL DIAGNÓSTICO PRECOZ La detección en etapas precoces del cáncer de mama sigue siendo unos de los principales objetivos a alcanzar para conseguir mayores tasas de supervivencia y de curación en las pacientes diagnosticadas de esta patología. Actualmente conocemos que existen lesiones precursoras de cáncer que diagnosticadas precozmente y tratadas de forma adecuada en etapas donde la enfermedad aún no es invasiva son potencialmente curables. De igual forma se sabe que cuando la enfermedad se hace invasiva y es diagnosticada en estadios iniciales la tasa de supervivencia es mayor que cuando el cáncer se detecta en estadios más avanzados. En la actualidad gracias a las campañas de screening y a su mayor y mejor difusión poblacional, junto con los avances producidos en técnicas de diagnóstico por imagen así como al empleo de tratamientos oncológicos más eficaces, se ha conseguido que alrededor de 2 millones de mujeres hayan sobrevivido tras el tratamiento de un cáncer de mama [186, 187]. No cabe duda que parte de ese incremento en la curación está en relación con la detección precoz de tumores de mama en mujeres asintomáticas que consiguen llegar a un diagnóstico más temprano y por tanto a la aplicación de tratamientos en estadios más incipientes lo que hace que la enfermedad sea potencialmente curable. No obstante y paralelamente a los métodos por imagen que clásicamente se utilizan en las campañas de screening, cada vez son más los estudios en el campo de la Proteómica y Genómica que están analizando el perfil molecular y genético a partir del tejido tumoral y/o de la sangre de los sujetos diagnosticados de cáncer para predecir poder ofrecer una aproximación al pronóstico de la enfermedad [188] y por tanto administrar tratamientos más personalizados, como son el Kit Oncotype DX [189] y el estudio Mammaprint [190]. Sin embargo la aplicación de estos test genéticos a la práctica clínica aún dista de ser utilizados de forma rutinaria

46 Introducción Por ello todavía hoy día siguen siendo los métodos de diagnóstico por imagen y exploración física, con sus limitaciones, los medios actualmente disponibles y utilizados en clínica para llegar a un diagnóstico precoz. Estos métodos principalmente son; la mamografía y la exploración física realizada por profesionales expertos, seguidos de ecografía, autoexploración y resonancia nuclear magnética (RNM) Autoexploración En décadas anteriores la autoexploración mamaria constituía uno de los métodos por el que se diagnosticaban muchos de los casos de cáncer de mama. Hoy día esta situación ha cambiado de forma significativa gracias a la divulgación de nuevas técnicas de imagen como la mamografía, la resonancia magnética (RM) y la ecografía mamaria que se han llevado a cabo a través de las campañas de cribado poblacional y que han conseguido detectar lesiones de menor tamaño con la consiguiente repercusión en un mejor pronóstico y supervivencia del cáncer de mama [ ]. A pesar de ello la autoexploración sigue teniendo su papel en el algoritmo de cribado, de diagnóstico precoz y de recidiva, por ser una técnica de fácil uso, no cruenta, asequible a toda la población y que no requiere de ningún tipo de instrumentación compleja para su realización. La autoexploración mamaria permite a la mujer familiarizarse con su propia anatomía pudiendo apreciar cambios de textura, tamaño o apariencia de la mama como un signo de alarma a partir del cual consultar al médico quien determinará la conveniencia, o no, de realizar otras pruebas complementarias. Incluso se ha insistido que mediante este procedimiento, en ocasiones, se han podido detectar tumores de tamaño inferior a los que puede percibir el clínico. Sin embargo y a pesar de existir campañas educativas y gran divulgación para conseguir su aplicación, son muchas las mujeres que no la realizan de forma rutinaria por lo que junto con la existencia de mejores técnicas diagnósticas y la disminución significativa en el tamaño de presentación al diagnóstico de los tumores de mama, ha hecho que su uso quede desplazado por las nuevas técnicas de imagen [194]

47 Introducción No obstante es necesario enfatizar que la autoexploración exclusiva no ha demostrado ser un método eficaz para disminuir la mortalidad ni mejorar la detección precoz del cáncer de mama [195, 196]. De hecho en recientes revisiones se cuestiona su recomendación por ocasionar un aumento importante del número de biopsias sin que de ello se derive un beneficio en supervivencia en el cáncer de mama [197, 198]. Sí ocasiona en cambio, un incremento en el diagnóstico de patología benigna y por tanto un mayor número de biopsias sin que con ello podamos predecir si con posterioridad va a desarrollarse o no un proceso tumoral [195, 199]. Aún así donde parece que la autoexploración mamaria tiene un papel más importante es en el subgrupo de mujeres con historia familiar de cáncer de mama hereditario especialmente las portadoras de la mutación en BRCA1 ya que con frecuencia se acompañan de tumores pobremente diferenciados con mayor velocidad de crecimiento y por lo tanto más fácilmente detectables por este procedimiento [200] Exploración mamaria por un clínico experto Es junto con la mamografía una de las técnicas empleadas en la consulta diaria para el diagnóstico precoz así como para el seguimiento postratamiento de las paciente diagnosticadas de cáncer de mama. Cuando a ésta exploración clínica se le une la mamografía se consigue detectar un mayor número de ganglios clínicamente negativos y tumores de menor tamaño que si es realizada de forma exclusiva [201]. Por otra parte en pacientes más jóvenes donde la mamografía tiene menor sensibilidad y no es realizada de forma habitual, la exploración física de la mama adquiere un parel importante en la detección precoz de esta patología [202]. Sin embargo no se ha podido demostrar que de su aplicación de derive un descenso en los índices de mortalidad por cáncer de mama [203, 204]

48 Introducción Ecografía Mamaria El uso de ultrasonidos en el campo de la Senología fue descrito inicialmente por Kikuchi. K. y col. en el año 1957 [205]. Desde entonces hasta nuestros días, el empleo de la ultrasonografía ha ido adquiriendo progresivamente un papel cada vez más relevante por su amplia aplicación tanto como técnica de screening como en el diagnóstico de la patología tumoral de la mama. Esta técnica está exenta de efectos secundarios y que en muchos casos proporciona al clínico información que puede sugerir si se trata de una lesión de características benignas o malignas. Incluso en aquellos casos que es de difícil interpretación, puede ser utilizada como guía para la realización de una punción aspiración o biopsia [206]. Una de las principales indicaciones de uso es en el screening de las mujeres de edad comprendida entre los 30 y 39 años, en las cuales por la mayor densidad radiológica del tejido mamario tiene menor resolución [207, 208]. Es en este rango de edad donde la ecografía ha demostrado en estudios retrospectivos tener mayor sensibilidad que la mamografía en el diagnóstico de carcinoma invasivo con un 99% frente al 85% respectivamente. Sin embargo cuando se trata de detectar la presencia de microcalcificaciones características de ciertos tipos de lesiones mamarias malignas la ventaja de la mamografía es indudable frente a la ecografía con una sensibilidad aproximada del 22% [209]. A pesar de lo expuesto uno de los principales inconvenientes que tiene la ecografía es que su sensibilidad al diagnóstico disminuye cuando se trata de lesiones no palpables [210], que posee una baja especificidad y que hasta ahora no hay estudios que demuestren que mediante su uso como test de despistaje tumoral se haya conseguido disminuir la mortalidad por cáncer de mama [206, 211] Mamografía Son muchos los estudios randomizados que han analizado y evaluado el papel que tiene el empleo de la mamografía como técnica diagnóstica en el screening poblacional del cáncer de mama. De ellos se ha sugerido que de su uso se puede derivar una reducción significativa de la mortalidad por esta enfermedad [212]. Y

49 Introducción hoy día se acepta que aplicada en programas de cribado poblacional sistemáticos la mamografía ha supuesto un importante avance al conseguir disminuir los índices de mortalidad por cáncer siendo este beneficio máximo en mujeres de edad comprendida entre 60 y 69 años con un beneficio en términos de mortalidad acumulada que sigue existiendo incluso después de 10 años [213]. La mamografía es una exploración no invasiva que utiliza radiación ionizante (rayos X) de baja energía para detectar anomalías estructurales en la mama. Actualmente se la considerada como una de las técnicas disponibles hoy día más importantes para el diagnóstico precoz del cáncer de mama ya puede detectar alteraciones en el parénquima mamario sospechosas de malignidad antes de que sean evidentes en la exploración física. Presenta una sensibilidad en general de un 75%, encontrándose comprendida entre un 54% a un 58% para mujeres menores de 40 años y entre un 80% a un 94% para aquellas mujeres de más de 65 años [204]. Los programas de screening poblacional incluyen actualmente la mamografía como una de las pruebas más importantes a realizar recomendando su realización de forma bianual a partir de los 50 de edad. Son varios los metaanálisis que han comparado las diferencias en cuanto a la mortalidad por cáncer de mama tras realizar campañas de cribado que incluyesen la exploración mamográfica de forma anual frente a realizarla cada 2 años. De esos estudios se sabe que el beneficio en supervivencia en términos absolutos estaba en torno al 0.6% en 5 años y 1.2% en 10 años para aquellas pacientes que se realizaban una mamografía cada año en el screening lo que no justifica la frecuencia anual en su empleo [ ]. Actualmente una nueva modalidad de mamografía, la mamografía digital DMIST (Digital Mammographic Imaging Screening Trial) parece que si bien tiene una sensibilidad similar a la mamografía convencional, parece que es más exacta en mujeres menores de 50 años y en perimenopáusicas, con mamas radiológicamente más densas [217]

50 Introducción Sin embargo, por sí sola la mamografía no confirma el diagnóstico de malignidad, siendo necesaria la realización de una prueba invasiva como es la biopsia para alcanzar la confirmación histopatológica Resonancia Nuclear Magnética (RM) El screening de cáncer de mama por mamografía ha conseguido disminuir la mortalidad de la misma entre un 25 a un 30% en la población general como lo han puesto de manifiesto numerosos estudios. Sin embargo existe un subgrupo de pacientes de alto riesgo, especialmente si ocurre a edades jóvenes en donde el diagnóstico precoz por mamografía no tiene una adecuada sensibilidad. Incluso en aquellos casos de mujeres de alto riesgo donde la mamografía consigue detectar la presencia de un tumor, en muchas ocasiones los detecta en un estadio subóptimo [218]. La resonancia nuclear magnética (RM) es una técnica diagnóstica de gran utilidad en la detección y la caracterización de la patología mamaria [ ]. Inicialmente se empezó a realizar sin emplear medios de contraste hace más de 30 años [222]; posteriormente y como resultado de los estudios realizados se ha indicado la importancia de emplear contraste como el gadolinio para conseguir una mayor resolución y calidad de imagen y así poder discriminar mejor entre lesiones benignas y malignas de la mama. Presenta algunas ventajas sobre otras técnicas diagnósticas empleadas en el screening del cáncer de mama. Entre ellas su alta sensibilidad de alrededor del % frente al 13-59% de la mamografía y al 13-65% de la ecografía para detectar tumores de pequeño tamaño [223]. Sin embargo no está exenta de algunas desventajas, entre las que destaca su moderada especificidad para diferenciar entre lesiones benignas de aquellas que son de carácter maligno obteniéndose alrededor de un 5% falsos positivos que requieren de la realización de nuevas pruebas como la biopsia, así como su alto coste, largo tiempo de examen y una menor disponibilidad de uso comparada con la mamografía y ultrasonido [224]

51 Introducción Estos resultados propiciaron la puesta en marcha de 11 estudios prospectivos que comparaban la adicción de la RM anual a la mamografía en los programas de detección precoz del cáncer de mama. El resultado que se obtuvo fue un incremento en la sensibilidad de la mamografía en cuanto a la detección precoz superior al 90% (más del doble que la mamografía sola). Aunque los datos de supervivencia no estén aún disponibles, la distribución por estadios de los tumores diagnosticados predice una reducción significativa del índice de mortalidad de cáncer de mama comparado con la obtenida al realizar sólo mamografía [218]. Por todo ello actualmente la recomendación de realización de una RM de mama en las guías de práctica clínica son fundamentalmente en aquellas mujeres de alto riesgo por ser portadoras de una mutación genética en BRCA relacionada con el cáncer de mama hereditario [ ], en aquellas otras en donde no se ha descrito esta mutación pero si tienen antecedentes de primer grado portadores de la mutación y por lo tanto también tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama, en aquellas mujeres que fueron sometidas a irradiación torácica entre los 10 a 30 años de edad y en las que su riesgo estimado de desarrollar cáncer de mama al aplicarle un modelo estadístico de riesgo (ej. BRCAPRO) se encuentra entre el 20-25% [228]. Sin embargo todavía hoy no se considera que existan suficientes datos para recomendar su uso en mujeres con historia familiar de cáncer de mama, con mamas densas mamográficamente, o con una biopsia previa de alto riesgo de hiperplasia ductal o lobulillar atípica o de carcinoma lobular in situ [229, 230]. También se recomienda en la revaluación de la respuesta del tratamiento neoadyuvante y en pacientes que debutan con metástasis axilares de origen desconocido [229]. Sin embargo hasta el momento no hay estudios sobre el impacto protector que tiene la RM en términos de supervivencia [231]. Por todo ello se debe seguir en la búsqueda de nuevos métodos de screening que puedan optimizar los resultados obtenidos en la detección precoz del cáncer de mama bien asociando técnicas como ecografía y mamografía o quizás

52 Introducción incorporando determinaciones moleculares a las clásicas técnicas de imagen conocidas ALTERACIONES EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER El cáncer se produce como consecuencia de la pérdida de regulación del crecimiento celular normal dando lugar a un clon celular con capacidad para crecer de forma desorganizada e independiente de los mecanismos de regulación que en condiciones fisiológicas rigen el correcto funcionamiento celular normal. Esta cadena de eventos hace que la célula vaya adquiriendo progresivamente capacidad para diseminar, invadir y dañar tejidos y órganos situados a distancia del lugar donde se originó inicialmente el tumor produciendo metástasis. En tejidos normales y en condiciones fisiológicas, existe un riguroso y complejo control del crecimiento y la diferenciación celular perfectamente regulado existiendo un equilibrio entre los factores que estimulan la proliferación y diferenciación celular, de aquellos que estimulan la muerte celular programada o apoptosis. Cuando este equilibrio se altera a favor de los procesos de proliferación y supervivencia celular, los mecanismos de control que regulan la multiplicación y la muerte celular dejan de actuar correctamente, iniciándose un proceso de crecimiento y multiplicación celular anárquico carente de control y orden, que puede derivar en el desarrollo de un proceso tumoral. La expresión de la información genética a nivel celular que va a determinar el fenotipo y diferenciación de un individuo va a estar sujeta a múltiples acontecimientos a nivel molecular que van a influir en la expresión de proteínas funcionales y en su funcionamiento. A lo largo de la vida, las células pueden ir acumulando daños en el ADN como consecuencia de deleciones, translaciones, mutaciones derivadas entre otras causas de la exposición a agentes químicos, radiaciones y virus, que si bien en la mayoría de las ocasiones no tienen repercusiones futuras, otras en cambio producen alteraciones en la maquinaria genética que otorgan a la célula propiedades conductuales y de funcionamiento como la capacidad de reproducirse de forma indefinida, ser indiferentes a las

53 Introducción señales que regulan el crecimiento celular normal tanto factores positivos como factores inhibitorios, evasión de la muerte celular programada y desarrollo de capacidad angiogénica lo que otorga a la célula tumoral y a su progenie la capacidad para invadir y producir metástasis así como ventajas en supervivencia sobre las células normales [232]. Durante décadas se ha cuestionado si la iniciación y progresión del cáncer, se debía sólo a eventos genéticos. Actualmente se considera que el proceso de carcinogénesis es el resultado de no sólo cambios en la secuencia de nucleótidos de la cadena del ADN sino que también procesos epigenéticos (modifican la función de un gen, sin modificar la secuencia de nucleótidos del ADN) van a intervenir a través de modificaciones de la función de un gen, en la proliferación celular pudiendo contribuir a la aparición de alteraciones moleculares responsables del desarrollo de las enfermedades neoplásicas [233]. El código genético consta de 2 tipos de información: genética y epigenética. La información contenida en el primero de los casos consiste en 64 tripletes de nucleótidos llamados codones, tal que cada codón codifica para uno de los 20 aminoácidos utilizados en la síntesis proteica. Esta información genética contenida en dichos genes puede sufrir alguna alteración como ocurre cuando se produce una mutación, lo que provoca un cambio permanente en la secuencia del ADN y consecuentemente la síntesis proteica anormal. Este hecho ocasiona dependiendo de qué proteína está alterada y cuál es la función que realizaba en condiciones fisiológicas, una alteración en la replicación, supervivencia celular etc. que puede propiciar la puesta en marcha de la cascada de la carcinogénesis. El otro tipo de información estaría representada por la epigenética donde residen las instrucciones de cómo, dónde y qué información genética debe ser utilizada en cada momento. Es decir aunque el genoma contiene toda la información necesaria para poner en marcha la transcripción del código genético, la expresión de esta información está regulada por la información epigenética fundamentalmente representada hasta lo que sabemos hoy día, por el patrón de

54 Introducción metilación de las secuencias CpG contenidas en la región promotora del gen en cuestión y la desacetilación de las histonas. Sin embargo entre ambos tipos de información existen algunas diferencias que son importantes conocer ya que nos podrían permitir su empleo en la investigación y en la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas en el cáncer. Así mientras que los eventos genéticos como las mutaciones producen cambios permanentes en la secuencia del ADN, la metilación de las regiones CpG de la región promotora de un gen sólo silencia su expresión proteica sin modificar la secuencia de nucleótidos. Esta característica unida a que hoy conocemos que es un proceso reversible hace que sea un interesante mecanismo a desarrollar para revertir el funcionamiento celular anormal de una célula tumoral. El término epigenética se refiere a un cambio heredable en el patrón de expresión génica, mediado por mecanismos diferentes a los eventos genéticos como son las translocaciones, mutaciones, deleciones etc., que pueden producir modificaciones secundarias de los componentes de la cromatina a través de cambios en el patrón de metilación del ADN y de la acetilación/desacetilación de las histonas. Ambos mecanismos pueden ocasionar cambios en la expresión proteica de la célula anulando sus funciones fisiológicas por silenciamiento transcripcional de un gen determinado sin cambiar con ello el código genético [234, 235]. Hoy se sabe que estas aberraciones epigenéticas, pueden estar implicadas en etapas tempranas de la carcinogénesis y que su estudio como biomarcador en la detección precoz del cáncer podría tener determinadas ventajas frente al estudio de alteraciones genéticas: i) en cáncer, la frecuencia de metilación aberrante en las islas CpG situadas en la región promotora de numerosos genes es mayor que la frecuencia con la que se encuentran alteraciones en el ADN ocasionadas por mutaciones así como que este perfil de metilación aberrante se puede cuantificar; ii) la metilación aberrante en las islas CpG puede ser detectada incluso cuando esta anomalía está acompañada de gran cantidad de ADN normal y iii) las técnicas para detección las islas CpG metiladas son relativamente sencillas [232, 236]

55 Introducción Durante la década de 1980 y 1990 disminuyó considerablemente el interés en el estudio de los cambios epigenéticos en la carcinogénesis, al ponerse de manifiesto que existía gran cantidad de cambios en la estructura primaria del ADN como posibles responsables del desarrollo de procesos como el cáncer. Sin embargo actualmente este enfoque ha cambiado sustancialmente debido a la observación de que el silenciamiento de la región promotora de genes por metilación de las citosinas en las células tumorales está claramente relacionada con la puesta en marcha de mecanismos moleculares implicados en carcinogénesis a través de alteraciones en la regulación del ciclo celular, la reparación del ADN, la interacción célula a célula, la apoptosis o la angiogénesis tumoral [ ]. El papel por tanto que ocupa el proceso de metilación del ADN y su implicación en la fisiopatología del cáncer, se ha convertido en uno de los hallazgos de mayor importancia en la investigación del cáncer. Uno de los principales avances en este campo en los últimos 5 años, ha sido el reconocimiento del papel clave que desempeña el estado de la cromatina como mediador entre la metilación del ADN y el silenciamiento transcripcional de numerosos genes como son los genes tumor supresor [240, 241]. Por lo tanto hoy día gracias a los trabajos en el campo de la Biología Molecular, sabemos que el cáncer, es en parte una enfermedad de origen genético es decir, debida a la aparición de alteraciones en el genoma celular pero también a la aparición de cambios en la expresión de genes, o en la actividad biológica de proteínas codificadas por ellos [8]. La mutación de oncogenes específicos o genes supresores de tumores, debida a la presencia de lesiones de ADN no reparadas, ocasiona una pérdida en la regulación normal del ciclo celular que favorece la proliferación celular incontrolada lo que junto con el silenciamiento de genes involucrados en regular la supervivencia y apoptosis celular podrá dar lugar al desarrollo de un cáncer [8]. Estas alteraciones genéticas en ocasiones se producen en la línea germinal (las mutaciones hereditarias son una excepción) pero la mayoría de las veces son mutaciones somáticas (cambio genético en la secuencia del ADN en células no derivadas de la línea germinal) que de no ser reparadas correctamente pueden dar lugar a alteraciones en el ADN como son;

56 Introducción translocaciones, deleciones, inversiones, amplificaciones o mutaciones puntuales [242]. Por tanto el estudio epigenético del cáncer en humanos desde su descubrimiento en 1983, ha permitido avanzar en el conocimiento etiopatogénico del cáncer incluyendo procesos de hipometilación global de la molécula de ADN, la hipermetilación de las regiones promotoras de los genes, la pérdida de imprinting, la modificación de la cromatina y estudios de microarns [243] poniendo todo ello en relación con la situación clínica de los pacientes afectos de enfermedades neoplásicas Biología de las regiones CpG, metilación del ADN y acetilación/ desacetilación de las histonas El ADN es la molécula responsable de almacenar la información genética; en ella residen las claves para regular la diferenciación celular de los diferentes tejidos y órganos que conforman un individuo. Estructuralmente está constituído por una doble cadena de ADN enrollada sobre sí misma de tal manera que cada cadena sencilla está dirigida en sentido antiparalelo (considerando la dirección de su polimerización o crecimiento) formando una estructura en espiral con grupos azúcar-fosfato orientados hacia el exterior constituyendo el esqueleto y bases nitrogenadas que están orientadas hacia el eje central de la espiral. Esta molécula de ADN no se encuentra en la célula como una molécula desplegada, sino que habitualmente se repliega sobre sí misma asociándose a otras moléculas fundamentalmente proteínas denominadas histonas formando una estructura más estable y compleja llamada cromatina. En condiciones fisiológicas cuando un estímulo extracelular llega a la célula, éste se une a su receptor de membrana produciendo la activación de distintas vías de transducción de señales intracelulares que finalmente conducen a la activación de factores de transcripción y la síntesis proteica derivada de la activación de un determinado gen. En este contexto la cromatina que estructuralmente está condensada en el núcleo de las células (forma inactiva), se descompacta ante la

57 Introducción llegada de señales intracelulares permitiendo así que las ARN polimerasas inicien el proceso de transcripción y transducción proteica en respuesta a un determinado estímulo extracelular. De esta forma se activan o inhiben rutas de señalización implicadas en los procesos fisiológicos de proliferación, diferenciación, supervivencia, transformación y muerte celular necesarios para mantener la homeostasis tisular [244]. En esta cadena de eventos que ocurren en el interior de la célula, son de gran importancia determinadas fenómenos epigenéticos que tienen un peso importante en la maquinaria de regulación de los procesos de transcripción génica. Entre ellos se encuentran las modificaciones covalentes que suceden en las histonas por procesos de acetilación-desacetilación de las mismas, así como las reacciones de metilación/desmetilación de las citosinas en el ADN. En el primer caso se sabe que cuando se produce la acetilación de los residuos de lisina (unión grupo acetilo) de los extremos amino-terminales de las histonas (NH2-terminal) realizados por enzimas con actividad histona-acetilasa (HAT), se produce una reducción de la carga positiva de estas proteínas lo que disminuye por tanto su afinidad de unión al ADN (cargado negativamente) descompactando la cromatina y permitiendo la transmisión de señales y la entrada de los factores de transcripción a la cadena de ADN. Así se puede iniciar la síntesis proteica. Por contra, cuando se producen los procesos de desacetilación de las histonas mediados por enzimas con actividad desacetilasas se provoca el efecto inverso, es decir se mantiene la estructura cerrada de la cromatina impidiendo la transcripción proteica [245]. El segundo de los caso representa otro de los eventos decisivos en la regulación transcripcional y expresión génica conocido como metilación del ADN, mecanismo fisiológico esencial para el desarrollo normal de mamíferos y plantas. Este evento en el genoma de los seres vertebrados tiene lugar en las secuencias CpG localizadas en la región promotora de los genes. Hoy conocemos que la metilación del ADN es un fenómeno epigenético que tiene un papel decisivo en la regulación de los procesos de transducción de señales actuando a dos niveles; a) directamente sobre la secuencia promotora del gen que al ser metilada ocasiona el silenciamiento de la transcripción proteica de dicho gen y por tanto anula su función, y b)

58 Introducción indirectamente actuando sobre la transcripción génica al favorecer que la cromatina se encuentre en su forma inactiva (cerrada/ compacta) cuando la región promotora del gen se encuentra metilada; de esta manera se impide la unión de factores de transcripción al ADN. En condiciones fisiológicas este evento epigenético tiene un papel fundamental a la hora de dictaminar qué genes se activan durante el proceso de diferenciación de la célula comprometida normal [246], así como en el mantenimiento del imprinting genético [247], inactivación del cromosoma X [248], represión transcripcional genética [249] y en la supresión de regiones parasitarias del ADN [250]. Sin embargo, también juega un papel determinante en el desarrollo de un proceso tumoral maligno cuando se produce de forma aberrante [251]. La metilación del ADN consiste en la adicción covalente de grupos metilos generalmente al carbono 5 de residuos de citosinas (C) del ADN situadas previa y contiguamente a bases de guanina (G) por medio de unas enzimas denominadas ADN-Metiltransferasa (DNMTs). Hasta la fecha se han descrito dos tipos de enzimas ADN Metiltransferasas: una inicial que se conoce como ADN Metiltransferesa de novo y un segundo tipo conocida como ADN Metiltransferasa de mantenimiento. La primera de ellas, las DNMTs de novo (DNMT3A y DNMT3B) serían las encargadas de establecer el perfil de metilación del genoma en etapas tempranas del desarrollo mientras que las DMNTs de mantenimiento (DNMT1) se encargan posteriormente de propagar con rigurosa fidelidad este perfil de metilación CpG en cada una de las generaciones posteriores derivadas de la célula progenitora [252]. Estas enzimas es muy importante que actúen correctamente ya que cuando se altera su función y se produce una metilación aberrante puede favorecer el silenciamiento génico y por tanto la falta de transcripción proteica de determinados genes reguladores encargados de controlar el adecuado funcionamiento celular y así permitir la expresión de oncogenes que ponen en marcha la cascada de la carcinogénesis. De hecho en estudios experimentales realizados en ratón se ha descrito que la ausencia de función de cualquiera de estas enzimas DNMTs (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B) ocasiona la muerte del ratón

59 Introducción durante el periodo embrionario o inmediatamente después. En células tumorales humanas también se ha descrito que la deficiencia en DNMT1 induce mitosis atípicas que provocan la muerte celular mientras que las enzimas DNMT3A y 3B parece que median en la transformación neoplásica y la progresión tumoral [253]. La metilación de las citosinas en el ADN ocurre en regiones del gen ricas en dinucleótidos de citosina y guanina (CpG), que aparecen agrupados en formaciones de unas pb conocidas como islas CpG y que se encuentran localizadas en regiones que son decisivas para la regulación de la transcripción génica. En efecto aún cuando el dinucleótido CpG se distribuye de forma repetitiva y al azar por todo el genoma humano, esta secuencia se encuentra preferentemente ubicada en la región promotora del gen (secuencia del gen donde tiene lugar la iniciación para la síntesis de ARNm), en los exones y en las regiones 3. Así cuando la ADN-Metiltransferasa durante la replicación del ADN metila el carbono 5 de las citosinas de la cadena recién sintetizada, la conversión de citosina en 5- metilcitosina de los islotes CpG de la región promotora, puede causar cambios en la conformación estructural de la cromatina que impidan su descompactación, bloqueando la entrada de los factores de transcripción y con ello provocando el silenciamiento y no expresión de un determinado gen [254, 255]. En la célula normal en aproximadamente el 70% de los casos estas secuencias CpG se encuentran de forma fisiológica en estado no metilado es decir funcionante, con expresión proteica derivada de la transcripción de dicho gen. Sin embargo, en las células tumorales estas regiones CpG se encuentran en la mayoría de los genes relacionados con actividades supresoras de tumores y de control del crecimiento celular normal en estado metilado es decir, silenciado, determinando con ello que genes que en condiciones fisiológicas se expresan actuando como genes supresores de tumores, a causa de la metilación de su promotor dejen de estarlo permitiendo la expresión de oncogenes que ponen en marcha la cascada de la carcinogénesis aunque aún no son bien conocidas las circunstancias por las que esto sucede [ ]

60 Introducción Actualmente sabemos que tanto la metilación del ADN como la acetilación/ desacetilación de las histonas son procesos que están interrelacionados entre sí, ya que según se ha descrito la metilación del promotor favorece la desacetilación de las histonas y con ello el que la estructura de la cromatina esté cerrada y por tanto inaccesible a los factores de transcripción, y viceversa, cuando las histonas están acetiladas la cromatina se descompacta y permiten la entrada del complejo de transcripción si bien el ADN parece ser más sensible a la metilación aunque estos mecanismos no son bien conocidos. Además cuando existen bajos niveles de acetilación de las histonas se sensibiliza el ADN a los procesos de metilación [259] y aún cuando en este proceso de interrelación entre cambios epigenéticos en el ADN y en la cromatina hay todavía cierto nivel de incertidumbre se acepta que la modulación de la transcripción génica de acuerdo con la acetilación de las histonas puede actuar produciendo una acetilación global de las histonas o bien acetilando las histonas de la región promotora. En el primer caso este proceso se correlacionaría con la actividad general transcriptional, mientras que la acetilación específica del promotor representaría un mecanismo crítico para el control de actividad específica del gen, existiendo un nivel de acetilación equilibrado de acuerdo con los mecanismos de regulación entre enzimas desacetiladoras y acetiladoras [260]. Según los trabajos de Felsenfeld y col. [261] la acetilación de las histonas actúa como mecanismo de protección frente a la metilación de la región promotora del gen que ha de expresarse manteniendo su estado no metilado. Esto parece que es debido a que al metilarse la región promotora de un determinado gen, existen enzimas metiladoras de histonas que pueden reconocer citosinas metiladas y metilar las histonas próximas. Del mismo modo, encimas que metilan el ADN pueden reconocer histonas metiladas, y así seguir con la metilación a nivel de ADN. El resultado final derivado de todo ello que se produzca un cambio en el perfil de metilación del gen que da lugar al silenciamiento del gen metilado y por lo tanto la ausencia de expresión derivada de su transcripción [236]. Cuando un determinado gen se expresa en un tejido normal las secuencias CpG de la región promotora de ese gen, se encuentran no metiladas y las histonas en

61 Introducción torno a la cromatina están acetiladas. Sin embargo cuando acontece un evento epigenético que favorece la progresión hacia un tejido preneoplásico y posteriormente tumoral, gradualmente se producen reacciones de desacetilación de las histonas y metilación de las regiones CpG favoreciendo el silenciamiento génico de genes encargados de regular la correcta homeostasis celular ocasionando la pérdida de expresión de genes supresores de tumor [259]. Estos acontecimientos tienen un papel importante en la regulación de la expresión y silenciamiento de los genes, ya que se sabe que aunque todos los genes están presentes en las células de un determinado tejido, sólo una pequeña proporción de ellos se expresarán mientras que la mayoría permanecerán silentes. Es decir, los genes que se deben expresar en los tejidos en condiciones fisiológicas tienen las regiones de sus promotores no metiladas, mientras que los genes que se deben desactivar en los tejidos diferenciados tienen estos islotes metilados (silenciados). Por tanto el que se expresen determinados genes y se silencien otros tendrá un papel determinante tanto en el desarrollo normal de los tejidos como en la aparición de un proceso tumoral al silenciarse genes implicados en la regulación de fenómenos de proliferación, regulación del ciclo celular, reparación del daño al ADN etc. [255]. Este hecho, ha revelado una importante relación entre cambios epigenéticos con patrones anormales de metilación y enfermedades como el cáncer. Esta relación entre metilación aberrante y cáncer se ha hecho evidente al encontrarse hace pocos años que la ausencia de metilación conducía a la activación de oncogenes mientras que la metilación anulaba la acción protectora de los genes supresores de tumores [237, ]. Por tanto, el mantenimiento del perfil de metilación de los dinucleótidos CpG en el genoma es crucial para la homeostasis celular adecuada, de forma que cuando este equilibrio se altera, ocasiona patrones de metilación aberrantes que producen silenciamiento de genes que deberían expresarse como son los genes tumor supresores y en cambio permite la expresión de genes que deberían estar silenciados como los oncogenes pudiendo resultar de todo ello la aparición de un proceso tumoral [265]

62 Introducción Este mecanismo por el que la metilación del ADN afecta a la expresión de los genes sigue siendo un tema de intenso estudio, al que se han propuesto dos explicaciones. La primera es que la metilación de las islas de CpG en los sitios de unión del promotor con los factores de transcripción bloquearía dicha unión, con la consiguiente falta de expresión del gen. La segunda se basa en la existencia de una familia de proteínas nucleares específicas, las proteínas de unión a metilcitosinas, que reconocen y se unen a las secuencias metiladas del ADN (dmcpg). Estas proteínas podrían inhibir las interacciones con los factores de transcripción necesarios para que el gen se exprese; además, podrían atraer hacia sí otros elementos por ejemplo, histona-desacetilasas que, al eliminar los grupos acetilos de las histonas, inducirían la compresión de los nucleosomas imposibilitando la transcripción. Este proceso puede ser revertido mediante histonaacetiltransferasas y desmetilación del ADN [266, 267]. Estos cambios epigenéticos que ocurren debido a cambios de la conformación de la cromatina, acetilación de las histonas, y la metilación de las islas CpG, podrían ser potencialmente utilizados para identificar las diferentes etapas del desarrollo del cáncer, especialmente en el diagnóstico precoz, pronóstico y tratamiento [ ]. Especialmente en el cáncer, los patrones de metilación aberrante pueden contribuir al desarrollo de esta enfermedad por facilitar la expresión de genes que en condiciones fisiológicas no se expresarían como los oncogenes e inhibir en cambio la expresión de otros que actuarían regulando el correcto funcionamiento como son los genes tumor supresor de tumores Aplicación del estudio del perfil de metilación aberrante del ADN en el cáncer de mama El cáncer de mama es una enfermedad que diagnosticada precozmente es potencialmente curable. Sin embargo y aún en estadios iniciales, hasta un 30 % de las mujeres diagnosticadas de cáncer de mama localizado a lo largo de su vida, la

63 Introducción enfermedad se hace metastásica sin haberse podido anticipar a su detección con las técnicas que habitualmente disponemos en la clínica [272]. En los últimos años, gracias al avance en técnicas de Biología Molecular, se han desarrollando nuevos procedimientos que dirigidos fundamentalmente a su aplicación en el diagnóstico precoz de distintas patologías incluyendo las propiamente infecciosas, especialmente virales, pasando por las estrictamente hereditarias hasta las enfermedades neoplásicas están ofreciendo resultados prometedores que nos aproximan a un diagnóstico más precoz, un tratamiento y pronóstico cada vez más personalizado y en definitiva un mejor abordaje terapéutico [273]. En el cáncer y hasta fechas recientes, desde las primeras determinaciones de marcadores tumorales característicos de determinados tipos de tumores mediante su análisis en sangre periférica por técnicas de RIA o ELISA, se ha dispuesto de cierta información que nos ha orientado hacia el posible origen del tumor y también en el seguimiento de la respuesta a los tratamientos aplicados [274]. Sin embargo, y aunque la utilización en la práctica clínica de estas técnicas suponen un aporte sustancial, su especificidad y sensibilidad es limitada en la mayoría de los casos [275]. Esta característica unida a que los niveles de marcadores cuantificados en sangre periférica rara vez se encuentran elevados en las etapas preinvasivas de la enfermedad, hace que su utilidad como método de diagnóstico precoz tenga relativamente poco valor. Sin embargo actualmente conocemos que sucesos como la metilación aberrante de las regiones de promotoras de múltiples genes ocurren en etapas tempranas de la carcinogénesis y que su determinación es posible a través del análisis del ADN aislado en sangre periférica o fluídos naturales (como el aspirado de los ductos mamarios) por técnicas poco cruentas, lo que permitiría ser utilizado como un potencial biomarcador en el diagnóstico precoz y quizás de recidiva de un proceso tumoral así como en la identificación temprana de aquellos individuos con alto riesgo de desarrollar cáncer de mama [276, 277]. Una de las técnicas de la que disponemos para este estudio del perfil de metilación es la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, con la que podemos amplificar pequeñas cantidades de ácidos nucleicos circulantes en sangre periférica, mejorando así las limitaciones tanto de

64 Introducción sensibilidad como de especificidad que tenían técnicas anteriores y abrir una puerta más al diagnóstico molecular de la enfermedad neoplásica. De hecho por medio del estudio de metilación por PCR (MSP) se describe que es posible detectar una única célula tumoral con ADN aberrantemente metilado de entre 10 4 células normales [278]. Además el estudio de la metilación del ADN frente al estudio de proteínas o moléculas como el ARN presentan algunas otras ventajas a parte de poder ser amplificadas por PCR y son su mayor estabilidad y el que puede ser aislado del tejido fijado con formol e integrado en parafina. Las alteraciones genéticas y epigenéticas que inician y promueven cascadas intracelulares relacionadas con la carcinogénesis en su etapa más temprana, podrían ser por tanto utilizadas para predecir la presencia de enfermedad tumoral en pacientes que desde el punto de vista clínico aún no presenta síntomas ni signos relevantes que hagan sospechar el diagnóstico de una determinada enfermedad tumoral pudiendo aproximarnos al mismo tiempo a información sobre su pronóstico y tratamiento necesario [279]. En la actualidad ya han sido descritas alteraciones específicas en suero de perfil de metilación de regiones promotoras de genes tanto supresores de tumores como de genes implicados en la proliferación y supervivencia celular relacionadas con el cáncer de mama que en los pacientes con cáncer se encuentran metilados y en cambio se encuentran no metilados en personas sanas. La detección de este perfil de metilación a través del estudio de fluídos corporales como el aspirado de los ductus mamarios o de su análisis en sangre periférica, son técnicas poco cruentas y accesibles en la práctica diaria a través de las cuáles podríamos analizar este patrón de metilación en un subgrupo de población de mayor riesgo para a partir de él anticiparnos a un diagnóstico más precoz [280]. En este sentido recientes estudios realizados han mostrado que es posible observar alteraciones específicas derivadas de la presencia de un tumor a través del estudio del ADN disuelto en suero en tumores del área de cabeza y cuello, pulmón, cáncer de colon etc. en etapas precoces [263, 281] e incluso en el cáncer de mama se ha descrito este hallazgo en tumores in situ [272]. Estos avances pueden

65 Introducción derivar en un importante impulso para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer así como en el estudio individualizado de los pacientes que podrían resultar beneficiados de un tratamiento más específico adaptado a su tumor en particular [282]. Por lo tanto el estudio del patrón de metilación del ADN, podría ser aplicado al estudio molecular del cáncer de acuerdo las siguientes hipótesis: En primer lugar, si la metilación aberrante de las islas CpG de la región promotora de un determinado gen, se encuentra metilada en un alto porcentaje de las células tumorales y no en células sanas, esta característica podría ser utilizada para detectar la presencia de células cancerígenas a partir de muestras obtenidas de biopsia o tejido tumoral o bien a través del análisis del ADN libre en el plasma del paciente [283]. En segundo lugar, si un conjunto de genes se encentran metilados de forma patológica en un determinado tipo histológico de tumor, y a su vez se relaciona con un determinado comportamiento en cuanto a la sensibilidad a distintos tratamientos de quimioterapia u hormonoterapia, o al pronóstico de la enfermedad, estas determinaciones podrían ser utilizadas como un marcador molecular que ayude a orientarnos sobre el origen del tumor, a predecir un pronóstico más preciso, a decidir el tratamiento más adecuado de acuerdo con las características moleculares del mismo y quizás poder ser utilizado como marcador de recidiva precoz [283]. Por último, si la metilación de la región CpG de un determinado gen/genes en tejido no tumoral se asocia con un riesgo aumentado para el desarrollo de un tumor, estas determinaciones podrían ser utilizadas como un futuro marcador de riesgo para desarrollar cáncer [283] lo que nos podría permitir realizar mejores campañas de screening en la población avanzando en los métodos de diagnóstico precoz

66 Introducción Muestras y fluídos en los que se puede estudiar el perfil de metilación El análisis del estado de metilación del ADN se puede efectuar en cualquier fluido biológico: en el supuesto de que con este estudio se busque el despistaje de la presencia de un tumor hay que aceptar que la lisis celular en el seno del tumor produce detritus que en su proceso normal de eliminación pasan a los fluidos biológicos, donde pueden ser identificados. Se ha descrito la aplicación del estudio de biomarcadores de ADN metilado en los siguientes medios: a) Detección de ADN libre extraído de suero o plasma La presencia de ADN libre en plasma/suero de pacientes con cáncer fue descrita inicialmente en la década de los 70 [284]. Este hallazgo describió como parte del ADN disuelto en plasma procedía del ADN liberado al torrente circulatorio como consecuencia de los fenómenos de apoptosis y necrosis celular que sufrían las células tumorales [285]. Sin embargo su estudio analítico con fines diagnósticos no avanzó hasta décadas después cuando, gracias a la investigación translacional se asociaron las técnicas de PCR y PCR específica de metilación al estudio del ADN circulante en pacientes diagnosticados de cáncer. Sólo así se pudo distinguir ADN procedente del tumor y ADN procedente de los tejidos sanos y por ello hasta entonces el hallazgo inicial de mutaciones en el ADN asociadas al cáncer concentró el mayor interés científico [286]. Sin embargo, este planteamiento no estaba exento de limitaciones ya que localizar una mutación concreta en un gen generalmente desconocido y amplificar específicamente esa secuencia del ADN que contiene la mutación a partir del material genético obtenido de una muestra en donde predominaban células normales suponía un complejo y difícil proceso [283]. Hoy día los avances en el campo de la epigenética han permitido mediante el análisis del patrón de metilación del ADN aislado en suero de sujetos afectos de cáncer, poder determinar si este sigue un patrón de metilación fisiológico o, como sucede con las células tumorales, es un patrón de metilación aberrante [287, 288]. Este tipo de estudios nos han permitido saber que en el cáncer se encuentran

67 Introducción metilados ciertas secuencias de promotores de genes que en la población sana y en condiciones fisiológicas se encuentran no metilados, y además que estas alteraciones epigenéticas están presentes en etapas tempranas de la carcinogénesis [ ]. Para la detección del perfil de metilación de las regiones CpG a partir del análisis en suero por PCR cualitativa se han sometido a estudio grupos de pacientes con tumores de diferentes orígenes, entre ellos: cáncer de pulmón [ ], cabeza y cuello [295], esófago [296], hígado [297], colo-rectal [298], próstata [299], vejiga [268, 300], melanoma y mama [301]. De los resultados de estos trabajos se ha podido constatar la importancia de la técnica en el detección de las anomalías de la metilación y del papel de la metilación como biomarcador en la detección temprana y el diagnóstico del los distintos tipos de cáncer. b) Detección del ADN tumoral a partir del lavado de los conductos galactóforos El análisis del perfil de metilación a partir de células tumorales aisladas de fluídos naturales como la orina, el esputo, el lavado bronquiolo-alveolar (BAL) o el lavado de los ductos galactóforos de la mama, saliva etc. puede ser especialmente interesante asociada al estudio citológico puesto que utilizando ambas metodologías se puede confirmar el diagnóstico especialmente cuando el material que se aísla procede de restos de células tumorales que están degradadas o es escaso. Como ejemplo de ello en algunos trabajos se ha correlacionado el análisis del estado de metilación aberrante de Ciclina D2, RARb, Twist, GSTP1, p16, p14, RASSF1A y DAPK en el aspirado de los ductos de mujeres con cáncer de mama y con una citología sugerente de malignidad para cáncer de mama en un alto porcentaje [302, 303]. A continuación describimos los posibles campos de aplicación del estudio del ADN metilado de forma patológica:

68 Introducción Posibles campos de aplicación del estudio del ADN metilado de forma patológica a) ADN metilado como marcador de riesgo en cáncer Los marcadores tumorales que habitualmente se emplean en clínica son fundamentalmente proteínas que medidas en el suero o en el plasma pueden ayudar a identificar precozmente población afecta de un proceso tumoral. Igualmente son de utilidad en aquellas personas diagnosticadas de cáncer para determinar el pronóstico de la enfermedad, monitorizando la respuesta terapéutica y el seguimiento de acuerdo con su determinación periódica en sangre periférica. Sin embargo tienen algunas limitaciones importantes como es que en la mayoría de las ocasiones no es órgano-específica e incluso se puede detectar elevada en patología no tumoral [188]. En la práctica habitual además del empleo de estos marcadores tumorales, existen distintos modelos matemáticos capaces de estimar el riesgo individual que una mujer sana tiene de desarrollar cáncer de mama; este tipo de modelos de riesgo están basados en datos epidemiológicos y etiológicos obtenidos de estudios llevados a cabo incluyendo grandes muestras de población de mujeres afectas de cáncer de mama. Bajo el denominador común de modelos predictivos de riesgo se apoyan en el método matemático de la regresión logística multivariante. Entre ellos uno de los más usados es el modelo de Gail, que basado en factores de riesgo epidemiológicos, utiliza la edad al diagnóstico del tumor, edad de la menarquia, edad del primer embarazo, número de biopsias previas, y número de familiares en primer grado (madre o hermana) con cáncer de mama, para estimar dicho riesgo. Así se considera que una mujer es de riesgo elevado cuando el riesgo de desarrollar cáncer de mama es superior al 1,7% en los próximos 5 años [304]. Sin embargo, estos modelos predictivos de riesgo presentan también algunas limitaciones, incertidumbres y omisiones. Entre estas últimas señalaremos que en la aproximación matemática predictiva no se consideran la edad a la que se diagnosticaron los casos de cáncer de mama en la familia, no se incorporan los resultados de test genéticos ni se considera a los familiares de segundo grado

69 Introducción Además los estudios de validación realizados han demostrado que el modelo sobreestima ligeramente el riesgo en poblaciones sin screening mamográfico, especialmente en mujeres premenopáusicas [305], así como en poblaciones con menor incidencia basal y que incluso en el mejor de los casos la estimación del riesgo se encuentra entre el 58-59% [304]. Por lo tanto es necesario desarrollar nuevos modelos predictivos que añadieran y/o modificaran otros factores de riesgo a los ya descritos. [306]. Actualmente se ha descrito que el estudio molecular de las alteraciones epigenéticas en sangre periférica podría ser de utilidad para predecir el riesgo de desarrollar cáncer [307]. El dogma según el cual el cáncer es una enfermedad de origen genético fue el principal pilar que lideró el campo de la investigación del cáncer durante muchas décadas [308]. Ese paradigma ha contribuido al avance de la investigación y del conocimiento y, gracias a él, hoy conocemos la secuencia del Genoma Humano así como gran cantidad de información molecular en la que se describen mapas de mutaciones genéticas relacionadas con las enfermedades, entre ellas el cáncer, junto con potenciales marcadores moleculares que posteriormente podrían ser utilizados en el diagnóstico y tratamiento del cáncer [309]. Sin embargo y considerando que cada vez existen más evidencias de que en el cáncer los eventos epigenéticos contribuyen tanto en la patogénesis como en la progresión de la enfermedad se ha puesto de manifiesto que en el cáncer además de alteraciones genéticas hay cambios epigenéticos de singular importancia [278, 281, 299, ]. En este sentido conviene precisar que, quizás, el primer evento en la cascada de la carcinogénesis reside en el daño producido al ADN bien por alteraciones genéticas como son mutaciones, pérdida de heterocigosidad, inestabilidad en los microsatélites o bien por eventos epigenéticos como es la metilación del ADN. Hoy día sabemos que tanto las alteraciones genéticas como epigenéticas son fenómenos que realmente están interrelacionados entre sí. Esto se ha observado en el cáncer colo-rectal donde se ha demostrado que la metilación la región promotora de los islotes CpG en un gen silencia exclusivamente el alelo no mutado (wild type) [316] y que la metilación puede potenciar que se produzcan mutaciones al contribuir al

70 Introducción silenciamiento durante la evolución de la especie de las secuencias CpG y dar lugar a una mutación por ej. CG a TG frecuentemente aislada entre las mutaciones del gen p53 [317, 318]. Además, se sabe que el silenciamiento transcripcional tanto de genes tumor supresor como de aquellos otros encargados de reparar el daño producido al ADN es un hallazgo frecuente en estadios precoces y subclínicos de la enfermedad [319, 320]. Por ejemplo, en algunos estudios tanto p16ink4a como el gen MGMT han sido encontrados metilados en el ADN de esputo 35 meses antes de que pudiese clínicamente ser demostrada la presencia del cáncer de pulmón [321]; o como la metilación patológica del ADN que parece inducida por la infección de la bacteria Helicobacter pylori en el antro gástrico, ha sido propuesta como un factor predictivo del riesgo para el desarrollo del cáncer gástrico [322]. Si tenemos en cuenta estos resultados observacionales se podría sugerir que los cambios epigenéticos ocurren antes que los eventos genéticos y que la combinación de ambas alteraciones en el genoma desencadena la inducción de los mecanismos carcinogénicos. De hecho la pérdida de impresión genética (LOI), un hecho importante en la regulación de la homeostasis, en el gen IGF2 que promueve proliferación celular y que se ha descrito en el coriocarcinoma y teratocarcinoma [323], fue aislada tanto en el epitelio colónico normal como en los linfocitos circulantes de individuos con riesgo aumentado de desarrollar cáncer de colon [307]. b) ADN metilado como marcador pronóstico en cáncer La afectación ganglionar y el tamaño del tumor son los factores pronóstico más importantes hasta hoy día conocidos en el cáncer de mama [ ]. Sin embargo, aproximadamente 1/3 de mujeres con cáncer de mama sin afectación ganglionar recaen a lo largo del seguimiento de la enfermedad, mientras que otro tercio de pacientes no recaen tras 10 años de evolución a pesar de tener afectación ganglionar en el momento del diagnóstico [328, 329]. Esto resultados podrían indicar que los factores pronóstico utilizados actualmente para predecir qué pacientes recaerán y, por consiguiente, cuáles necesitan realizar tratamiento sistémico más agresivo, no son suficientes a la hora de identificar a aquellos

71 Introducción pacientes en los que se puede obviar dicho tratamiento y con ello las toxicidades que de él derivan, por tener un bajo riesgo de recidiva de la enfermedad. En este sentido debemos esperar que el estudio de nuevos marcadores moleculares dependientes del tumor, asociados a los ya conocidos, nos permitan discernir con mayor sensibilidad y especificidad en qué subgrupo de pacientes existe un mayor riesgo de recaída de la enfermedad y por lo tanto cual es el tratamiento a administrar en función de su nivel de riesgo [330, 331]. Este objetivo se ha intentado alcanzar en muchas ocasiones a partir del estudio y aplicación de test genéticos diseñados para buscar en pacientes afectos de cáncer datos moleculares que ayuden a predecir e identificar el grado de agresividad de un tumor. Sin embargo los estudios realizados hasta el momento se han encontrado con dos importantes problemas. El primero de ellos es que el porcentaje de mutaciones somáticas que se aíslan en los tumores sólidos es muy bajo, de ellos la mutación del oncogén K-Ras y del gen tumor supresor p53 son las más conocidas. En segundo lugar el que las poblaciones de células tumorales del tumor primario son muy heterogéneas, por lo que ningún marcador puede por sí solo predecir con exactitud cuál será el comportamiento de un determinado tumor [332]. La aplicación de técnicas basadas en el análisis de la metilación de los islotes CpG de genes implicados en procesos de apoptosis, adhesión celular, reparación de ADN y el ciclo celular no ha permitido hasta el momento resolver el problema de la heterogeneidad celular; sin embargo, analizando la metilación del ADN como marcador molecular en pacientes con cáncer de pulmón y cáncer de colon se han observado un peor pronóstico en aquellos pacientes en los que en los que fue posible identificar alteraciones en la metilación en los promotores de los genes DAPK y p16ink4a respectivamente [333, 334]. c) ADN metilado como marcador predictivo de respuesta clínica en cáncer La identificación de nuevos marcadores predictivos de respuesta que añadidos a los ya utilizados en clínica, ayuden a seleccionar el tratamiento más adecuado de acuerdo con factores moleculares y biológicos del tumor, representa en la

72 Introducción actualidad una importante área de investigación hacia el que la práctica oncológica avanza paralelamente con el desarrollo de las nuevas tecnologías en el campo de la Biología Molecular. Poder conocer las posibilidades de respuesta a los tratamientos con QT, HT y nuevas dianas moleculares en las pacientes candidatas de recibir un tratamiento adyuvante o paliativo, es un reto que todavía hoy sólo está resuelto parcialmente. En el cáncer de mama, los métodos que actualmente están disponibles para determinar con precisión la agresividad de la enfermedad y la probabilidad de respuesta a un determinado tratamiento de forma individualizada son todavía insuficientes. En la actualidad la QT adyuvante debe ser considerada en la mayoría de las pacientes con cáncer de mama a excepción de un pequeño subgrupo con una predicción de riesgo de recaída muy bajo basado en factores clínicos y moleculares conocidos hasta el momento. Sin embargo, no todas las pacientes se beneficiarán de estos tratamientos ya sea porque tienen un pronóstico excelente o porque su tumor no responde a determinada QT y en cambio sí estarán expuestas a presentar efectos secundarios derivados de dicho tratamiento [335]. Por tanto es necesario la búsqueda de nuevos marcadores predictivos de respuesta que sumados a los actualmente conocidos nos ayuden a indicar tratamientos más individualizados y selectivos para cada paciente. En el cáncer de mama concretamente la identificación de 5 subtipos moleculares y la expresión en tumor de RE y/o RP, representan uno de los factores más importantes predictivos de respuesta al tratamiento hormonal y con valor pronóstico [172, 336]. En este sentido también se ha descrito que la metilación también puede tener un papel predictivo de respuesta importante. Así se ha descrito que la metilación de ESR1 es factor predictivo de respuesta en aquellas pacientes tratadas con Tamoxifeno y la metilación de ARH1 es predictivo de respuesta para las pacientes no tratadas con antiestrógenos, mientras que la metilación de CYP1B1 es factor predictivo de supervivencia [337]

73 Introducción d) Aplicación de la metilación aberrante del ADN a la terapéutica del cáncer La metilación del ADN es uno de los eventos epigenéticos más frecuente e importantes que ocurre durante etapas tempranas de la caricinogénesis y que incidiendo directamente en la inactivación de genes supresores de tumores ocasiona una pérdida de control del ciclo celular y un déficit en los procesos de reparación del ADN dañado que promueve, fenómenos de proliferación celular incontrolada y confiere ventajas a la supervivencia celular a través de la función de genes involucrados en el desarrollo tumoral [338, 339]. Actualmente se sabe que las alteraciones genéticas que se van acumulando en el ADN añadidas a las alteraciones epigenéticas que si modificar la secuencia de nucleótidos ocasionan cambios postranscripcionales contribuyen a desarrollar un fenotipo tumoral. Los eventos epigenéticos son un mecanismo de regulación fisiológico y necesario que posee el organismo para definir la expresión génica y para conferir estabilidad genómica al asegurar el adecuado orden y funcionamiento celular. Sin embargo, este patrón de metilación que por otra parte puede heredarse [340], en determinadas situaciones patológicas deja de regular el correcto funcionamiento de la división y desarrollo celular, confiriendo ventajas a la célula a favor de una proliferación celular descontrolada carente de control y de la pérdida de los fenómenos apoptóticos que favorece el desorden celular y en el desarrollo de los procesos tumorales. Este fenómeno ha sido descrito en varios distintos tipos de tumores lo que ha permitido establecer patrones específicos de metilación en diferentes subgrupos de tumores [341, 342]. Por tanto probablemente la adecuada comprensión de los perfiles de metilación tumoral puede tener un impacto positivo y ayudar en la búsqueda de soluciones a importantes problemas clínicos como son; la detección precoz del cáncer, quimioprevención, pronóstico y tratamiento de las enfermedades neoplásicas [338]. Se ha demostrado en experimentos llevados a cabo en modelos de ratón, que si se revierte o disminuye el nivel de metilación existente en los promotores de

74 Introducción determinados genes se consigue prevenir la aparición de tumores. Este resultado es demostrativo de la importancia del papel de la metilación aberrante sobre el crecimiento tumoral in vivo y su papel patogénico [257, 343, 344]. En estudios iniciales que trataran de explicar el papel de la metilación en células tumorales humanas, se ha observado al analizar comparativamente el tejido tumoral y el tejido sano que en tejido tumoral existen cuantitativamente mayor cantidad de grupos 5-metilcitosina, que en el tejido sano que rodeaba al tumor y este hallazgo se ha asociado al predominio del silenciamiento de genes en el especimen tumoral [345]. Posteriormente se pudo demostrar que este mecanismo de silenciamiento génico también existía en las células sanas como mecanismo regulación de expresión de proteínas y que la ausencia de metilación permitía que un determinado gen se expresara, sugiriendo que la metilación actúa como un mecanismo de regulación génica fisiológico. Sin embargo y a diferencia de lo que ocurre en células sanas, en las células tumorales, existe un predominio de genes encargados de regular el ciclo celular que se encuentra metilados mientras que tal metilación está ausente en oncogenes. Es decir existe por tanto una desregulación del ciclo celular y un aumento de expresión oncogénica. Todo esto llevó a plantear como hipótesis de una futura diana terapéutica, que revirtiendo el estado de metilación y, por tanto, el silenciamiento génico derivado de este mecanismo, se podría favorecer la expresión y recuperar la funcionalidad de aquellos genes encargados de regular el ciclo celular normal que, debido a una alteración en el patrón de metilación se encuentran anormalmente silenciados. Esto dio lugar a la aplicación en terapéutica oncológica de dos moléculas análogas de citosina; la 5-Azacitidina y la 2-Deoxicitidina que dirigidas contra la enzima DNAMT impiden la transferencia de grupos metilos y por tanto el silenciamiento de los genes a través de la metilación de sus promotores [346]. Los datos acumulados en la actualidad demuestran un efecto beneficioso de estos fármacos con respuestas clínicas positivas en estudios realizados en pacientes especialmente en el tratamiento de procesos hematológicos, aunque el mecanismo exacto de actuación de dichos fármacos no está aun totalmente aclarado [347, 348]

75 Introducción Quizás el campo de la terapia epigenética represente un futuro esperanzador en el tratamiento del cáncer. De hecho ya se han descrito estudios in vitro en los que agentes como Decitabina (5-Azacitidina-2-Deoxicitidina) revierten la resistencia a varios agentes citotóxicos utilizados en el tratamiento del cáncer como Cisplatino, Epirrubicina y Temozolamida en líneas celulares de cáncer en humanos [ ] GENES ANALIZADOS EN ESTE TRABAJO Y RUTAS METABÓLICAS EN LAS QUE INTERVIENEN En el presente trabajo de investigación analizamos el perfil de metilación por PCR cuantitativa de la región promotora de un panel de 5 genes implicados cada uno de ellos en distintas rutas de regulación celular para estudiar su posible utilidad como biomarcador en el cáncer de mama Metilación en genes supresores de tumores Uno de los mecanismos implicados en el proceso de carcinogénesis es la pérdida de función de genes supresores de tumores, que en condiciones fisiológicas actúan como un regulador negativo de la proliferación celular o regulador positivo de la diferenciación celular en respuesta al daño producido en el ADN. Así suprime la división celular cuando no existe necesidad de reparar un daño en el ADN. La inactivación de estos genes supresores de tumores por tanto contribuye al proceso de carcinogénesis por conferir ciertas ventajas al crecimiento celular indefinido estimulando la activación de la división celular desorganizada carente de retrocontrol negativo. Esta anulación de la actividad de estos genes en parte, está relacionada con el proceso de metilación de citosinas de las islas CpG situados en la región promotora de dichos genes supresores de tumores, produciendo un silenciamiento de su expresión por anulación en la transcripción del ADN, favoreciendo así una pérdida de control del ciclo celular al hacer que las células sean insensibles al control de señales antiproliferativas

76 Introducción En el cáncer de mama existe una amplia lista de genes supresores de tumores que se han encontrado metilados en etapas tempranas de la carcinogénesis. Entre ellos se encuentran; BRCA1 y BRCA2, p16 INK4a, RAR-Beta, p53, FHIT [352, 353] De todos ellos nosotros cuantificamos el estado de metilación del promotor de RAR- Beta. a) RAR-Beta: Constituye una familia de receptores del ácido retinoico (RAR) situados en el núcleo de la célula, que tienen como función intervenir en los mecanismos de control del crecimiento y diferenciación celular, estableciendo un equilibrio entre procesos de proliferación y apoptosis. Actúan como factores de transcripción activados por ligandos que uniéndose a la región promotora de numerosos genes diana, dan lugar a su expresión o represión transcripcional[354]. Dentro de cada clase de receptor, existen tres subtipos: α, β y γ. Recientemente se han localizado los genes que codifican para estos receptores RAR-α, RAR-β y RAR-γ humanos y se ha visto que se localizan, respectivamente, sobre los cromosomas 17q21.1, 3p24 and 12q13 [355]. El gen RAR-Beta es un importante gen tumor supresor que mientras en líneas celulares de mama no tumorales se encuentra en estado no metilado y por lo tanto se expresa regulando que la célula no prolifere de forma indefinida, en cambio en líneas celulares de cáncer de mama se ha observado que se encuentra metilado en una 3ª parte de los casos y por tanto no se expresa favoreciendo consecuentemente el crecimiento celular continuado, en diversos tumores sólidos como son el cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama [356, 357]. Concretamente en el cáncer de mama se ha encontrado metilado hasta en un 43% de los tumores infiltrantes [352, 358] relacionándose su estado de metilación en pacientes con la presencia de metástasis óseas, cerebrales y pulmonares [359]. Por tanto el determinar el estado de metilación en suero de este gen y la consiguiente pérdida de expresión proteica derivada de la ausencia de su transducción proteica, podría ser utilizado como biomarcador para predecir el riesgo de metástasis en el cáncer de mama. Incluso autores como Widschwendter y col. estudiando la repercusión y papel del estado metilado del gen RAR-Beta en cuatro líneas celulares de cáncer de

77 Introducción mama, observó que cuando este estaba metilado se confería una situación de refractariedad al ácido trans-retinoico (ATRA) que hoy día conocemos que actúa como inductor de su expresión por medio del ARN mensajero del RAR-B2 (ARNm) y que sólo se podía revertir esta situación y por lo tanto inducir su expresión cuando estas líneas celulares eran tratadas con agentes desmetilantes como el 5- aza-28-deoxicitidina (Aza-CdR), consiguiéndose así su expresión [360]. Además, en diversos trabajos se ha observado que es posible la reactivación endógena de RAR- B al inducir la reacetilación de histonas en la secuencia promotora RARB P2 en líneas celulares de cáncer de mama sugiriendo que RAR-B podría ser un objetivo importante para la terapia contra el cáncer [361, 362] Metilación en genes relacionados con los mecanismos de control celular El ciclo celular consiste en una serie de eventos perfectamente coordinados que permiten el crecimiento y la proliferación celular de forma organizada. Para asegurar la correcta progresión a través del ciclo, las células han desarrollado una serie de puntos de control que previenen la entrada en una nueva fase del ciclo hasta que hayan completado exitosamente la anterior. Los principales componentes de la maquinaria del ciclo celular son las quinasas dependientes de ciclinas (CDK), las que, cuando son activadas, permiten a las células pasar de una fase del ciclo a la siguiente. Existen puntos de control en el ciclo celular que aseguran la progresión del mismo: Punto de control del ADN no replicado, en la entrada de fase M. Actúa inhibiendo a Cdc25, el cual es un activador de la Ciclina A/B Cdk1. Punto de control del ensamblaje del huso, antes de la telofase. Se activa una proteína Mad2 que impide la degradación de la segurina, lo que impide la segregación de las cromátidas hermanas

78 Introducción Punto de control de la separación de cromosomas, al final de la mitosis. En el caso de que fuera incorrecto, se impediría la degradación de la Ciclina B por APC. Punto de control del daño del ADN, en G1, S o G2. El daño celular activa a p53, proteína que favorece la reparación el ADN, detiene el ciclo promoviendo la transcripción de p21, inhibidor de Cdk, y, en el caso de que todo falle, estimula la apoptosis. En el cáncer de mama, fundamentalmente resaltar el papel de la Ciclina D2 y proteína sigma: a) Ciclina D2: Se sintetizan en fase G1, siendo responsables de la transición de G1 a S tras activar a Cdk4 y Cdk6. Las ciclinas de tipo D desempeñan un papel importante en la integración de las señales mitogénicas y, se puede decir, que constituyen el punto de conexión entre el medio extracelular y el ciclo celular. Una vez que los factores de crecimiento interaccionan con sus receptores localizados en la membrana plasmática, se dispara una cascada de transducción de señales cuyo eje principal es la vía Ras/Raf/MAPK, uno de cuyos principales lo constituye la síntesis de Ciclina D. Su estado metilado que implicaría el silenciamiento y por tanto su no expresión se ha descrito en distintos tumores como el cáncer de mama provocando una pérdida de regulación del ciclo celular normal [363]. b) sigma: Pertenece a una familia de genes con hasta 7 isoformas, cuyo producto proteico actúa a través de la fosforilación de los residuos de serina o treonina, inhibiendo la progresión del ciclo celular en fase G2/M una vez se ha producido el daño en el ADN. Después de producirse dicha lesión en el ADN, se activa un programa transcripcional en el que el interviene el gen tumor supresor p53 como inductor de sigma, provocando la detención del ciclo celular y la muerte celular programada [364]. Se ha descrito que la pérdida de expresión de sigma por metilación de su región promotora, está presente en más del 90% de los casos de cáncer de mama. Este silenciamiento epigenético, puede contribuir al desarrollo de una neoplasia

79 Introducción por impedir la comprobación de la correcta progresión del ciclo celular en G2/M cuando se produce una lesión en el ADN. De esta forma permitiría la acumulación de defectos y aberraciones genéticas responsables del desarrollo tumoral. Este hecho se ha descrito en diversos tipos de tumores, entre ellos el cáncer de próstata, pulmón, mama y varios tipos de cáncer de piel [364, 365] Metilación de genes implicados en la reparación de ADN Los genes reparadores de ADN constituyen un grupo de genes que codifican proteínas cuya función es corregir errores que surgen cuando las células duplican su ADN antes de dividirse. Las mutaciones en estos genes, puede conducir al fracaso en la reparación de ADN, permitiendo que mutaciones posteriores no se reparen y se acumulen, pudiendo como consecuencia favorecer el desarrollo de un proceso tumoral. En cáncer de mama, se ha observado la implicación de la metilación de genes reparadores del ADN con la aparición del cáncer. De ellos el más destacado, el hmlh1[366]. a) hmlh1: Gen MM (Human Mut. L. Momolog.), ubicado en el cromosoma 3p21. Codifica una proteína que interviene en uno de los mecanismos de reparación del ADN al detectar errores en las secuencias de nucleótidos por falta de complementariedad entre las dos hebras de ADN durante la fase de apareamiento. Esta proteína reconoce el par de bases erróneas, las separa y reemplaza por el par correcto, garantizándose la fidelidad del proceso de transmisión de la información genética. Se conocen al menos 6 genes reparadores; hmlh1, hmsh2, hmsh6, hmlh3, PMS1 y PMS2 [367] Metilación de genes implicados en la adhesión celular a) E-Cadherina: La Cadherina E (CDH1) ubicada en el cromosoma 16q22.1 corresponde a un tipo de molécula de adhesión fuertemente relacionada con el desarrollo del cáncer especialmente con aspectos asociados a la invasión y metástasis. El gen CDH1 codifica una glicoproteína transmembrana llamada

80 Introducción E-Cadherina que tiene un papel importante en el mantenimiento de la adherencia de célula a célula en tejidos epiteliales [368]. La E-Cadherina pertenece a la familia de moléculas de adherencia Ca2+ dependientes que permiten la asociación homofílica entre las células, manteniendo así la integridad del tejido. Las células están interconectadas por "moléculas adhesivas", entre las que se incluyen dos moléculas claves llamadas beta-catenina y E-Cadherina, que se encuentran sobre la superficie de las células. Cuando se produce una falta de función de estas moléculas de adhesión, la célula puede así "desprenderse" del tejido del que procede y migrar para formar otro tumor en un lugar distante invadiendo tejidos vecinos hasta entrar en el torrente sanguíneo adquiriendo capacidad metastatizante. Por tanto, la escasez de E-Cadherina dificultará que la célula se adhiera a las células adyacentes favoreciendo su migración a un nuevo tejido donde se podrá multiplicar y originar metástasis confiriéndole a la enfermedad un comportamiento invasivo. En el cáncer, se considera que como prerrequisito para que las células epiteliales malignas invadan el tejido cercano y lleven a cabo la diseminación metastásica, se requiere que se disocien fácilmente del resto de las otras células tumorales y a la vez, que se vea incrementada la movilidad celular de las células tumorales. Dichos eventos son favorecidos por la pérdida de la expresión de la E-Cadherina. Las alteraciones en la expresión de esta proteína, han sido relacionadas en varios tipos de cáncer y correlacionadas con rasgos patológicos como la pobre diferenciación tumoral, crecimiento infiltrante, la presencia de metástasis ganglionares y la menor supervivencia de los pacientes [369]. Las mutaciones de línea germinal en este gen predisponen en los individuos afectados al cáncer gástrico tipo difuso y cáncer de mama de inicio temprano. Recientemente, fue demostrado que el silenciamiento del gen CDH1 por la metilación de isla CpG de su región de promotora, ocurre en algunas líneas celulares de cáncer de mama [370]

81 Introducción Metilación de genes implicados en la proliferación celular a) Receptor de Estrógenos (RE): El receptor de estrógenos codificado por el gen ESR1, forma parte de la familia de factores de transcripción activados por ligandos nucleares que regulan la expresión de genes sensibles a estrógenos en distintas células diana. Entre sus funciones se encuentran la de controlar distintos procesos celulares incluyendo el crecimiento, la diferenciación y función del sistema reproductivo así como ser responsable del crecimiento, mantenimiento del esqueleto y el funcionamiento normal del sistema cardiovascular y nervioso. Concretamente en la mama es bien conocida que la interacción entre RE y su ligando el 17b-estradiol, tiene un papel importante no sólo en su desarrollo normal sino también en la carcinogénesis del cáncer de mama al poder estimular el crecimiento celular tumoral en aquellos tumores que expresan RE, lo que también representa un factor predictivo de respuesta al tratamiento hormonal en este subgrupo de pacientes [371]. Sin embargo sólo 2/3 de las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama expresan RE al diagnóstico, mientras que el otro 1/3 de los casos no lo expresan [372]. Incluso en algunas ocasiones, tumores que en el momento del diagnóstico son RE positivos pasan a ser RE negativos a lo largo de la enfermedad [373]. Esta ausencia de expresión de RE se asocia a tumores poco diferenciados, con mayor índice de proliferación celular, pobre respuesta al tratamiento hormonal y peor un pronóstico. El gen del RE se encuentra localizado en el cromosoma 6q25.1. Concretamente en su región promotora consta de una secuencia CpG ubicada en el exón 1, que en líneas celulares de cáncer de mama que expresan RE como MCF-7, T47-d y ZR75-1 se ha observado que se encuentran en estado no metilado al igual que ocurre en tejido normal. Sin embargo en líneas celulares de cáncer de mama RE negativo como MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, Hs578t y MCF-7/Adr se encuentra en estado metilado en más del 50% de los casos [374]. Por tanto analizar si la metilación de la región promotora de ERS1 representa uno de los mecanismos por el que acontece la pérdida de expresión de RE en pacientes diagnosticadas de cáncer de mama podría representar un importante hallazgo a desarrollar para

82 Introducción bloquear e incluso revertir dicho proceso en las pacientes con cáncer de mama [375]

83 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

84 Hipótesis y Objetivos 2.1. HIPÓTESIS. El cáncer es una enfermedad en la que las células sufren múltiples cambios genéticos y epigenéticos, cuyo resultado es la expresión aberrante de muchos genes. Recientes estudios han mostrado que es posible observar alteraciones específicas derivadas de la presencia de un tumor a través del estudio del ADN disuelto en suero de los pacientes diagnosticados de cáncer en etapas precoces de la enfermedad. La metilación de la región promotora de determinados genes, representan una alteración epigenética clave en la carcinogénesis por la cual se silencian genes a través de la unión de un grupo metilo al carbono 5 de las citosinas de las islas CpG situadas en su región promotora. Este suceso que otorga a las células tumorales ventajas en su crecimiento, ocurre en genes que en ausencia de enfermedad tumoral maligna se encuentran no metilados en sujetos sanos mientras que en pacientes diagnosticados de cáncer frecuentemente están metilados. El descubrimiento de conjuntos de genes específicamente metilados asociados a determinados tipos de cáncer, puede proporcionar nuevas vías en el diagnóstico precoz, el control evolutivo de los pacientes sometidos a tratamiento e, incluso, contribuir a la individualización de la terapéutica oncológica. También sabemos que los fenómenos epigenéticos de metilación de citosinas y de desacetilación de histonas, en cáncer, son farmacológicamente reversibles. Los datos, que en nuestra introducción hemos presentado, son demostrativos de que durante el proceso de oncogénesis, desde la iniciación a la progresión tumoral, distintos genes pueden sufrir cambios epigenéticos que ocasionan que la expresión de las proteínas resultantes de su trancripción esté ausente en el tumor. Esto puede tener consecuencias funcionales (desequilibrio de la homeostasis celular) y terapéuticas diversas (cambios en la respuesta a los agentes genotóxicos)

85 Hipótesis y Objetivos Nuestra hipótesis de trabajo se resume en los siguientes postulados: Es posible detectar en el suero de los pacientes oncológicos, ADN procedente de su tumor Existe una correlación entre las alteraciones genéticas, y epigenéticas, que se desarrollan en el tumor y las que se pueden encontrar en sangre periférica de los pacientes Los métodos de amplificación del ADN y el estudio del patrón epigenético de metilación, en pacientes con cáncer, puede proporcionar elementos de valor para el diagnóstico precoz, el pronóstico y el diseño racional de las estrategias terapéuticas en pacientes afectos de procesos neoplásicos malignos. Estudiar la incidencia, y la especificidad, de las anomalías de metilación en el ADN extraído de pacientes con cáncer de mama mediante su cuantificación por PCR en tiempo real y comprobar la posible utilidad, de los promotores de determinados genes aberrantemente metilados, como marcadores tumorales, y/o de agresividad, de la enfermedad, así como buscar parámetros indicativos de control tumoral, y de probabilidad de complicaciones asociadas al tratamiento, son los objetivos generales de este proyecto de investigación

86 Hipótesis y Objetivos 2.2. OBJETIVOS Poner a punto los procedimientos de análisis de los promotores de genes específicos mediante (MS-PCR) para identificar sobre las muestras de ADN extraídas al grupo casos y control, la presencia y el estado de metilación de: APC, sigma, RE, RARβ, y E-Cadherina. Preparar las muestras para estudiar específicamente y mediante amplificación (MS-PCR), la presencia de ADN procedente del tumor en el suero de pacientes y cuantificar, globalmente, el estado de metilación de las secuencias correspondientes a las islas CpG ensayadas Conseguir de pacientes que vayan a ser tratadas por cáncer de mama, antes de la cirugía, y previa petición de consentimiento informado, una muestra de sangre (5ml). De las muestras de suero se extraerá el ADN y se conservará convenientemente hasta que se proceda a su utilización. Además se conseguirán muestras de sangre (5 ml) procedentes de mujeres sin ningún tipo de enfermedad (Grupo Control) y de mujeres con patología mamaria benigna, mastitis fibroquística esencialmente, (Grupo Patología No-Tumoral) Cuantificar el ADN en suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama y del grupo control Valorar los datos obtenidos y las diferencias existentes al comparar el patrón de metilación encontrado en el suero de mujeres con cáncer con el que caracteriza a las mujeres libres de enfermedad. El estudio comparativo de estos resultados debe permitirnos definir cuáles, de entre los genes estudiados, son candidatos a ser marcadores tumorales del cáncer de mama Comparar los resultados obtenidos tras la valoración de promotores metilados en el suero de mujeres en las siguientes situaciones clínicas: a) Mujeres sin enfermedad alguna (grupo control). b) Mujeres con patología benigna de mama. c) Pacientes con cáncer de mama (grupo casos)

87 Hipótesis y Objetivos d) Mujeres tratadas de cáncer de mama sin evidencia de enfermedad tumoral clínica que durante el seguimiento desarrollan recurrencia de la enfermedad o metástasis. De esta manera pretendemos identificar cuales, de entre los genes seleccionados, pueden ser útiles como marcadores de la presencia y/o la extensión del tumor Estudiar la evolución del estado de metilación de esos genes antes de cualquier maniobra terapéutica y al final del tratamiento, para conocer si existe correlación o no con el estado clínico-patológico de curación en el caso de descenso de dicho nivel de metilación en suero de la paciente o de persistencia tumoral en el caso de ascenso o persistencia de los niveles de proteínas metiladas al final del tratamiento Correlacionar el perfil de metilación con las variables clínico-patológicas habitualmente empleadas en la clínica para conocer su relación con los factores pronóstico y predictivos de respuesta que se utilizan en la actualidad Contrastar la relación entre la presencia o ausencia de la proteína resultado de la metilación de la región promotora del gen RE (receptor estrogénico) en el suero de la paciente y el estado RE negativo en pieza tumoral, ya que la pérdida de expresión de RE en tumor está asociada con la metilación de su región promotora 5 CpG y a su vez con tumores de mama de peor evolución y pronóstico

88 MATERIAL Y MÉTODOS

89 Material y Métodos 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. DISEÑO El presente trabajo de investigación es un estudio de tipo prospectivo. Se ha efectuado sobre un grupo de pacientes diagnosticadas de cáncer de mama, que fueron incluidas y seguidas desde el momento inmediato a iniciar el primer tratamiento oncológico, que en todas ellas fue la cirugía, hasta la fecha final de estudio. Así mismo, se ha incluido un grupo control formado por dos subgrupos de mujeres. Un primer subgrupo constituído por mujeres sanas sin patología alguna de mama (Grupo Control Normal) y un segundo subgrupo formado por mujeres con patología benigna de mama (Grupo Control con Patología Benigna) PERIODO DE ESTUDIO El estudio comenzó en Mayo 2001 y concluyó en Julio de 2008; periodo de tiempo en el que hemos conseguido incluir un total de 107 pacientes con cáncer de mama y 110 mujeres sin cáncer de mama. Durante el tiempo de observación y de estudio, se realizó una primera extracción de 5 ml de sangre justo antes de la cirugía. Esta muestra se tomó en todas las pacientes incluidas en el grupo casos y en todas las mujeres que fueron incluidas en el grupo control. Al final del tratamiento se obtuvo una segunda muestra de sangre de 5 ml en aproximadamente, la tercera parte de las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama. En algunos casos se realizó una determinación intermedia que podría coincidir con el final del tratamiento con Radioterapia (RT) o de Quimioterapia (QT). En este subgrupo de pacientes cuando el tratamiento prescrito se completó se obtuvo una nueva muestra de sangre. En el grupo control sólo se realizó una única extracción sanguínea inicial

90 Material y Métodos 3.3. MATERIAL FUENTES DEL MATERIAL DE ESTUDIO Este trabajo de investigación, ha sido aprobado por el Comité Ético del Hospital Universitario Virgen de las Nieves y la Universidad de Granada. En todos los casos, fue condición indispensable que todas las pacientes, y las personas que se incluyeron como controles, conocieran y aceptaran participar en el estudio de forma voluntaria y que hubiesen firmado el documento del consentimiento informado que se facilitaba en la primera entrevista, antes de proceder a la extracción de la muestra de sangre. La inclusión de pacientes y la recogida de datos de las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama, se efectuó en el periodo de tiempo comprendido entre Mayo de 2001 y Junio de El procesamiento de las muestras y el análisis de los datos resultantes del estudio, incluyendo el seguimiento clínico de las enfermas, se realizó entre Junio 2006 y Mayo El seguimiento medio fue de 56 meses. El grupo control estuvo compuesto por mujeres sin patología oncológica reclutadas entre las mujeres que acuden al Servicio de Medicina Preventiva del Hospital Virgen de las Nieves. A dichas mujeres se les propuso entrar en el estudio y tras explicarles los objetivos y obtener su consentimiento se les realizó una pequeña historia clínica y se les extrajo una muestra de 5 ml de sangre. a) Fuentes de los datos biográficos, clínicos y anatomo-patológicos La recogida de los datos clínicos y biográficos de las pacientes, se realizó a través de tres fuentes: i) el análisis de las historias clínicas convenientemente archivadas en el Servicio de Documentación Clínica del Hospital Virgen de las Nieves; ii) la entrevista clínica que realizamos de forma sistemática a todas las pacientes que son valoradas en las consultas externas del Servicio de Oncología Radioterápica del mismo Hospital, y iii) los informes anatomopatológicos e inmunohistoquímicos aportados por el Servicio de Anatomía Patológica como documentos de diagnóstico y estudio del espécimen tumoral extraído tras la

91 Material y Métodos cirugía efectuada sobre las pacientes afectas de tumoraciones mamarias (Grupo Casos y Grupo Patología Benigna). Para proceder de forma sistemática al inicio de nuestro proyecto de Tesis Doctoral, diseñamos una ficha de recogida de datos en las que se incluían distintos parámetros, entre ellos: Datos Biográficos: - Edad. - Edad de la menarquia. - Edad primer embarazo. - Lactancia materna. - Fórmula obstétrica. - Edad de la menopausia. - Antecedentes familiares de primer y segundo grado con cáncer de mama. Datos Clínicos: - Localización por cuadrante del tumor. - Estadio clínico ctnm. Datos Anatomo-patológicos: - Histología. - Grado de diferenciación celular. - Estadio patológico ptnm. - Invasión perineural, rotura capsular ganglionar y trombos. endolinfáticos. Datos Inmuno-histoquímicos en tumor: - Cerb2/ FISH. - P53 - Receptor de Estrógenos (RE) y Receptor de Progesterona (RP)

92 Material y Métodos Datos referentes a los tratamientos administrados: - Tratamiento con Quimioterapia (QT). - Tratamiento con Radioterapia (RT). - Tratamiento Hormonal (HT). Las fichas fueron rellenadas de forma sucesiva a lo largo del tiempo incluyendo los correspondientes datos conforme se podía disponer de ellos. b) Fuente de datos analíticos Los datos analíticos se obtuvieron a partir de las muestras de sangre que se tomaron a las pacientes (grupo casos) y a las personas sanas (grupo control) incluidas en el estudio. El procesamiento de las muestras y los estudios epigenéticos sobre el ADN extraído de las muestras de sangre, se realizaron en el Laboratorio de Investigaciones Médicas Mora Lara del Hospital Universitario San Cecilio de Granada. La metodología seguida se resume a continuación; En todas las mujeres afectas de cáncer de mama las extracciones de sangre se realizaron en los quirófanos del Servicio de Ginecología antes de la cirugía y de la administración de cualquier medicación intravenosa. Posteriormente las sucesivas extracciones pertenecientes a cada paciente se efectuaron en la Unidad de Braquiterapia, en el Hospital de día del Servicio de Ginecología o en el Servicio de Oncología Médica del Hospital Virgen de las Nieves. Se recogieron muestras de un total de 107 mujeres con cáncer de mama (grupo casos), a las que se les realizó una primera extracción de sangre antes de cualquier maniobra terapéutica y una segunda extracción a las dos semanas de finalizar el tratamiento oncológico (QT o RT) indicado en cada caso. Las muestras sanguíneas una vez obtenidas, se guardaron a temperatura ambiente en recipientes que las preservaban de la luz y eran transportadas

93 Material y Métodos lo más rápidamente posible al laboratorio de Investigaciones Médicas Mora Lara del Hospital Clínico Universitario San Cecilio donde se procedía a la centrifugación de las mismas y la separación del suero para proceder a su posterior almacenamiento en congelador a una temperatura de -80 o C. Las muestras sólo se descongelaron para proceder a su análisis por PCR en Tiempo Real. Simultáneamente a la toma de estas muestras, se incluyeron en el estudio las muestras pertenecientes a 36 mujeres con patología benigna de mama y a 74 mujeres sin evidencia de patología mamaria alguna. Ambos grupos fueron reclutados de entre las mujeres que por cualquier causa (no tumoral) acudían al Servicio de Medicina Preventiva. Las muestras tomadas en estas mujeres fueron incluidas y estudiadas con los mismos métodos que se emplearon para el estudio de las personas pertenecientes al Grupo Casos. Sobre todas las muestras de suero se estudió, por PCR Cuantitativa en Tiempo Real, la concentración de amplificados de ADN representativos de la región donde se sitúa el promotor del gen de cada uno de los biomarcadores investigados en este trabajo. Mediante la técnica de PCR específica de metilación se cuantificó el nivel de hipermetilación en las islas CpG de la región de los promotores de los siguientes genes: Receptor de Estrógenos (RE), RAR-Beta, Sigma, APC y E-Cadherina INSTRUMENTACIÓN A lo largo del presente trabajo de investigación hemos utilizado entre otros, los instrumentos que a continuación se refieren: a) Centrífugas Centrífuga refrigerada: Para el proceso de extracción del ADN y para la concentración de las soluciones agitadas previamente se ha utilizado una

94 Material y Métodos centrífuga convencional marca Beckman, modelo TJ/6, dotada con una unidad adicional de refrigeración que permite centrifugar muestras a baja temperatura. La centrífuga consta de un rotor con soportes intercambiables para la centrifugación simultánea de un número de muestras variable (entre 4 a 120 muestras). La máxima velocidad de centrifugación depende del rotor utilizado. Micro-centrífuga: Para la técnica de modificación con bisulfito de las muestras de DNA se ha usado una centrífuga "microfuge" marca DESAGA de Sarstedt-ccuppe MC2, con capacidad para 18 muestras, programable en tiempo hasta 15 minutos y de una velocidad máxima de centrifugación de rpm. Centrífuga convencional: Se ha utilizado una centrífuga Orto (Clino) para la obtención de los sueros a partir de las muestras de sangre, trabajando a rpm durante 5-7 minutos. b) Baño termostatizado: Para someter las muestras a incubación a las temperaturas indicadas en el protocolo de modificación del DNA metilado se ha utilizado un baño digital marca Accu Block TM, con un bloc específico para tubos eppendorf de 1.5ml y otro para tubos eppendorf de 0.5ml, con capacidad para 48 muestras en total. c) Congeladores: Para el almacenamiento de muestras de suero y de DNA y DNA modificado se ha usado un arcón congelador, marca Selecta, modelo 455, capaz de alcanzar la temperatura de -80 C. La temperatura de operación durante todo el tiempo de almacenamiento de las muestras fue de -70 C. Para almacenar los reactivos, las enzimas y tampones se ha usado un congelador, marca Liebherr, capaz de alcanzar la temperatura de -20 C. Se han utilizado también congeladores y frigoríficos convencionales para el almacenamiento de otros reactivos y disoluciones

95 Material y Métodos d) ph-metro: Para la regulación del ph de las soluciones de tampón empleadas se ha usado un phmetro suministrado por la firma Orion Research, modelo 501, cuya precisión se estima en 0.01 unidades de ph. e) Balanza de precisión: Para la preparación de reactivos y disoluciones tampón se ha utilizado, cuando fue necesario, una balanza de precisión Mettler Toledo AB 104 capaz de alcanzar la décima de miligramo. f) Termociclador: Todas las reacciones necesarias para completar el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han realizado de manera automática utilizando un equipo de PCR a tiempo real icycler TM Optical Module Serial Nº 584BR (Bio Rad). Parte fundamental del protocolo es la utilización de un dispositivo para regular las modificaciones de la temperatura de la reacción y su control. Para ello el equipo cuenta con block capaz de admitir placas multi-well de 96 pocillos. Mediante el ordenador que controla el sistema se puede programar la temperatura y el tiempo de cada uno de los pasos de la reacción. g) Sistema de electroforesis: Se ha utilizado un equipo para electroforesis convencional suministrado por TDI, con cubeta de electroforesis sumergida, marca Minicell, modelo EC370 M, con el que nos fue posible separar, en función de su tamaño, fragmentos de ADN. El sistema incluye además de la cubeta de electroforesis, la fuente de alimentación (modelo Ps-1-VC), y permite alcanzar los 150 voltios, 500mA. Para la preparación del gel se ha utilizado el mismo soporte de la cubeta suministrada. El "pocillo" en el gel se prepara utilizando un "peine" apropiado (peines de 8 ó 12 pocillos). Como norma general se establecieron los parámetros de voltaje y tiempo siguientes: 100 V durante 30 minutos. h) Transiluminador: Para la visualización de geles teñidos con bromuro de etidio se ha usado un transiluminador ultravioleta 20 x 20 (312nm de longitud de onda) suministrado por TDI, modelo TC-312 A. En todos los casos, para la

96 Material y Métodos visualización de los amplificados se ha empleado una pantalla de protección UV facial completa. i) Sistema de reproducción fotográfica y video: Los geles, bajo iluminación ultravioleta, fueron fotografiados utilizando una cámara Polaroid, modelo CU y una cámara de vídeo SONY CCD IRIS, estando ésta última acoplada a un sistema de análisis de imagen. j) Análisis de imagen: Para la evaluación de los geles obtenidos en el desarrollo de los métodos descritos, se ha empleado un sistema de análisis de imagen compuesto por una videocámara, acoplada a un ordenador que almacena la información y la procesa utilizando el programa de análisis de imagen "Visilog Geles", comercializado por Microoptic. El programa permite analizar la distribución de bandas en los geles y estimar el tamaño de la molécula de DNA amplificado por comparación con marcadores de tamaño conocidos. k) Otros: Se han usado otros pequeños aparatos existentes en el laboratorio como son: microondas, picadora de hielo, vortex, etc REACTIVOS QUÍMICOS a) Etanol 99%, Pellets de NaOH, β-mercaptoetanol y Buffer TE: Para diluir los buffer AW1 y AW2 y para realizar el paso nº 5 del protocolo del Kit de extracción de DNA QIAAmp Blood Midi/Maxi, así como para la modificación con reactivo bisulfito sódico del ADN, se ha usado etanol al %. En el mismo protocolo del kit de modificación de DNA se usó hidróxido sódico 4M (Panreac Química SA), β-mercaptoetanol (Merck) y tampón TE (10mM Tris- HCl; 0.1nM EDTA; ph 7.5). b) Agarosa: En la preparación de geles para electroforesis se ha utilizado Agarosa (Promega) al 2-2.5%. c) Tampón de carga: Las muestras se cargaron en el gel junto con un tampón de carga compuesto por: azul de bromofenol 0.25% y sacarosa en 50mM de EDTA

97 Material y Métodos 40%. Este tampón se preparó a una concentración 6x añadiendo en el momento de la carga 1.5μl de tampón por cada 10μl de muestra. La sacarosa precipita la muestra hasta el fondo del pocillo impidiendo que se salga de la matriz del gel y el colorante nos permite observar el frente de la electroforesis. d) Bromuro de etidio: Para la tinción del DNA sometido a electroforesis en gel se ha utilizado una disolución de bromuro de etidio (Serva) de concentración 0.5μg/ml. Se incorporó tanto al gel como al tampón de electroforesis. e) Otros reactivos químicos: Para la regulación del ph de las disoluciones tampón se han utilizado, cuando fue necesario, disoluciones de HCl, NaOH y de ácido acético glacial para ajustar el ph del acetato sódico. f) Solución de ClONa al 10%: Todas las superficies del laboratorio sobre las cuales se trabajó así como todos los materiales que estuvieron en contacto con el suero, fueron lavados con una solución de hipoclorito sódico al 10% (que debe prepararse cada día); seguido de un aclarado con etanol al 70% o similar. Se extremaron las medidas higiénicas siendo obligado el uso de guantes en todo momento. Todos los restos bio-contaminantes (restos de sueros, células sanguíneas, etc.) se vertieron en contenedores destinados a tal fin para su posterior incineración REACTIVOS BIOLÓGICOS PARA PCR a) DNA estándar CpGenome TM : Para la preparación de las muestras que definieron la recta estándar en la PCR en tiempo real hemos empleado ADN universalmente metilado (Bio. Rad. Cat. nº 57821). Alícuotas preparadas a partir del vial se conservaron entre -15 o C y -25 o C hasta el momento de su uso. b) Extracción del ADN: Para la extracción del ADN se a empleado el Kit de QIAGEN QIAamp DNA Blood Midi/Maxi. (Cat. nº 51185). El kit contiene suficientes reactivos para 100 muestras de suero, sangre total, plasma, fluidos corporales o células mononucleares de sangre periférica a partir de las que se extrae el ADN siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante

98 Material y Métodos El producto de la extracción final queda en 200µl de solución de ADN con una concentración estimada de 3.0µg/ml de ADN cuando en el inicio de la extracción se parte de 2ml de suero. El proceso de extracción completa del ADN de las muestras se sitúa en torno a las dos horas de duración. Los reactivos que contiene el kit se enumeran a continuación: Producto Unidades QIAamp Midi Spin Columnas 100 Tubos recolectores (15ml) 100 Buffer AL 265ml Buffer AW1 (concentrado) 95ml Buffer AW2 (concentrado) 66ml Buffer AE 60ml QIAGEN Protease 4 viales El contenido del kit no incluye los reactivos químicos que se han descrito en el apartado anterior de protocolo de extracción del ADN. Todos los reactivos son estables a 4 o C. c) Modificación del ADN metilado: Para la modificación bisulfítica del ADN se ha utilizado el kit CpGenome TM Modification Kit (Cat. nº S7820) de CHEMICON International. Este sistema contiene suficiente reactivos para la modificación del ADN de aproximadamente 70 muestras de DNA. El producto final debe quedar en un volumen de, aproximadamente, 20µl de solución de ADN modificado. El tiempo necesario para realizar toda la secuencia de reacciones necesaria es de 28 horas. Los reactivos contenidos en el kit son: Producto Cantidad DNA Modification Reagent I 23g DNA Modification Reagent IV 200µl DNA Modification Reagent II 135g DNA Modification Reagent III 700µl

99 Material y Métodos El contenido del kit no incluye los reactivos químicos que se han descrito en el apartado anterior de protocolo modificación del ADN. Todos los reactivos son estables a -20 o C. d) Amplificación iq TM SYBR Green Supermix: Esta mix contiene los reactivos suficientes para la realización de la reacción de PCR, usando la enzima térmica itaq TM DNA Polymerase que es activada después de una etapa de desnaturalización inicial de 3 minutos a 95 o C. Contiene 100mM KCl, 40mMTris-HCl, ph 8.4, 0.4mM de cada uno de los dexosirribonucleótidos (datp, dctp, dgtp y dttp), itaq polymerase, 50 units/ml, 6mM MgCl 2, SYBR Green I, 20nM fluoroseína y estabilizantes. La adición de fluoroseína no afecta ni a la eficiencia ni a la sensibilidad de la reacción. Esta mezcla de reactivos (mix) contiene la cantidad suficiente para la realización de la reacción de PCR, usando la enzima térmica itaq TM DNA Polymerase. Las alícuotas de la mezcla se conservan a -20 o C para evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. A 4 o C una alícuota de supermix es estable durante 6 meses. Primers (cebadores): Las secuencias de los primers necesarios para amplificar el fragmento de ADN se obtuvieron de la literatura científica relacionada con el tema: E-Cadherina [376]; sigma [377]; retinoicacid-receptor- (RAR- ) [363]; adenomatous polyposis coli (APC) [378] y receptor de estrógenos-α (ER-α) [379]. Las secuencias de los primers utilizadas en este estudio se han incluido en la tabla 1:

100 Material y Métodos Primer Tabla1. Secuencias de los primers y datos de la reacción de PCR Secuencia Sentido/ Antisentido pb* Tª anniling Tª add o C E- Cad. 5 -GCGTTTGGTCGCGGAGTTC 5 -TTCCCTCAAAAATCGTCCCCAC o C no σ 5 -TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC 5 -CCTCTAACCGCCCACCACG o C 78 RAR-β 5 -GAACGCGAGCGATTCGAGT 5 -GACCAATCCAACCGAAACG o C no APC 5 -TATTGCGGAGTGCGGGTC 5 -TCGACGAACTCCCGACGA o C no REα 5 -GATACGGTTTGTATTTTGTTCGC 5 -CGAACGATTCAAAAACTCCAACT o C 74 *pb: pares de bases Marcadores de tamaño de peso molecular: Para determinar el tamaño en pb. (pares de bases) de los fragmentos amplificados para cada uno de los primers se usó el marcador: 50pb DNA Step Ladder (Promega nº G452A). Consiste en 16 fragmentos de ADN comprendidos entre 50pb y 800pb incrementándose su tamaño de 50 en 50pb. Se suministra a una concentración final de 340µg/ml. Viene disuelto en el tampón: 10mM Tris-ClH (ph 8.0), 1mM EDTA. Es estable a -20 o C MATERIAL FUNGIBLE a) Material plástico para el aislamiento del ADN, modificación bisulfítica del DNA metilado y amplificación por Real Time PCR Como norma general, todo el material fungible fue utilizado en condiciones de esterilidad y limpieza para asegurar la calidad de las reacciones previas y de la PCR final. Tubos de ensayo: Se usaron tubos de ensayo convencionales de plástico, de 10 ml de capacidad, y estériles

101 Material y Métodos Tubos eppendorf: Se usaron tubos de polipropileno de 1500μl, 500µl y de 200µl estériles de capacidad marca BIO-RAD para la realización de las técnicas biológicas. Puntas de pipetas con filtro (Tips): Estas puntas de pipetas son de plástico y estériles y están protegidas con filtros de algodón para evitar el arrastre de contaminación con amplificados de unas muestras a otras ya que dicho algodón ejerce de barrera contra los aerosoles que propagan los amplificados. Este material fue suministrado por Eppendorf y dispusimos de puntas para dispensar volúmenes comprendidos entre 1 a 10µl, 2 a 100µl, 20 a 300µl y 100 a 1000µl. Puntas de pipetas sin filtro: Se usaron puntas estériles de 1250μl de capacidad, suministradas por GILSON. Otro material: Micropipetas: se usaron micropipetas graduadas convencionales de volumen variable: 1-2.5µl, 2-20µl, µl, µl y µl; suministradas por Eppendorf. Igualmente se usó una pipeta suministrada por Gilson graduada de µl que permite dispensar alícuotas entre 10µl hasta 125µl. También se ha utilizado diverso material tanto de vidrio como de plástico para la realización de las técnicas. Entre este material cabe citar: gradillas, vasos de precipitado, probetas, matraces Erlenmeyer y otros dispositivos MÉTODOS Obtención de las muestras sanguíneas incluidas en el estudio El procedimiento empleado para la obtención de las muestras fue por venopunción, utilizando heparina sódica como anticoagulante. La cantidad de muestra obtenida por extracción fue de 10 ml que se depositaron en 2 tubos de bioquímica con 5 ml de muestra cada uno de ellos

102 Material y Métodos Posteriormente una vez en el Laboratorio de Investigaciones Médicas, las muestras fueron centrifugadas a 3500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. La cantidad de suero recuperada tras la centrifugación nunca fue inferior a 2ml por tubo, el suero resultante fue a continuación transferido a tubos eppendorf ( 1ml de suero por tubo eppendorf) donde permaneció almacenado a -80 o C hasta su análisis. A cada muestra se le asignó un número por orden de llegada para identificar a quién pertenecía cada una de ellas. Las muestras se almacenaron en el congelador a -80 o C hasta su análisis por PCR. Este mismo procedimiento fue utilizado para las muestras procedentes del grupo control. El suero obtenido de los grupos casos y control, fueron codificados y randomizados antes de los análisis y la interpretación de los resultados, para asegurar el adecuado tratamiento doble ciego de la información clínica y de los estudios de epigenética. Las muestras recogidas, correspondían a los siguientes grupos: a) Grupo Casos 1ª determinación: Se han conseguido las muestras sanguíneas a 107 pacientes diagnosticadas de cáncer de mama sin evidencia de enfermedad metastásica (grupo precirugía de casos), justo antes de realizar cualquier tratamiento oncológico. En todos los casos el primer tratamiento realizado fue la intervención quirúrgica. 2ª determinación: Se realizó unas 2 semanas tras finalizar el tratamiento oncológico indicado en cada caso fuese este cirugía seguida de quimioterapia y radioterapia, cirugía seguida de quimioterapia o cirugía seguida de radioterapia. En total de se recogieron 58 muestras de sangre

103 Material y Métodos b) Grupo Control sin patología benigna de mama Para el Grupo Control se han acumulado muestras de sangre de un total de 74 mujeres sanas elegidas al azar entre los profesionales del Hospital cuando acudían al Servicio de Medicina Preventiva para realizar la revisión anual reglamentaria, así como de otras mujeres sin antecedentes personales oncológicos, las cuales eran derivadas al Servicio de Medicina Preventiva por otros servicios del Hospital. De todas ellas se obtuvo el consentimiento informado, por escrito, y en todos los casos se facilitó la pertinente información a la persona antes de la extracción de la muestra. Las muestras de sangre, fueron tratadas con la misma metodología anteriormente expuesta en el grupo casos. c) Grupo control con patología benigna de mama Durante el tiempo de realización de nuestro estudio hemos podido recoger muestras de sangre de 38 mujeres con patología mamaria benigna que fueron intervenidas quirúrgicamente en el Hospital de dichas lesiones benignas. Estas 38 pacientes fueron elegidas al azar y constituyen el grupo de pacientes afectas de patología benigna de la mama. De ellas, 15 mujeres fueron diagnosticados de Fibroadenoma, 14 de Mastopatía fibroquística, 6 de Hiperplasia Ductal DIN 1 y un caso de Papiloma. En todos estos casos previamente a la exéresis de la lesión, se obtuvo el consentimiento informado y la muestra de sangre. Las muestras fueron codificadas y procesadas con la misma metodología comentada en los apartados anteriores Extracción del ADN de la muestra de suero de los sujetos Para la extracción del ADN se procede a la descongelación de las muestras y su tratamiento utilizando el Kit QIAamp Blood Kit (Quiangen Inc. CA) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Al final del procedimiento se obtiene un volumen aproximado de 200 µl de disolución de ADN cuya concentración se cuantificó por espectrofotometría (260/280) en todos los casos

104 Material y Métodos El procedimiento seguido se resume a continuación: 1.- Pipetear 200µl de proteasa en tubos de centrífuga de 15 ml. 2.- Adicionar 2ml de suero. 3.-Adicionar 2.4ml del buffer Al (buffer de lisis) y mezclar vigorosamente invirtiendo el tubo durante un minuto. 4.- Incubar a 70 o C durante 10 minutos. 5.- Adicionar 2ml de etanol (96-100%) y mezclar invirtiendo el tubo y agitando vigorosamente. 6.- Seguidamente transferir la mitad de la solución obtenida en el paso 5 a una columna de las suministradas en el kit con cuidado de no mojar los bordes. Cerrar la tapa y centrifugar a 3000rpm durante 3 minutos. 7.- Descartar el filtrado y colocar otro tubo de 15ml bajo la columna con filtro y transferir la solución restante obtenida en la etapa 5 sobre esta misma columna. Cerrar la tapa y centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos. 8.- Descartar el filtrado y colocar otro tubo de 15ml bajo la columna con filtro. 9.- Cuidando de no mojar los bordes, adicionar 2ml de Buffer AW1 y centrifugar a 5000rpm durante 1 minuto. 10.-Cuidando de no mojar los bordes, adicionar 2ml de Buffer AW2 y centrifugar a 5000rpm durante 15 minutos Descartar el filtrado y colocar la columna en otro tubo de 15ml Añadir 200µl de Buffer AE o agua destilada y estéril, cerrar la tapa, incubar a temperatura ambiente (15-25 o C) durante 5 minutos y centrifugar a 5000rpm durante 2 minutos

105 Material y Métodos 13.- Trasvasar el DNA así obtenido a un tubo eppendorf de 1400µl y congelar a -20 o C. Se obtuvo un volumen final de 200 µl. El ADN extraído, fue cuantificado por espectrofotometría. La cantidad de ADN extraído, medido en g/ml suero, fue ± (valor media ± error estándar de la media). Las muestras de ADN fueron almacenadas a -80 o C hasta posteriores análisis Modificación Bisulfítica Una vez extraído el ADN se procede a su modificación con bisulfito sódico. Este procedimiento descrito por Herman y col. [380] en 1996 consiste en la transformación de los residuos de citosina no metilados en uracilos al tratar el ADN con bisulfito, permaneciendo sin modificarse los residuos de citosina metilados. De esta forma las regiones genómicas metiladas y las no metiladas del ADN tras la modificación bisulfítica, son diferentes y por tanto distinguibles utilizando primers (cebadores) específicos. Las diferencias en el estado de metilación de la misma región del genoma pueden ponerse de manifiesto utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación (MS-PCR) o más recientemente el procedimiento de PCR cuantitativa específica de metilación (QMS_PCR). Para la modificación se ha utilizado el kit de reactivos CpGenome TM Modification (Chemicon Internacional). Como se muestra en el esquema que se presenta a continuación en la reacción bisulfítica todas las citosinas son desaminadas y desulfonadas convirtiéndose en uracilos, solamente las 5 metil citosinas permanecen inalteradas. Así, la secuencia del ADN tratado se diferenciará dependiendo de si el ADN está metilado o no. Además, las cadenas complementarias volverán a serlo después de la conversión de la citosina. Los primers usados en la técnica de PCR-metilación específica (MSP) pueden ser diseñados para amplificar expresamente una cadena no metilada (bisulfito sensible) y/o una cadena metilada (bisulfito resistente) basándose en estas diferencias químicamente inducidas

106 Material y Métodos Fundamento bioquímico de la modificación del ADN con bisulfito: ADN Metilado Modificación con Bisulfito sódico GGG GC m G GAC C m GC m G GGG GC m G GAU C m GC m G ADN No Metilado Modificación con GGG GCG GAC CGC G Bisulfito sódico GGG GUG GAU UGU G Los reactivos necesarios para esta reacción han sido enumerados en el apartado de material y métodos. El proceso fue realizado siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ADN necesario para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), puede obtenerse a partir de una cantidad inicial de material genético tan pequeña como 0.001µg. Del total del ADN extraído, un volumen de 100µl se trató con bisulfito sódico durante 16 horas, de esta manera se convirtieron las citosinas no metiladas en uracilos, quedando inalteradas las metilcitosinas. El ADN obtenido fue disuelto en 20µl de tampón TE y el ADN modificado fue cuantificado por espectrofotometría. La eficacia de recuperación de ADN después de la modificación bisulfítica ha estado en todas las ocasiones comprendida dentro del rango del 55-90%. En la reacción de cuantificación mediante PCR se ha utilizado 1 µl del ADN. Una vez modificado el ADN la muestra es estable durante al menos 6 meses a -80 o C. Como ADN de referencia para hacer cuantitativas las determinaciones se ha utilizado ADN universalmente metilado (ADN Universal Methylated CpGenome TM

107 Material y Métodos Nueva York, EE.UU) que fue tratado con bisulfito de la misma manera que las muestras. Tras cuantificar el ADN espectroscópicamente su concentración final se ajustó a 2 g/ml. A partir de esta muestra se preparó la curva de calibración utilizando diluciones sucesivas comprendidas entre 1/1 y 1/128 de la muestra original utilizando agua destilada de la máxima calidad y esterilizada. La reacción de PCR se realizó sobre placas de 96 pocillos. En ella se incluían las muestras de las pacientes, las sucesivas del ADN de referencia para construir la curva de calibración, dos controles positivos, y dos pocillos sin muestra que fueron etiquetados como controles negativos. El programa del sistema permite ajustar la curva de calibración a un modelo lineal y obtener los parámetros estadísticos del ajuste. En todos los casos, los coeficientes de correlación para las curvas de calibración fueron iguales o superiores a 0.98, las pendientes de las rectas de calibración se situaron en el rango de 3.02 a 3.2 y la eficacia de la PCR resultó estar entre el 85 y el 110%. A continuación se describe el protocolo de modificación de ADN con bisulfito. Se recomienda partir de 1µg de ADN aunque el método es sensible para una cantidad de 0,001µg. En todos los casos en nuestro estudio se ha partido de un volumen de 100µl de ADN con una cantidad comprendida entre 1-5µg/100µl. Este procedimiento experimental se describe brevemente a continuación Procedimiento experimental Reactivos (Día 1) Na OH 3M (se debe preparar en el momento de su utilización). Para ello se disuelven 1 g de Na OH en 8.3ml de agua. R.I: Reactivo de Modificación de ADN I (se debe preparar en el momento de su utilización). Para ello se usan 571µl de agua destilada a 227mg de R I. Se ajusta el ph a 5 (normalmente es suficiente con adicionar 20 µl de NaOH 3M por muestra). El ph se debe comprobar con papel indicador)

108 Material y Métodos Modificación (Día 1) En un eppendorf de 1.5 ml se ponen: 100 ml de muestra (que contenga al menos 1,0 µg de ADN), 2 µl de Reactivo de modificación de ADN (IV) y 7 µl de NaOH 3M; la mezcla se incuba durante 10 minutos a 37 o C al cabo de los cuales se adicionan 550µl de reactivo R.I (recién preparado) y se deja incubar a 50 o C durante horas. Reactivos (Día 2) Reactivo de Modficación II: Se prepara la disolución A utilizando 20 ml de agua y 1 µl de 2-mercapto-etanol. Para cada muestra se utilizan 750 µl de disolución A y 1.35 mg del reactivo R.II, se mezcla bien y se añade NaOH 20mM/90% Etanol (se debe preparar en el momento de su utilización). Para ello se mezclan 900µl de etanol absoluto con 93,4 µl de agua y 6,6 µl de NaOH 3M. Modificación (Día 2) Reactivo de Modificación III: Resuspender vigorosamente en el vórtex el DNA y adicionar a cada uno de los tubos 5 µl del mismo. Adicionar a cada uno de los tubos 750 ml de R.II y mezclar suavemente. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 1 minuto a rpm. Eliminar el sobrenadante. Adicionar al pellet 1 ml de etanol 70%. Agitar con vórtex. Centrifugar 1 minuto a rpm. Eliminar el sobrenadante. Repetir este paso tres veces más. Eliminar el sobrenadante del tercer lavado, centrifugar los tubos 3 minutos a rpm y la gota de líquido que ha quedado, eliminarla con una micropipeta con mucho cuidado

109 Material y Métodos Adicionar 50 µl de 20 mm NaOH/ 90% Etanol (recién preparado). Agitar con vórtex suavemente para resuspender el pellet e incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 1 minuto rpm y adicionar 1 ml etanol al 90%. Agitar con vórtex. Centrifugar 1 minuto rpm. Eliminar el sobrenadante. Repetir este paso una vez más. Una vez eliminado el sobrenadante del 2º lavado, centrifugar los tubos 5 minutos a rpm y la gota de líquido que ha quedado, eliminarla con una micropipeta. Adicionar 25 µl de tampón TE y agitar suavemente e incubar 15 minutos a o C para disolver el ADN. Centrifugar los tubos 3 minutos a rpm y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Congelar a -20 o C PCR en tiempo Real QMS-PCR utilizando SYBR Green Las reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real han sido realizadas utilizando el Kit iq SYBR-Green Supermix (Laboratorios de BioRad, Hercules, CA) según el protocolo del fabricante. La mezcla de reacción para la PCR cuantitativa en todos los casos contiene: l μl de ADN modificado de cada muestra (estándar o desconocida) como plantilla para cada PCR en tiempo real QMS-PCR. 0.5 μm de cada oligonucleótido (primer) μl de 2X SYBR Green Supermix (Bio-rad). Agua estéril hasta completar 25μl

110 Material y Métodos Todos los experimentos de PCR fueron realizados en un volumen de 25 l utilizando placas de 96 pocillos. Las secuencias de los primers, fueron elegidas a partir de publicaciones previas. La amplificación de ADN por PCR, se hizo de acuerdo con el siguiente procedimiento: Primera Etapa: 95 o C durante 3 minutos. Segunda Etapa: 40 ciclos compuestos por 30 segundos a 94 o C; 30 seg. a la temperatura de hibridación encontrada para cada uno de los promotores (ER-α: 62.2 o C; E-Cad: 62.0 o C; σ: 62.3 o C; RARβ: 63.5 o C; APC: 63.0 o C) y 30 segundos a 72. Tercera Etapa: Fue necesario un paso adicional (durante 30 seg.) a 74 o C para el promotor del gen ER-α y a 78 o C para σ. Mediante esta etapa se consigue disminuir la sobre-estimación del producto debida a la formación de dímeros de los primers utilizados (el producto del dímero permanece en forma de doble cadena cuando se alcanza una temperatura capaz de disociar el dímero). Cuarta Etapa: En todos los casos se realizó un análisis de la curva de disociación del ADN para comprobar la especificidad de los productos obtenidos. Para ello se estudió la fluorescencia relativa en un gradiente de temperatura comprendido entre 60 y 90 grados utilizando incrementos sucesivos de 0.5 o C. Quinta Etapa: El valor de fluorescencia correspondiente a cada muestra se convirtió en unidades relativas de ADN universalmente metilado (μg/ml) usando la correspondiente recta de calibración ajustada mediante el programa del equipo de PCR a tiempo real. De forma general, las medidas para trabajar con ADN requieren, entre otras consideraciones el uso exclusivo del material y reactivos para PCR; uso de guantes

111 Material y Métodos en todo momento y cambio frecuente (mejor los que no llevan talco pues éste inhibe la PCR) y material de contacto directo con la muestra (puntas de pipeta y tubos "eppendorf") esterilizados. Se trabaja siempre sobre hielo picado y extremando las precauciones para evitar posibles contaminaciones ambientales. Para preparar la mezcla de la reacción se trabaja en tubos cilíndricos de tapón verde esterilizados en óxido de etidieno. La mezcla de reacción para el caso de RE sería (tabla 2): Tabla 2. Volúmenes apropiados para la PCR de ESR1 ADN μl. P1 P2 SYBR Green I H 2 O μl. (50 pmoles) 0.22 μl (50 pmoles) 12.5 μl 11.0 μl Seguidamente se transfieren 24µl de dicha mezcla a cada uno de los pocillos de la placa multiwell, se incorpora 1µl de la solución de DNA modificado y se somete a agitación suave para, a continuación, someter la mezcla a la acción del termociclador. La señal de fluorescencia de amplificación en la PCR cuantitativa, se genera por la Mx SYBR Green Super Mix (BioRad, Hercules, CA)

112 Material y Métodos ANÁLISIS ESTADÍSTICO La asociación entre los 5 biomarcadores/genes estudiados, la presencia de cáncer de mama y la capacidad para discriminar entre mujeres con y sin cáncer de mama, ha sido analizada de acuerdo con el siguiente procedimiento: a) Análisis descriptivo de 3 grupos de mujeres (casos, controles y mujeres con enfermedad benigna) correspondiente a cada biomarcador, para expresar los resultados a través de su valor medio, medianas, percentiles, rangos y desviaciones estándar. El coeficiente de correlación de Spearman ha sido utilizado para analizar la asociación entre las variables de cada grupo. b) El test de Kruskal-Wallis con la corrección de Bonferroni ha sido utilizado para estudiar las diferencias entre los grupos (casos, control y enfermedad benigna de mama). c) El test de Mann-Whitney ha sido utilizado para analizar diferencias entre los valores medios encontrados en los grupos pacientes y control. d) El análisis de regresión logística multivariante ha sido utilizado para encontrar las variables significativas y la relación óptima entre ellas. e) Finalmente las curvas ROC (Receiver Operator Curve) han sido usadas para cuantificar la validez del test de diagnóstico tanto para cada biomarcador aislado como para la combinación de los que resultan significativos e independientes entre sí tras el estudio de regresión logística

113 RESULTADOS

114 Resultados 4. RESULTADOS 4.1. CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO CASOS Y CONTROLES INCLUIDOS EN ESTE ESTUDIO En esta memoria hemos incluido el estudio de un total de 217 mujeres. En todas ellas, tras informarles de la naturaleza y de los objetivos del estudio que estábamos realizando, y una vez obtenido su consentimiento, procedimos a tomar, por punción intravenosa, una muestra de sangre (aproximadamente 5 ml) que en se introdujo en un tubo con heparina como anticoagulante para, con la mayor rapidez posible, trasladarla al Laboratorio de Investigaciones Médicas del Hospital Clínico San Cecilio donde se realizaron los ensayos de PCR específica de metilación. En todas esas muestras se han cuantificado las concentraciones séricas de los promotores de ADN hipermetilados siguientes: APC, E-Cadherina, Sigma; RAR-beta, y Receptor de Estrógenos (RE). Las características generales de las personas incluidas en el estudio y su distribución de frecuencias se resumen a continuación ANÁLISIS DESCRIPTIVO UNIVARIANTE DEL GRUPO CONTROL Para obtener los valores de referencia de los niveles séricos previsibles en las muestras de sangre hemos incluido dos subconjuntos de pacientes. El primero de ellos constituido por un total de 74 mujeres sin evidencia de enfermedad mamaria alguna (Grupo Control Normal) y el segundo formado por 36 mujeres afectas de patología mamaria benigna (Grupo Patología Benigna). a) Datos Epidemiológicos-biográficos Del análisis de los datos obtenidos en este estudio, resulta que el prototipo de mujer tomada como control, es una mujer premenopáusicas de edad media superior a 40 años y, en la mayoría de los casos, sin antecedentes familiares de cáncer de mama

115 Resultados Edad: Para el grupo control el intervalo de edad abarca desde los 18 hasta los 79 años, siendo la edad media 43 años (desviación típica S= 13.51). La distribución de las personas incluidas en cada subgrupo de control en función de la edad se ha incluido en la tabla 3. La edad media por subgrupos en mujeres sin patología alguna fue 41años (22-64 años) y de 48 años (37-56 años) en el caso de considerar el subgrupo de mujeres con enfermedades benignas de la mama. La distribución de casos de acuerdo con 3 puntos de corte según edad se hizo para los siguientes intervalos: edad < 35 años, edad entre y, finalmente, edad 50 años. Tabla 3. Distribución de los controles según intervalo de edad (Total de mujeres incluidas como grupo control) Edad según intervalos Frecuencia Porcentaje < , , ,8 Subtotal 99 90,0 Desconocida 11 10,0 Total ,0 Antecedentes Familiares: Tuvieron antecedentes familiares de cáncer de mama el 19% de las mujeres incluidas como controles. De acuerdo a que la persona que padeció cáncer de mama fuese familiar de primer o segundo grado las mujeres de este grupo se distribuyeron como sigue: Antecedentes de Primer grado (madre y/o hermana): La proporción de mujeres en nuestro grupo control con antecedentes de cáncer de mama de primer grado fue del 6%. Si consideramos el subgrupo de mujeres con patología benigna esa misma proporción alcanzó la cifra del 8.6%. Antecedentes de Segundo grado (abuela, tía y prima): En el grupo control se encontró este antecedente en el 14.5% de las mujeres. Por subgrupos en el subgrupo con patología benigna la proporción fue de 23% y en el subgrupo de mujeres sanas del 11%

116 Resultados Edad de la menarquia: Para el grupo control la edad media de presentación de la menarquía fue de 12 años (9-18 años) con desviación típica 1.6 años. Edad de la menopausia: La edad media de presentación de la menopausia, fue de 50 años (30-59 años) con desviación típica 5.6 años. Estado menopáusico: El grupo predominante, en el momento de la toma de la muestra, fue de mujeres premenopáusicas (tabla 4). Tabla 4. Distribución de los controles según el estado menstrual Estado menopáusico Frecuencia Porcentaje PREMENOPAUSICA 72 72,0 POSTMENOPAUSICA 28 28,0 Total ,0 Desconocidos 10 Total 110 Gestación y edad de presentación: El 61% de los controles habían tenido algún embarazo a término antes de la toma de la muestra. La distribución por edad de presentación de los embarazos ha sido la siguiente: Edad del primer embarazo: La edad media de primer embarazo, fue de 25 años (18-38 años) con desviación típica 4.1. Edad del último embarazo: La edad media del último embarazo para el grupo casos fue de 30 años (20-44 años) con desviación típica. Lactancia materna: El porcentaje de controles que dieron lactancia materna fue de un 54%. Meses de lactancia materna: La mediana de meses de lactancia materna en el grupo control fue de 3 meses (1-24 meses)

117 Resultados b) Datos histopatológicos en grupo control con patología benigna En el grupo control se incluyeron 36 controles con patología benigna. El diagnóstico histopatológico final figura resumido en la tabla 5. Tabla 5. Distribución de los controles con patología benigna Histología Frecuencia Porcentaje Fibroadenoma 15 41,7 Mastopatía Fibroquística (MFQ) 14 38,9 Hiperplasia Ductal (DIN1) 6 16,7 Papiloma 1 2,8 Total ANÁLISIS DESCRIPTIVOS UNIVARIANTE DEL GRUPO CASOS a) Datos Epidemiológicos-biográficos A continuación hemos resumido de forma detallada los datos epidemiológicos y demográficos más relevantes. Esta información ha sido recogida de las historias clínicas del grupo de 107 pacientes afectas de cáncer de mama que se han incluido en este estudio. Del análisis de los datos extraídos en este estudio a partir de las historias clínicas, resulta que la paciente prototipo, es una mujer postmenopáusica de 58 años de edad media y sin antecedentes familiares de cáncer de mama en la mayoría de los casos. Edad: La edad oscila entre 32 y 88 años siendo la edad media de 58 años (desviación típica 12.4). Para estudiar la curva de distribución de la edad en nuestra serie se han elegido tres intervalos de edad diferentes que aproximadamente podemos denominar como: mujeres jóvenes, mujeres en edad perimenopáusica y mujeres postmenopáusicas. Así hemos encontrado las cifras que para mujeres con cáncer de mama menores a 35, entre 35 y 50 años y mayores a 50 años figuran en la tabla

118 Resultados Tabla 6. Distribución de las enfermas incluidas en la serie según los intervalos de edad Edad Frecuencia Porcentaje <35 3 2, , ,4 Total Antecedentes familiares: Tuvieron antecedentes familiares de cáncer de mama el 27% de las pacientes. De acuerdo a que la persona que padeció cáncer de mama fuese de primer o segundo grado los casos de nuestra serie se distribuyeron como sigue; Con antecedentes de primer grado (madre y/o hermana): En el grupo casos un 14% de las mujeres incluidas tuvieron familiares de primer grado afectos de cáncer de mama. Con antecedentes de segundo grado (abuela, tía y prima): En el grupo casos un 13% de las mujeres tuvieron familiares de segundo grado afectos de cáncer de mama. Edad de la menarquia: La edad media de presentación de la menarquia fue de 13 años (10-17 años) con desviación típica 1.4. Se eligieron dos puntos de corte uno para edad menor o igual que 11 años y otro para edad igual o mayor que 12 años (tabla 7). Tabla 7. Distribución de la serie según edad menarquia Edad menarquia Frecuencia Porcentaje Total ,1 Desconocidos Total

119 Resultados Edad de menopausia: La edad media de presentación de la menopausia, fue de 49 años (39-59 años) con desviación típica 3.8. Estado menopáusico: El grupo predominante fue de mujeres postmenopáusicas con un 69% (tabla 8). Tabla 8. Distribución de los casos según el estado menstrual Estado menopausia Frecuencia Porcentaje POSTMENOPAUSICA 74 69,2 PREMENOPAUSICA 33 30,8 Total ,0 Gestación y edad de presentación: El 93% de las pacientes habían tenido algún embarazo a término antes del diagnóstico. La distribución por edad de presentación fue; Edad primer embarazo: La edad media de primer embarazo, fue de 25 años (18-41años) con desviación típica 3.9. Edad del último embarazo: La edad media del último embarazo para el grupo casos fue de 32 años (20-42 años) con desviación típica 5.2. Lactancia materna: El porcentaje de pacientes que dieron lactancia materna fue de un 78% frente al 23% de los casos que no dieron lactancia materna. Meses de lactancia materna: La mediana de meses de lactancia materna en el grupo casos fue de 5.76 meses (S: 5.11). Tabla

120 Resultados Tabla 9. Distribución de los datos Epidemiológicos-biográficos de casos y controles Casos Controles Media S* Media S* Edad media 58 años (32-88) años (18-59) 13.5 Antecedentes 27% 19% Familiares 1 er Grado 14% 6% 2 º Grado 13% 14.5% Edad Menarquia 13 años (10-17) años (9-18) 1.6 Estado Menopáusico Premenopáusicas 30.8% 72% Postmenopáusicas 69.2% 28% Edad Menopausia 49 años (39-59) años (30-59) 5.6 Edad primer embarazo 25 años (18-41) años (18-38) 4.1 Edad último embarazo 32 años (20-42) años (30-44) 5.3 Lactancia materna 78% 54% Meses lactancia materna 5.8 meses (1-36) meses (1-24) 4.7 *S: Desviación típica. b) Datos referentes a las características clínicas del tumor Exponemos de forma detallada los datos referentes a las características clínicas de los tumores de mama de las 107 pacientes incluidas en este trabajo. Localización del tumor y cuadrante: Por localización el tumor se presentó en el 48.6% (52 pacientes) en la mama derecha y el 51.4% (55 pacientes) en la mama izquierda. En cuanto a la situación del tumor en la mama dividida por cuadrantes, hay un claro predominio de los cuadrantes externos con 57 casos (53.3%) del total, especialmente el súpero-externo con un 29% de los casos (tabla 10)

121 Resultados Tabla 10. Distribución de los casos según localización del tumor por cuadrante Cuadrante Frecuencia Porcentaje CSE 49 29,0 CSI 8 4,7 CIE 8 4,7 CII 6 3,6 OTROS 36 21,3 Total CSE: Cuadrante Súpero Externo; CIE: Cuadrante Infero Externo; CSI: Cuadrante Súpero Interno; CII: Cuadrante Infero Interno; OTROS: Unión de cuadrantes superiores, unión de cuadrantes inferiores y retroareolar. Estadio clínico: El estadio clínico más frecuente con el que se diagnosticó el tumor a las pacientes en nuestro estudio fue el estadio IIA (T2N0M0) de la American Joint Committe on Cancer (AJCC) con un porcentaje del 43% (tabla 11). Tabla 11. Distribución de los casos según Estadio Clínico Estadios Clínicos Frecuencia Porcentaje ESTADIO ,0 ESTADIO I 32 29,9 ESTADIO IIA 46 43,0 ESTADIO IIB 9 8,4 ESTADIO IIIA 3 2,8 ESTADIO IIIB 2 1,9 Total c) Datos referentes al tipo de cirugía La técnica quirúrgica preferentemente realizada fue la tumorectomía con margen de seguridad y linfadenectomía axilar homolateral en el 73.8%. Sólo se realizó mastectomía radical modificada tipo Madden en el 6.5 % (tabla 12). En cuanto al vaciamiento axilar, se realizó en el 93.5% del total, extirpándose una media de 15 ganglios por caso (Desviación típica S, 5.8). Máximo: 39 ganglios. Mínimo: 10 ganglios

122 Resultados Tabla 12. Distribución de los casos según Tipo de Cirugía Técnica quirúrgica Frecuencia Porcentaje CONSERVADORA 79 73,8 RADICAL 21 19,6 TUMORECTOMIA 7 6,5 Total d) Datos referentes al resultado anatomo-patológico En este apartado describimos las características anatomo-patológicas encontradas tras el estudio histológico del tumor y de los ganglios aislados. Histología: El tipo histológico de cáncer de mama más frecuente encontrado en el estudio antomo-patológico de la muestra fue el carcinoma ductal infiltrante con un 76.6% de los casos seguido del carcinoma lobulillar infiltrante con un 8.4% de los casos. El resto de variedades histológicas suponían un 14% (tabla 13). Tabla 13. Distribución de los casos según la histología del tumor Histología Frecuencia Porcentaje C.DUCTAL.INFILTRANTE C.LOBULILLAR INFILTRANTE 9 8,4 CA. APOCRINO INVASOR 1 0,9 CA. COLOIDE 4 3,7 FIBROHISTIOCITOMA MALIGNO 1 0,9 MIXTO 5 4,7 CA. MEDULAR 1 0,9 T.PHYLLODES MALIGNO CA. METAPLASICO 1 0,9 EPIDERMOIDE 1 0,9 Total Grado de diferenciación histológica: El grado de diferenciación GII o moderadamente diferenciado fue el más frecuente encontrado en este trabajo. Hubo un 11.21% de valores desconocidos (tabla 14)

123 Resultados Tabla 14. Distribución de los casos según Grado de diferenciación histológica del tumor Grado de diferenciación Frecuencia Porcentaje GI 20 18,7 GII 40 37,4 GIII 35 32,7 NO G 12 11,2 Total Tamaño Tumoral: El tamaño medio más frecuente fue menor de 2 cm en el 68% de los casos en nuestra serie de casos (tabla 15). Tabla 15. Distribución de los casos según el tamaño tumoral Tamaño Frecuencia Porcentaje T1 ( 2 cm) 62 57,9 T2 (2-5 cm) 38 35,5 T3 (> 5 cm) 3 3,5 T4 4 3,5 Total ,0 Afectación Ganglionar: No hubo afectación ganglionar en la mayoría de las pacientes de nuestra serie 63.6%. En las que sí hubo afectación ganglionar, la mayoría fueron N1 (1-3 ganglios afectos). Tabla 16. Tabla 16. Distribución de los casos según afectación ganglionar Ganglios afectos Frecuencia Porcentaje N0/ Nx 68 63,6 N1 (1-3 g) 32 29,9 N2 ( 4g) 7 6,5 Total Ruptura Capsular: Se observó en el análisis anatomo-patológico del vaciamiento axilar la presencia de ruptura capsular en el 10% de los casos (tabla 17)

124 Resultados Tabla 17. Distribución de los casos según la presencia de ruptura capsular Ruptura Capsular Frecuencia Porcentaje NO SI NO DISECCION 7 Total Trombos Tumorales Endolinfáticos: La presencia de trombos tumorales endolinfáticos se describió en el 6% de nuestra serie (tabla 18). Tabla 18. Distribución de los casos según la presencia de trombos endolinfáticos Trombos endolinfáticos Frecuencia Porcentaje NO SI 6 6 NO DISECCION 7 Total Infiltración perineural: La presencia de trombos tumorales endolinfáticos se describió en el 1% de nuestra serie (tabla 19). Tabla 19. Distribución de los casos según la presencia de Infiltración perineural Infiltración perineural Frecuencia Porcentaje NO SI 1 1 NO DISECCION 7 Total Estadio Patológico: El estadio patológico más frecuente tras el tratamiento quirúrgico fue el estadio IIA (T2N0M0) de la American Joint Commite on Cancer (AJCC) con un porcentaje del 43% (tabla 20)

125 Resultados Tabla 20. Distribución de los casos según Estadio Clínico Estadios AJCC Frecuencia Porcentaje ESTADIO ,3 ESTADIO I 34 31,8 ESTADIO IIA 31 29,0 ESTADIO IIB 19 17,8 ESTADIO IIIA 7 6,5 ESTADIO IIIB 4 3,7 Total ,1 2* 1,9 Total ,0 *Fibrohistiocitoma maligno y Ca. Phyllodes. Estado de Receptores de Estrógenos en el tumor (RE): La mayoría fueron receptor estrogénico positivo 65.4% (tabla 21). Tabla 21. Distribución de los casos según estado de RE Receptor Estrogénico Frecuencia Porcentaje RE POSITIVO 70 65,4 RE NEGATIVO 27 25,2 NO INDICADO 10 9,3 Total ,0 Estado de Receptores de Progesterona en el tumor (RP): La mayoría de las pacientes fueron receptor de progesterona positivo 55.1% (tabla 22). Tabla 22. Distribución de los casos según estado de RP R. Progesterona Frecuencia Porcentaje RP POSITIVO RP NEGATIVO NO INDICADO 11 10,3 Total ,0 Receptores hormonales en el tumor (RH): El estado del receptor hormonal en el tumor teniendo en cuenta tanto RE como RP fue predominantemente positivo 75% (tumores hormono-sensibles). Tabla

126 Resultados Tabla 23. Distribución de los casos según estado de RH R. Hormonal Frecuencia Porcentaje NO HORMONOSENSIBLE 22 20,6 SÍ HORMONOSENSIBLE 75 70,1 NO INDICADO 10 9,3 Total ,0 Estado del Cerb2: Los tumores que no sobreexpresaban Cerb2 fueron más frecuentes que los que sí lo hacían (tabla 24). Tabla 24. Distribución de los casos según estado Cerb2 Estado Cerb2 Frecuencia Porcentaje Cerb2 NEGATIVO 78 72,9 Cerb2 POSITIVO 19 17,8 NO INDICADO 10 9,3 Total ,0 Fenotipo Molecular: De acuerdo con la clasificación molecular del cáncer de mama el subtipo más frecuente en nuestra serie fue el fenotipo Luminal A con un 36.4% (tabla 25). Tabla 25. Distribución de los casos según Fenotipo Molecular Fenotipo Molecular Frecuencia Porcentaje LUMINAL A LUMINAL B TRIPLE NEGATIVO HER Desconocidos Estado del P53: En nuestra serie la mayoría de los casos fueron P53 negativos (tabla 26)

127 Resultados Tabla 26. Distribución de los casos según estado p53 P53 Frecuencia Porcentaje P53 NEGATIVO 51 47,7 P53 POSITIVO 44 41,1 NO INDICADO 12 11,2 Total ,0 e) Datos referentes al tratamiento Adyuvante: Quimioterapia: Se administró QT adyuvante al 63.6% de los casos (68 casos). El esquema de QT más empleado fue EC en el 23.8% de los casos seguido de EC-Taxol en el 14.3% (tabla 27). Tabla 27. Distribución de los casos según Esquema de QT Esquema QT Frecuencia Porcentaje EC EC-TAXOL CMF FEC ADM CDDP+5-FU NO QT Sub-Total Perdidos Total EC: Epirrubicina+ Ciclofosfamida; CDDP+ 5FU: Cisplatino + 5 Fluorouracilo; EC-T: Epirrubicina+ Ciclofosfamida seguido de Taxol; ADM: Adriamicina; CMF: Ciclofosfamida+ Metrotezate+ 5 Fluorouracilo; FEC: 5 Fluorouracilo+ Epirrubicina+ Ciclofosfamida. Radioterapia Externa (RTE): Se realizó radioterapia externa en el 90% de los casos, siendo la irradiación exclusiva con dos campos tangenciales el campo más realizado en un 77% de los casos. El fraccionamiento estándar de 2 Gy por sesión durante 5 días a la semana hasta completar 50 Gy de dosis total, fue el fraccionamiento que se empleó en el 100% de los casos. De igual forma en cuanto a la energía utilizada en los tratamientos con RTE todos ellos fueron

128 Resultados realizados en un Acelerador Lineal de Electrones (ALE) con una energía de 6 Mv (tabla 28). Tabla 28. Distribución de los casos según campos de RT realizados Campos RT Frecuencia Porcentaje TANGENCIALES TANGENCIALES-SC 8 7,5 TANGENCIALES-SC-AP 9 8,4 NO RT 11 10,3 Sub-Total 105 Perdidos Total Sobreimpresión: La sobreimpresión se realizó en el 52.3% de los casos. De ellos el 57.14% lo hicieron mediante la aplicación de braquiterapia recibiendo una media de dosis de 16Gy (tablas 29 y 30). Tabla 29. Distribución de los casos según Técnica de Sobreimpresión Tipo sobreimpresión Frecuencia Porcentaje NO SOBREIMPRESION BRAQUITERAPIA ELECTRONES Sub-Total 104 Perdidos Total Tabla 30. Distribución de los casos según Dosis de Sobreimpresión Dosis Sobreimpresión Frecuencia Porcentaje , , , , ,8 Total ,0 Hormonoterapia (HT): Realizaron tratamiento hormonal tras finalizar el tratamiento con QT y RT el 79% de las pacientes (83 pacientes). El esquema de

129 Resultados hormonoterapia más empleado fue con inhibidores de la aromatasa en un 61.77%%, seguido de antiestrógenos con un 37% (tabla 31 y 32). Tabla 31. Distribución de los casos según tipo de Hormonoterapia Hormonoterapia Frecuencia Porcentaje SI NO Sub-Total 105 Desconocidos Total Tabla 32. Distribución de los casos según tipo de Hormonoterapia Tipo de Hormonoterapia Frecuencia Porcentaje NO HT ANATROZOL TAMOXIFENO 28 26,2 LETROZOL 9 8,4 TOREMIFENO 2 1,9 GOSERELINA Total 104 Perdidos Total f) Datos del seguimiento. Recidiva locorregional: No hubo ningún caso de recidiva local en nuestra serie. El 3.7% recayeron a nivel ganglionar en el área áxilo-supraclavicular (tabla 33). Tabla 33. Distribución de los casos según Recaída locoregional Recaída locoregional Frecuencia Porcentaje LOCAL 0 0 REGIONAL 4 3,

130 Resultados Recaída a distancia: Un 12% de los casos recayeron a distancia en algún momento del seguimiento. El 88% restante no presentó recaída a distancia en nuestro estudio (tabla 34). Tabla 34. Distribución de los casos según Recaída a distancia Recaída a distancia Frecuencia Porcentaje NO 94 87,9 SI 13 12,1 Total ,0 Localización de las metástasis: La mayoría de las metástasis a distancia se presentaron a nivel óseo y hepático (tabla 35). Tabla 35. Distribución de los casos según localización metástasis Recaída Frecuencia Porcentaje ÓSEAS 6 1,9 HEPÁTICAS CEREBRALES PULMONARES MAMA CONTRALATERAL Supervivencia libre de enfermedad (SLE): La supervivencia libre de enfermedad para las pacientes de nuestro estudio fue de 51 meses de media (Máximo: 74. Mínimo: 4.5 Desviación típica: 18.5). A los 2 años de seguimiento el 100% de los casos estaban libres de enfermedad y a los 5 años lo estaban el 87%. Si analizamos el patrón de fallo tanto locoregional como a distancia, diagnosticado durante dicho seguimiento la tasa de fallo fue de 12%, siendo el tiempo mínimo de recaída de 4.5 meses y el máximo de 48 meses (4 años). Figura

131 Resultados Supervivencia Libre Enfermedad 1,02 1,00,98,96,94,92,90,88,86,84,82,80,78,76 Función de,74,72,70 supervivencia Censurado Seguimiento en meses Figura 4.- Curva de supervivencia libre de enfermedad (actuarial) para el conjunto de mujeres afectas de cáncer de mama incluidas en este estudio. Estado al final del estudio: Si analizamos la situación de los pacientes al final del estudio; encontramos un porcentaje global de éxitus del 12% de los casos. El 8.4% fue específicamente por tumor y el resto por enfermedades intercurrentes. El 94% de los casos estaban vivas siendo el 84% de los casos pacientes vivas libres de enfermedad y el 3.7% de pacientes vivas pero con enfermedad (tabla 36). Tabla 36. Distribución de los casos según Situación al final del Estudio Situación final estudio Frecuencia Porcentaje VIVO SIN ENFERMEDAD 90 84,1 VIVO CON ENFERMEDAD 4 3,7 EXITUS TUMOR 9 8,4 EXITUS OTRAS CAUSAS 4 3,7 TOTAL ,

132 Resultados Supervivencia Global (SG): La supervivencia global media fue de 52.6 meses (Mínimo: 4.5. Máximo: 74. Desviación estándar S: 17.3) con una tasa de muertes por tumor del 12% (figura 5). Función de Supervivencia Global 1,02 1,00,98,96,94,92,90,88,86,84,82,80,78,76 Función,74 de supervivencia,72,70 Censurado Seguimiento en meses Figura 5. Supervivencia global (actuarial) para la serie de mujeres afectas de cáncer de mama incluidas en este estudio

133 Unidades Relativas Unidades Relativas Joaquina Martínez-Galán Resultados 4.2. METILACIÓN DE LOS PROMOTORES DE LOS GENES ESTUDIADOS EN ESTE TRABAJO Determinación del estado de metilación en el grupo control Para realizar esta parte del trabajo experimental se han dispuesto de muestras de sangre extraídas a 110 mujeres sin cáncer de mama. De ellas 74 muestras pertenecían a mujeres sanas sin patología de mama benigna y 36 a mujeres sanas con algún tipo de patología tumoral benigna de mama. Las muestras fueron analizadas por PCR cuantitativa en Tiempo Real. Así, a partir de los valores relativos de fluorescencia, y utilizando la correspondiente recta de calibración, obtuvimos, para cada una de las muestras estudiadas, un valor cuantitativo cuya cifra estaba comprendida entre 0 y 2 ng/ml de promotor metilado. Con estos valores hemos construidos los histogramas de la figura Control Normal 0.35 Enfermedad tumoral benigna RE E-Cadh RAR- APC Biomarcador RE E-Cad RAR- APC Biomarcador Figura 6. Valores medios y error estándar de la media de cada uno de los biomarcadores metilados estudiados. Los datos corresponden a los grupos de personas sin evidencia de enfermedad tumoral mamaria alguna (Grupo Normal) y a las personas afectas de tumoraciones benignas de la mama (Grupo Patología Benigna)

134 Unidades Relativas Unidades Relativas Unidades Relativas Joaquina Martínez-Galán Resultados Determinación del estado de metilación en el grupo de pacientes con cáncer de mama Los datos incluidos en la siguiente figura resumen en idéntica forma gráfica, los valores medios y el error estándar de la media para el grupo de pacientes con cáncer de mama en dos situaciones distintas: a) antes de la cirugía y b) al término del tratamiento. a) Pacientes con Cáncer b) Pacientes tras tratamiento RE E-Cadh RAR- APC RE E-Cad RAR- APC Biomarcador Biomarcador Figura 7. Histograma de los valores encontrados para cada uno de los biomarcadores estudiados antes y después del tratamiento de las pacientes afectas de cáncer de mama Análisis inicial de los resultados Con el fin de simplificar esta parte del análisis de resultados, sobre las cifras cuantitativas obtenidas del análisis del nivel de metilación de los genes analizados, hemos elegido un valor de corte (véase línea roja punteada en las Casos VP FN FP VN Control Figura 8. "Distribución de los valores de la concentración sérica del promotor aberrantemente metilado del gen del RE. La línea roja muestra un umbral de decisión. En base a él se distinguen las fracciones: VP = verdadero positivo; FN = falso negativo; FP=falso positivo y VN = verdadero negativo" aberrantemente metilado del gen del RE. La línea roja muestra un umbral de decisión. En base a él se distinguen las fracciones: VP = verdadero positivo; FN = falso negativo; FP=falso positivo y VN = verdadero negativo" figuras 8 y 9, que nos permite clasificar los resultados como: a) presencia en el suero del promotor aberrantemente metilado en cantidad suficiente como para poder ser definida como positiva, es decir patológica y b) presencia

135 Unidades Relativas Joaquina Martínez-Galán Resultados de este biomarcador por debajo del valor mínimo para ser considerado como nivel fisiológico de metilación. En este segundo caso la muestra será clasificada como negativa. Para ello, se tomó como punto de corte para distinguir entre nivel de metilación fisiológica y patológica de los promotores de los genes: Receptor de estrógenos (RE), E-Cadherina, APC, Rar-βeta y Sigma, el límite inferior del intervalo de confianza del 95% de la media calculado a partir de los resultados cuantitativos obtenidos del grupo control sano, y diremos, que las muestras de aquellos controles con resultados por encima de este límite se considerarían metilados positivos (patológicos) y aquellos otros por debajo del umbral elegido, se considerarían metilados negativos (fisiológicos). La tabla 37 contiene un resumen de los parámetros estadísticos de tendencia central para el conjunto de valores encontrados: media, desviación típica, error estándar e intervalo de confianza del 95% en la serie de controles sanos y controles con patología benigna Casos VP FN FP VN Control Figura 9. Distribución de los valores de la concentración sérica del promotor aberrantemente metilado del gen del sigma. La línea roja muestra un umbral de decisión. En base a él se distínguen las fracciones: VP= verdadera positiva; FN= falsa negativa; FP=falsa positiva y VN= verdadera negativa

136 Resultados Tabla 37. Estadística descriptiva de los biomarcadores estudiados en los grupos control CONTROLES NORMALES CONTROLES CON PATOLOGIA BENIGNA GENES Media S* e* IC 95% Media S* e* IC 95% APC E-Cadh s Rar-β RE S* : desviación típica. e *: S/ n. error típico de la media De acuerdo con los resultados obtenidos se tomó como punto de corte para distinguir entre metilación patológica de metilación fisiológica, el límite inferior del intervalo de confianza del 95% de la media obtenida para cada uno de los biomarcadores estudiados del grupo de mujeres sin evidencia de enfermedad tumoral alguna (Controles Normales). Es cierto que el umbral elegido puede ser criticado como arbitrario, pero consideramos que, para esta parte descriptiva de nuestro estudio, es un nivel de corte razonable. Estos puntos de corte como se muestran en la tabla 37 fueron; APC: 0.01, E-Cadherina: 0.01, Sigma: 0.04, Rar-βeta: 0.01, RE: Este primer análisis responde a la pregunta: Es diferente el nivel de biomarcador encontrado en el grupo de pacientes con cáncer de mama del que caracteriza a las mujeres sin evidencia de enfermedad tumoral alguna?; si esto es así, Con qué seguridad podemos considerar que el biomarcador discrimina entre una persona afecta de cáncer y otra que está sana? Las figuras 8 y 9 muestran la representación en puntos dispersos de los valores encontrados para las medidas cuantitativas de metilación del promotor del gen RE y del promotor del gen sigma para los grupos cáncer y control normal. En ambas figuras con una línea punteada se ha dibujado el umbral de decisión. Mediante este umbral pretendemos distinguir la presencia y la ausencia

137 Resultados de cáncer de mama, y diremos que el marcador nos informa correctamente cuando a valores superiores al marcado le corresponden pacientes con cáncer, mientras que encontramos que los valores inferiores al considerado como límite se asocian a personas sin enfermedad. Hablaremos así de Verdadero Positivo (VP), Falso Negativo (FN), Verdadero Negativo (VN) y Falso Negativo (FN). Nótese que la modificación del umbral de decisión, hacia arriba o hacia abajo, cambia de manera importante el porcentaje global de aciertos y de fallos (verdaderos y falsos resultados positivos y verdaderos y falsos resultados negativos, del test). La tabla 37 nos permitirá definir ese primer nivel de discriminación. Teniendo en cuenta esos valores los resultados del nivel de metilación cuantificado en el suero para los biomarcadores estudiados en el grupo de personas tomadas como Controles Normales y en el grupo de mujeres con Patología Mamaria Benigna fueron los que se resumen en la tabla 38. Tabla 38. Distribución de Metilación en el grupo control (+/-). CONTROL NORMAL CONTROL CON PATOLOGÍA BENIGNA Positivos Negativos Positivos Negativos Genes % N % n % N % N APC E-Cadherina sigma Rar-βeta RE n: número de casos. %: porcentaje de casos Determinación del estado metilación en el grupo de mujeres afectas de cáncer de mama Procediendo de manera análoga a lo expuesto en párrafos anteriores en este apartado describimos los resultados obtenidos, para cada uno de los biomarcadores epigenéticos analizados, en el grupo de mujeres afectas de cáncer de mama. El resumen de los resultados obtenidos se ofrece en la tabla 39. En ella

138 Resultados que se incluyen los parámetros estadísticos habituales, Media, Desviación típica, Error típico de la media e intervalo de confianza del 95% de la media. Tabla 39. Estadística descriptiva metilación promotores: Casos CASOS GENES Media S* e* IC 95% APC E-Cadherina sigma Rar-βeta R. Estrógenos 0, S*: desviación típica. ( e*: S/ n): error típico de la media El resultado cuantitativo del análisis se calificó como positivo (o negativo) tomando en consideración el umbral de decisión elegido sobre el grupo de mujeres sin evidencia de enfermedad mamaria alguna. Para ello se dispusieron de un total de 107 muestras de sangre procedentes de mujeres con diagnóstico de certeza de padecer cáncer. Todas las muestras fueron extraídas antes de realizar ningún tratamiento oncológico. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 40. Tabla 40. Distribución de Metilación en el grupo casos (+/-) Positivos Negativos Genes Porcentaje % Frecuencias Porcentaje % Frecuencias APC E-Cadherina sigma Rar-βeta R. Estrógenos Los valores de metilación se consideraron positivos (patológicos) cuando la cifra superó los niveles siguientes: APC: 0.01, E-Cadherina: 0.01, Sigma: 0.04, Rar-βeta: 0.01, R.E: Por el contrario, la metilación se consideró negativa (fisiológica) cuando la cifra obtenida para una paciente concreta quedaba por debajo de ese nivel

139 Resultados Una vez definido el criterio, y asignado un estado de metilación (positivo o negativo) para cada uno de los distintos biomarcadores epigenéticos estudiados, es posible conocer si existen diferencias en cuanto a la presencia (y al nivel) de la metilación que se cuantifica en las muestras de suero de las personas incluidas en cada uno de los grupos considerados. Para ello utilizando los datos de las tablas 38 y 40, para construir simples tablas de contingencia y aplicar el test exacto de Fisher que nos permite conocer el valor del estadístico P. Este análisis nos ha permitido poner de manifiesto que las diferencias entre la cantidad de resultados de metilación positiva en el grupo de mujeres con cáncer de mama y de mujeres sin evidencia de enfermedad mamaria alguna son claramente significativas cuando se comparan los biomarcadores: RE (P=0.0036) y sigma (P=0.0015). No encontramos diferencias significativas para el resto de biomarcadores estudiados. Las diferencias entre casos y controles para RE y para sigma pierden validez cuando en la comparación se incluyen los grupos de casos y de controles con patología mamaria benigna las diferencias carecen de significación estadística Estadística descriptiva general por grupo Para alcanzar los objetivos propios del estudio se llevó a cabo un análisis estadístico que incluyó, para cada uno de los grupos el análisis descriptivo de los cinco biomarcadores. En la tabla 41 que sigue aparecen las medidas básicas de resumen (número de caso, media, desviación típica y percentiles) para cada una de las variables (biomarcadores aberrantemente metilados) objeto de nuestro estudio, en el suero de pacientes afectas de cáncer de mama y en los grupos de control que hemos establecido. De los resultados que presentamos llama la atención el hecho de que hay un gran número de valores a los que se les ha asignado el valor cuantitativo 0 (figuras 8 y 9 y tabla 41, percentiles del 25 y a veces del 50). Estos valores cuantificados como 0 proceden de las que, tras el ensayo, resultaron indetectables para cada uno de los biomarcadores y de los que resultaron con un valor inferior a ng/ml; esto lo hemos hecho así por cuanto la sensibilidad

140 Resultados del test de PCR específica de metilación, teniendo en cuenta la recta de calibración, no permite cuantificar con precisión valores por debajo de esa cifra. Por la misma razón (límite en la recta de calibración del ensayo) el valor máximo resultante del test se ha tomado como 2 ng/ml en aquellos casos que el valor medido superaba esta cifra. Este ajuste de datos explica también, de una manera indirecta, la asimetría de las variables y por tanto la no normalidad de las mismas. La tabla 41 recoge estos datos. Tabla 41. Parámetros estadísticos resultantes del estudio de casos y controles Grupo RE E-cad. Rar-beta APC sigma Control N Válidos Perdidos Media,0189,0246,0475,0287,0806 Desv. Típ.,05308,06235,16476,05653,17983 Mínimo,00,00,00,00,00 Máximo,38,43 1,35,26 1,04 Percentiles 25,0000,0000,0000,0000, ,0000,0000,0000,0028, ,0120,0253,0350,0382,0543 Casos N Válidos Patología Benigna Perdidos Media,1864,1820,1233,0377,2510 Desv. Típ. 1, ,15902,97542,12064,70258 Mínimo,00,00,00,00,00 Máximo 2,00 2,00 2,00 1,19 2,00 Percentiles 25,0000,0000,0000,0000,0000 N 50,0114,0000,0001,0131, ,0572,0321,0291,0365,1615 Válidos Perdidos Media,0236,0469,0236,0479,2472 Desv. Típ.,03120,09332,05934,14520,51427 Mínimo,00,00,00,00,00 Máximo,13,46,33,87 2,00 Percentiles 25,0000,0000,0000,0000, ,0023,0000,0000,0067, ,0473,0720,0232,0439,

141 Resultados 4.3. ESTUDIO DE LA RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES EPIGENÉTICAS Una de las condiciones esenciales, cuando se estudia una serie de potenciales biomarcadores de enfermedad, es que las variables cuantificadas para cada uno de ellos sean independientes de los valores que resulten al medir los otros. Para estudiar las correlaciones entre las variables, dentro de cada grupo, se ha empleando el coeficiente de correlación de Spearman. La tabla 42 resume estos resultados. Observando las correlaciones en los diferentes grupos se ve que los biomarcadores APC y sigma son los que más se correlacionan con los otros marcadores. Tabla 42. Correlación entre los biomarcadores ensayados y los grupos de casos y controles Correlaciones de Spearman por grupo Grupo RE E-Cadher. RAR-beta APC s. Control RE r 1,000 0,128 0,169 0,270 0,385 P - 0,280 0,149 0,020 0,0007 N E-Cadh. r 0,128 1,000 0,121 0,177 0,128 P 0,280-0,309 0,133 0,282 N RAR-beta r 0,169 0,121 1,000 0,329 0,286 P 0,149 0,309-0,004 0,013 N APC r 0,270 0,177 0,329 1,000 0,527 P 0,020 0,133 0,004-0,000 N s. r 0,385 0,128 0,286 0,527 1,000 P 0,000 0,282 0,013 0,000 - N Casos RE r 1,000 0,160 0,183 0,184 0,153 P - 0,103 0,061 0,060 0,119 N E-Cadh. r 0,160 1,000 0,102 0,156 0,279 P 0,103-0,299 0,111 0,

142 Resultados Correlaciones de Spearman por grupo Grupo RE E-Cadher. RAR-beta APC s. N RAR-beta r 0,183 0,102 1,000 0,413 0,140 P 0,061 0,299-0,000 0,153 N APC r 0,184 0,156 0,413 1,000 0,315 P 0,060 0,111 0,000-0,001 N s. r 0,153 0,279 0,140 0,315 1,000 P 0,119 0,003 0,153 0,001 - N Control Patología Tumoral Benigna RE r 1,000 0,263 0,194 0,307 0,111 P - 0,120 0,257 0,068 0,519 N E-Cadh. r 0,263 1,000 0,089 0,353 0,168 P 0,120-0,604 0,034 0,326 N RAR-beta r 0,194 0,089 1,000 0,461 0,132 P 0,257 0,604-0,004 0,443 N APC r 0,307 0,353 0,461 1,000 0,338 P 0,068 0,034 0,0046-0,043 N s. r 0,111 0,168 0,132 0,338 1,000 P 0,519 0,326 0,443 0,043 - N En la tabla anterior hemos sombreados los cruces en los que, tras el estudio de correlación, hemos encontrado la existencia de significación estadística para la relación entre las dos variables investigadas

143 Resultados Del análisis de esa tabla se deduce que los valores de concentración del promotor del gen RE no muestran correlación con ninguno de los otros biomarcadores, ni en el grupo de pacientes afectas de cáncer de mama (casos), ni en el grupo de mujeres con patología tumoral benigna. También es notoria la diferencia entre el número de veces (10 veces) que encontramos correlación entre los resultados obtenidos para las variables cuantificadas en la serie de mujeres sin evidencia alguna de enfermedad tumoral mamaria (Grupo Control) frente las veces en la que esta correlación se encuentra al estudiar los resultados de la serie de mujeres afectas de cáncer (Grupo casos: 6 veces) y la serie de pacientes afectas de patología tumoral benigna (6 veces). Los biomarcadores que muestran mayor tendencia a correlacionar con otros son APC y sigma. Una explicación sencilla a este hallazgo es el elevado número de veces que el resultado cuantitativo del ensayo, para esos dos biomarcadores epigenéticos, corresponde con el valor cero. Esto tiene como resultado que la coincidencia, en uno y otro biomarcador, del valor 0 cuando se estudia la relación entre dos biomarcadores, produzca un resultado estadístico significativo aun cuando tal correlación probablemente carece de significado biológico alguno. Por el contrario, nos parece biológicamente relevante, y significativo, el hecho de que entre el Receptor de Estrógenos y el sigma no se encuentren indicios de relación de uno con el otro en ninguno de los tres grupos estudiados (Tabla 41). Y siendo estos los dos biomarcadores los únicos que el estudio estadístico elemental parecen distinguir entre pacientes con cáncer y personas sin enfermedad, podemos sugerir que tanto el RE como el sigma pueden ser considerados como biomarcadores independientes del cáncer de mama Contraste de la hipótesis Nuestra hipótesis es que los niveles de un biomarcador cuantificado en el suero de una paciente con cáncer de mama debe ser mayor que el que los que se miden en personas con enfermedad benigna de la mama y mayor que los que aparecen en el suero de una mujer sin evidencia alguna de enfermedad mamaria

144 Resultados Con objeto de determinar las diferencias entre los tres grupos de personas que hemos establecido en este trabajo se llevó a cabo el test de Kruskal-Wallis, en su versión exacta y cuando fue significativo se llevaron a cabo las comparaciones por parejas siguiendo la penalización de Bonferroni. Realizado el test exacto de Kruskal-Wallis para cada uno de los biomarcadores, en la tabla 43 se han recogido los datos correspondientes a la comparación entre casos y controles. Tabla 43. Comparación de las diferencias entre los grupos de pacientes con cáncer y de mujeres sin enfermedad Niveles de Significación exactos del test de Kruskal-Wallis RE E- Cadher. RAR beta APC sig. Significación 0,0007 0,3686 0,7238 0,4044 0,0064 Como se ve en la tabla 43, los únicos dos marcadores que muestran diferencias significativas cuando se comparan los resultados obtenidos para el Grupo Casos con los encontrados en el Grupo Control, son el RE y el sigma. Esto confirma al análisis preliminar que anteriormente exponíamos. Por otra parte, al realizar las comparaciones por parejas se obtiene que las significaciones que se encuentra provienen de la comparación controles-casos, no llegándose a obtener significaciones en ninguna de las dos comparaciones cuando en el proceso de cálculo figura el grupo de mujeres afectas de patología tumoral benigna de la mama. Para buscar las diferencias individuales entre el grupo de enfermas y el grupo de controles se llevó a cabo un análisis mediante el test de Mann-Whitney. Como ya se había dicho anteriormente, hemos encontrado diferencias significativas entre casos y controles, pero sólo en el caso de los biomarcadores RE y del sigma. De estos resultados (tabla 44) se puede sugerir que las pacientes con cáncer de mama tienden a tener niveles de metilación patológica de RE superiores a los que muestran las personas sin evidencia alguna de enfermedad (Grupo Control). Lo mismo podemos decir del biomarcador sigma

145 Resultados Tabla 44. Comparación de medias. Aplicación Test U de Mann-Whitney en casos/ control CASOS/ CONTROLES NORMALES CASOS/ CONTROLES CON Patología Benigna GENES U Mann- Whitney P Significación IC 95% U Mann- Whitney P Significación IC 95% APC 3360, ns 1710, ns E-Cad. 3589, ns 1850, ns s. 3269, s 1014,500 < s Rar-βeta 3819, ns 1831, ns RE 2734,500 < s 1656, ns A partir los resultados obtenidos (tabla 44) podemos decir que del conjunto de genes analizados en nuestras series de casos y controles, dos de ellos (RE y Sigma) alcanzaron suficiente potencia estadística para discriminar entre grupo casos y controles normales. Las diferencias entre los grupos de pacientes con cáncer (Grupo Casos) y de personas sin patología tumoral alguna (Grupo Normal) fueron apreciadas también cuando se compararon los valores correspondientes a APC entre grupo casos y controles normales pero su magnitud no alcanzó la significación estadística (P=0.07). Tampoco se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los promotores de los genes Rar-βeta y E- Cadherina Análisis multivariante Para estudiar la posible asociación entre diferentes biomarcadores y la presencia de enfermedad e intentar fabricar una regla clasificatoria que combinara varios de los marcadores empleados, se empleó la regresión logística multivariante incluyendo en los modelos los diferentes marcadores. Para llevar a cabo este análisis los resultados obtenidos se ajustaron a un modelo de regresión logística en el que la variable dependiente era el grupo (controles/casos) y las variables independientes eran los cinco biomarcadores. Ajustado el modelo de regresión logística de este análisis resulta claro que tres biomarcadores estaban muy lejos de la significación, E-Cadh., RAR-β y APC. Con

146 Resultados objeto de ver si esas tres variables aportaban algo de información sobre la variable dependiente los datos de nuestro estudio se ajustaron a un modelo utilizando sólo las variables significativas y se calculó la diferencia entre los logaritmos de las verosimilitudes de ambos modelos (el resultante del tratamiento de las cinco variables y el que se obtiene tras el ajuste de sólo las dos significativas). El estudio de estas verosimilitudes nos proporciona un valor de χ 2 exp=4.22, 3g.l., P=0.2385, lo que nos permite afirmar que las tres variables categorizadas como carentes de significación no aportan información alguna sobre la variable dependiente, y que su inclusión en el modelo tampoco añade valor a la capacidad discriminante de los dos biomarcadores significativamente asociados (RE y sigma) y con capacidad para distinguir entre casos y controles sin enfermedad alguna. Desde un punto de vista teórico el modelo global resultó significativo, P<0.001, aunque las variables consideradas individualmente (debido a su relación) no alcanzan la significación al 5%. No obstante ambas variables resultan informativas sobre la presencia/ausencia de enfermedad por lo que con ellas se puede construir un discriminador lineal basándonos en las estimaciones de los coeficientes del modelo, según propone P. Margaret [381]

147 Unidades Relativas Joaquina Martínez-Galán Resultados Validación de la capacidad discriminatoria del test Es claro que la distribución de los valores de los biomarcadores estudiados en los grupos de casos y de control (véanse las figuras 8 y 9) han resultado, en parte, estar solapadas. Como consecuencia el número de de predicciones correctas sobre la presencia o la ausencia de cáncer de mama verdaderos positivos y verdaderos negativos- identificados utilizando uno u otro marcador son dependientes del umbral de decisión elegido. Para hacer fácil de entender lo que sigue hemos dibujado el esquema idealizado que se incluye en la figura 10. Si utilizando los datos de esa figura se adopta un nivel de corte muy bajo (umbral 1) Casos Control Figura 10. Influencia del umbral de decisión sobre los porcentajes de aciertos VP y VN y fallos FP y FN Umbral 2 Umbral 1 la fracción de positivos diagnósticos (puntos rojos en la columna correspondiente al grupo casos, que se sitúan sobre la línea marcada como Umbral 1 será muy alta, pero también habrá un elevado número de resultados falsos positivos (puntos verdes que se sitúan por encima de la misma línea en la columna que corresponde al Grupo Control). Si, por el contrario, adoptamos como nivel de decisión un valor alto los resultados serán muy diferentes con pocos diagnósticos falsos positivos (puntos verdes situados sobre la línea que marca el umbral 2) pero también con un descenso muy fuerte en la fracción de diagnósticos verdaderos positivos (puntos rojos que quedan por encima de la misma línea). Así pues, cuando las distribuciones de los valores del biomarcador de enfermedad se solapan en los grupos de casos y controles. La elección de un umbral de decisión que consiga la máxima eficacia diagnóstica: Máxima probabilidad de acierto (Fracciones Verdadera Positiva y

148 Resultados Verdadera Negativa máximas) unido a la Mínima probabilidad de error es un problema clínico frecuente que se resuelve mediante la obtención de sucesivos pares de valores verdaderos positivos (Especificidad del test) y falsos positivos (1 Sensibilidad del test), que se representa en un eje de coordenadas cartesianas dando lugar a un curva que se denomina Curva ROC atendiendo a las siglas que resultan de su denominación inglesa (Reciver Operator Characteristic Curve, ROC curve). Este método lo hemos empleado con las variables que en este trabajo han resultado significativas (RE y sigma) y con la combinación lineal de las mismas tomadas conjuntamente a partir de la ecuación que surge de los coeficientes de regresión logística encontrados (tabla 43). Una vez construidas las tres curvas ROC posibles se calculó, por la regla del trapecio, el área bajo la curva ROC para cada uno de los biomarcadores y para el discriminador lineal resultante de la combinación de los mismos. Con este análisis se concluyó en la calidad discriminante de los diferentes marcadores y de una combinación de ellos. La ecuación lineal que resulta de la combinación de ambas variables es: Y 5.5 X X Donde Y es la variable dependiente; X 1 la concentración del biomarcador basado en la determinación cuantitativa de promotor del gen del Receptor de estrógenos aberrantemente metilado y X 2 la concentración del biomarcador basado en la determinación cuantitativa de promotor del gen de sigma aberrantemente metilado. Así cada muestra (tanto de casos como de controles) tendrá además de los valores de cada uno de los biomarcadores un valor resultante de su combinación. La comparación de los resultados de casos y controles y el cálculo de los índices de sensibilidad y especificidad que resultan para sucesivos umbrales de decisión nos ha permitido para cada una de las variables por separado, y para el discriminante de su combinación, medir la calidad diagnóstica final empleando el área bajo la curva ROC. Los resultados de ese cálculo figuran en la tabla

149 Resultados Tabla 45. Área bajo la curva ROC para los dos biomarcadores y para su combinación línea Variables contraste Área Error típico a) Significación asintótica(b) Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior RE,655,041,000,574, sigma,618,042,007,535,700 Combinación,692,040,000,614,770 Las tres estimaciones del área bajo la curva ROC son significativamente distintas de 0,5 (área de una curva ROC correspondiente a una variable que no discrimina). Los valores de las áreas estimadas no son muy altos pero, aunque no haya diferencias significativas, parece ligeramente más discriminante la que corresponde a la variable RE que la que se obtienen utilizando la variable sigma y, desde luego, el área bajo la curva correspondiente a la combinación lineal de ambas variables es mayor que las de las variables por separado. Obsérvese que aún así el área bajo la curva ROC que resulta, es inferior al valor de 0,75 que se considera como el nivel mínimo necesario para que un test diagnóstico sea calificado como bueno y por ello útil en clínica. Es así que el test que en este trabajo hemos desarrollado para discriminar entre presencia y ausencia de cáncer de mama en una mujer en particular, debe ser calificado como pobre o de valor escaso. Sin duda que ampliar nuestro trabajo y encontrar otro biomarcador que añadiera información a la ecuación combinatoria resultante podría resolver mejor el problema de la discriminación y ayudarnos a conseguir un mejor diagnóstico del cáncer de mama. Los resultados obtenidos para las curvas ROC generadas se han incluido en la figura 11. En ella se puede comprobar cómo la curva obtenida tras el cálculo del discriminante combinado se sitúa por encima de las otras dos

150 Resultados Figura 11. Curva ROC Sensibilidad y especificidad del test diagnóstico Una vez demostrado que existen diferencias en los valores cuantitativos de los biomarcadores: RE y sigma, que están determinadas por la presencia, o la ausencia, de enfermedad tumoral maligna, nos queda cuantificar cual es la valía clínica del test diagnóstico que en este trabajo hemos aplicado sobre una amplia serie de mujeres con cáncer de mama y de mujeres elegidas como control. En efecto, los datos de concentración sérica de los biomarcadores estudiados en este trabajo nos permiten calcular la especificidad y la sensibilidad del test. Y la sensibilidad (S) y la especificidad (E) son los parámetros clínicamente relevantes. Pero en este cálculo, la elección del umbral de decisión, para definir como positivo o negativo el resultado, adquiere una importancia fundamental puesto que a cada umbral de decisión se asocian valores de S y E. Por ello la elección del mejor umbral debe hacerse atendiendo a criterios científicos. Para

151 Resultados ello es también posible acudir al análisis de las curvas ROC. Con este análisis se determinó para los genes RE y sigma el punto de corte que optimizaba los valores de E y S atendiendo al parámetro de Likelihood Ratio. Los datos de nuestro trabajo nos han permitido concluir que el valor de corte y los índices de S y E, para el biomarcador RE, son: Umbral de decisión = 0.02 Unidades Relativas (ng/ml de ADN patrón) S = 82,4, 95% IC (71.8% %) E = 41,9, (95% IC 32.4% %; likelihood ratio = 1,4 (las cifras se han redondeado a un decimal); Para el biomarcador sigma los mejores valores fueron: Umbral de decisión = 0.05 Unidades Relativas (ng/ml de ADN patrón) S = 75.7 (95% IC 64.3% %) E = 54.7 (95% IC 44.7% %; likelihood ratio = 1.6 El objetivo ideal de este trabajo era conseguir un procedimiento diagnóstico que permitiese identificar con certeza a las mujeres afectas de cáncer de mama y que, al mismo tiempo, informase de la ausencia de enfermedad en las mujeres en las que clínicamente la situación de salud era un hecho objetivo. De nuestros resultados se desprende que los valores de Sensibilidad y Especificidad obtenidos no responden a las exigencias que debe respetar un test diagnóstico aplicado a la oncología clínica. En efecto, aun cuando tolerable la cifra correspondiente a la fracción de diagnósticos en los que en presencia de la enfermedad, el test informa positivamente este hecho (sensibilidad), el método de cuantificar la metilación aberrante en los promotores de los genes RE y sigma fracasa en identificar como libres de enfermedad a una importante proporción de las personas que hemos incluidos el grupo como controles (especificidad). Podemos por ello ambos biomarcadores pueden definirse como aceptablemente sensibles pero, al ser altamente inespecíficos, su utilidad en clínica es limitada. Otra forma de abordar el problema es considerar que el diagnóstico de presencia de enfermedad debe hacerse cuando uno, otro, o los dos

152 Resultados biomarcadores se encuentren elevados, mientras que la ausencia de enfermedad debe considerarse cuando ambos biomarcadores se den resultados que cuantitativamente se encuentren por debajo del punto de corte elegido. Procediendo así hemos construido la tabla 46 en la que se resumen los datos relevantes de este cálculo. Tabla 46. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test para el diagnóstico de cáncer de mama usando RE y sigma como biomarcadores RE ó Sigma Cáncer mama Controles Sanos RE ó Sigma Cáncer mama Controles Sanos Enfermedad (+) +/- -/+ +/+ Enfermedad (-) -/- 87 a 33 a Enfermedad (+) +/+ 20 a 41 a Enfermedad (-) +/- -/+ -/- 39 b 9 b 67 b 65 b P < P = Sensibilidad = 81% (95% IC: 72-88) Sensibilidad = 37% (95% IC: 73-47) Especificidad = 55% (95% IC: 40-67) Likelihood ratio = 1.82 Especificidad = 88% (95% IC: 78-94) Likelihood ratio = 3.03 De acuerdo con lo anterior hemos supuesto dos situaciones: Situación 1: (zona izquierda de la tabla 46): El diagnóstico de enfermedad tumoral presente (+) se hará cuando uno de los marcadores, u otro, o los dos resultasen superiores a los umbrales elegidos (+/-, -/+, +/+) mientras que el diagnóstico de enfermedad ausente se haría sólo cuando ambos biomarcadores estuviesen por debajo del valor umbral (-/-). Del recuento de casos y controles resulta la tabla de contingencia cuyos números están marcados por el subíndice a y que hace máximo el valor de Sensibilidad diagnóstica. Esto es casi todos los casos con enfermedad maligna de la mama serán correctamente diagnosticados (S=88%) aun cuando una importante proporción de mujeres sin enfermedad serán incorrectamente clasificadas como portadoras de cáncer de mama (porcentaje de resultados falsos positivos FP = 100 E = 45%)

153 Resultados Situación 2 (zona derecha de la tabla 46): Se hará el diagnóstico de enfermedad tumoral presente sólo cuando ambos biomarcadores sean positivos (+/+). Por el contrario se asignará el diagnóstico de ausencia de enfermedad cuando uno, u otro o ambos biomarcadores sean negativos (+/-, -/+, -/-). Procediendo así los números que definen la nueva tabla de contingencia están incluidos en las cuadrículas del lado derecho de la Tabla 45 y han sido destacados con el subíndice b. Esta nueva decisión diagnóstica permite llevar la Especificidad a un nivel aceptable E= 88%. Esto equivale a decir que casi todas las mujeres sin enfermedad serán correctamente diagnosticadas pero ese incremento se produce a costa de fallar en el diagnóstico en un porcentaje muy elevado de casos de cáncer (porcentaje de diagnósticos falsos negativos FN = 100 Sensibilidad = 73%). Añadamos al análisis anterior una condición importante que resulta de la simple observación clínica: Para que un test de diagnóstico en cáncer sea eficaz, el valor del biomarcador en el grupo de personas afectas de cáncer debe ser superior al que se cuantifica en personas sin enfermedad y, además, en el caso de que existan enfermedades tumorales benignas que afecten al mismo órgano, un marcador tumoral ideal, debe distinguir también entre la presencia y la ausencia de éstas, y los niveles que se cuantifiquen cuando existen tumores benignos deberían permitir la diferenciación entre esta enfermedad tumoral y el cáncer. La condición anterior es especialmente importante en la mama por cuanto que, además de enfermedades tumorales malignas, la mama es asiento de frecuentes patologías de carácter benigno. Para estudiar esta posibilidad hemos incluido en nuestro trabajo un grupo de 36 mujeres afectas de tumoraciones mamarias de carácter benigno en el que se han cuantificado los mismos biomarcadores que en el grupo casos y en el grupo control. Los datos referentes a la posibilidad de distinguir entre personas con enfermedades benignas y personas sin evidencia de enfermedad tumoral mamaria alguna se han resumido en la tabla 47 y su lectura e interpretación añade más dudas a la aplicabilidad de estos biomarcadores para el diagnóstico del cáncer de mama

154 Resultados Tabla 47. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test cuando se compara el Grupo casos con enfermedad tumoral benigna de la mama con el Grupo control RE ó Sigma Patología Benigna mama Controles Sanos RE ó Sigma Patología Benigna mama Controles Sanos Enfermedad (+) +/- -/+ +/ Enfermedad (+) +/+ 9 9 Enfermedad (-) Enfermedad (-) /- +/- -/+ -/- P < P = 0.09 Sensibilidad = 70% (95% CI: 53 85) No significación estadística Especificidad = 55% (95% CI: 43 67) 4.4. CORRELACIÓN DEL PERFIL METILACIÓN DE ESR1 EN SUERO CON EL SILENCIAMIENTO EXPRESIÓN DE RE EN TUMOR De acuerdo a lo ya comentado en capítulos anteriores, la metilación epigenética de la región promotora de un determinado gen, da lugar a la ausencia transcripcional de este y por tanto a la falta de expresión proteica derivado de ello o lo que es lo mismo su silenciamiento génico. Este hecho que podemos conocer a través del análisis por PCR del ADN extraído a partir de muestras de los pacientes, tiene una repercusión directa en la pieza tumoral. Es decir, aquellas pacientes que tuviesen metilado el gen RE y por lo tanto este no se expresara es decir estuviese silenciado, esto debería correlacionarse con la ausencia de expresión de receptores estrogénicos en tumor lo que desde el punto de vista terapéutico es importante conocer para aproximarnos desde una prueba analítica a un futuro tratamiento hormonal en caso de estar presente en tumor así como factor predictivo de respuesta. Para conocer si en nuestra serie de casos se cumplen o no las hipótesis anteriormente expuestas, se realizaron las siguientes pruebas estadísticas mediante el test no paramétrico para dos muestras relacionadas de Wilconxon:

155 Resultados 1. Se estudió la correlación de RE no metilado en suero con RE (+) en tumor obteniendo el correspondiente valor para el estadístico de Z del test Wilconxon junto con grado de significación P. De los resultados obtenidos para el estadístico Z (-5.891) y valor P < 0.001, se puede deducir que existe correlación en la hipótesis planteada y que esta es significativa. Por lo tanto en nuestra serie de casos el tener el promotor de RE no metilado en suero se correlacionaba con la presencia de RE positivo en tumor. No se obtuvo correlación entre RE no metilado en suero y RE (+) en tumor como era de esperar de acuerdo a lo ya explicado anteriormente (tabla 48). 2. Igualmente se analizó si existía correlación entre RE metilado en suero y RE (-) en tumor de nuestra serie de casos. Tras aplicar el test de Wilconxon para muestras apareadas se obtuvieron los valores de P < 0.03 y Z que apoyaban esta relación de forma significativa. Tampoco en este caso se observó correlación entre RE metilado en suero y RE (-) en tumor como igualmente era de esperar (tabla 48). Tabla 48. Frecuencia de casos RE Metilado Suero Receptor Estrógenos No Metilado Suero RE (-) Tumor RE (+) Tumor RE (+) Tumor RE No Metilado Suero Nº Casos Z P < RE(-) Tumor RE Metilado Suero Nº Casos Z P < RE (-) Tumor Nº Casos RE No Metilado Suero Z P RE (+) Tumor Nº Casos RE Metilado Suero Z P

156 Resultados Así mismo en este trabajo de investigación y partiendo del mecanismo de silenciamiento de la expresión génica mediante metilación del promotor de ESR1, quisimos correlacionar su silenciamiento epigenético de acuerdo al fenotipo luminal y a partir de ella poder extraer conclusiones de la implicación y papel predominante que tiene la metilación en dicho silenciamiento génico en el tumor. Para ello aplicamos el test no paramétrico para dos muestras relacionadas de Wilconxon. De los resultados obtenidos, observamos un mayor porcentaje de metilación del promotor de RE en aquellos fenotipos de peor pronóstico concretamente el 80% de las pacientes triple negativas y 60% de las pacientes HER2 frente al 28% y al 5.9% de las pacientes con fenotipos de mejor pronóstico como Luminal A y Luminal B respectivamente con p < 0.05 (tabla 49). RE NO METILADO METILADO Tabla 49. Porcentaje de metilación RE de acuerdo con el fenotipo luminal LUMINAL A 28 (71%) 11 (28%) LUMINAL B 14 (64%) 8 (36%) TRIPLE NEGATIVO 3 (20%) 12 (80%) HER2(+) 4 (40%) 6 (60%) P < 0.05 < 0.05 A partir de estos datos analizamos si dentro de cada fenotipo luminal podrían existir subgrupos de pacientes de acuerdo con el perfil de metilación que pudiera explicar en parte por qué en algunos casos a pesar de pertenecer a un fenotipo de buen pronóstico acaban desarrollando metástasis a distancia. Observamos que dentro de cada subgrupo de acuerdo al estado de metilación de RE en suero, existía una tendencia a presentar menor supervivencia a 4.5 años de seguimiento en cada fenotipo cuando RE estaba metilado frente a cuando estaba no metilado, aunque estas diferencias no fueron significativas (tabla 50)

157 Resultados Tabla 50. Diferencias de presentación de metilación aberrante RE por subgrupos dentro del fenotipo luminal FENOTIPO Nº SG 4.5 años P RE NO METILADO luminal A 28 93% >0.05 luminal B 14 92% >0.05 Triple Negativo 3 80% >0.05 Her2 4 75% >0.05 RE METILADO luminal A 11 81,8% >0.05 luminal B 8 86% >0.05 Triple Negativo 12 75% >0.05 Her2 6 66,7% >0.05 A la vista de estos resultados en nuestra serie de casos probablemente la metilación deba ser considerada como un factor pronóstico más que considerar en la práctica clínica diaria si bien son necesarios más estudios prospectivos para validar esta hipótesis VARIACIÓN DEL PERFIL DE METILACIÓN PRE Y POST-TRATAMIENTO En este apartado del trabajo de investigación realizado, analizamos si existían diferencias entre los resultados analíticos obtenidos por PCR cuantitativa de los 5 genes estudiados antes y después del tratamiento. Con este cálculo se pretendía responder a la hipótesis de si conforme la paciente se fuese sometiendo a distintos tratamientos oncológicos, esto repercutiría en una menor cuantificación proteica derivada de cada uno de los genes por PCR cuantitativa como signo de la menor presencia de ADN procedente de células tumorales y por lo tanto indirectamente relacionarse con una evolución favorable o viceversa. Para ello aplicamos el test no paramétrico para pruebas apareadas de Wilconxon con el que no se observaron diferencias estadísticamente significativas

158 Resultados No obstante al calcular el estudio descriptivo para comparar las distintas medianas de cada gen antes y después de administrados los diferentes tratamientos así como el percentil 75 mediante el empleo de un diagrama de cajas y vigotes, se observó en todos los genes una menor cuantificación proteica al analizar las muestras post-tratamiento respecto a las muestras pre-tratamiento aunque de escasa magnitud. Probablemente una tendencia más marcada del descenso de estos biomarcadores en muestras sanguíneas podría haberse obtenido si dicha determinación hubiese sido realizada transcurridos varios meses de finalizado el tratamiento (tabla 50 y representación gráfica figura 12). Tabla 50. Perfil de metilación Pre y Pos-tratamiento Pre-tratamiento M S ẋ P 75% IC 95% APC 0,012 0,040 0,026 0,036 0, E-Cad 0,000 0,045 0,024 0,030 0,03-0, ,047 0,108 0,082 0,119 0,10-0,05 Rar-β 0,0001 0,051 0,023 0,027 0,03-0,01 R. E. 0,009 0,049 0,031 0,044 0,02-0,04 Post-tratamiento M S ẋ P 75% IC 95% APC 0,001 0,082 0,025 0, E-Cad ,048 0,019 0,015 0, ,038 0,096 0,075 0, Rar-β ,038 0,017 0, R. E. 0,003 0,062 0,031 0,027 0,04-0,014 ẋ*: media. M: mediana

159 Resultados Figura 12. Representación niveles de metilación de los genes pre y postratamiento

160 Resultados 4.6. ESTUDIO DE LA CORRELACIÓN DE LAS VARIABLES CLÍNICO- PATOLÓGICAS CON EL PERFIL DE METILACIÓN DE LOS GENES RE, SIGMA, E-CADHERINA, APC Y RAR- BETA En este apartado hemos realizado un análisis descriptivo de las variables clínico-patológicas del tumor con el perfil epigenético de los promotores de los 5 genes analizados para conocer sus frecuencias de presentación y estudiar si existe o no relación estadísticamente significativa entre ellas. Para ello se realizó aplicó el test estadístico de Chi-cuadrado con la corrección de Yates. De los resultados obtenidos se observó que se obtuvieron niveles más elevados de metilación aberrante para el gen sigma en aquellas pacientes que tenían mayor afectación ganglionar y mayor tamaño del tumor con resultado estadísticamente significativo. Para el resto de variables clínico-patológicas no se observó relación estadísticamente significativa (tabla 51). Tabla 51. PROMOTORES GENES METILADOS Factores Clínico Patol. Edad Diagnóstico 35 años > 35 años P Edad Menarquia < 12 años 13 años P Edad Menopausia < 45 años 45 años P Estado Menopáusico Premenop. Postmenop. P Grado diferenciación GI GII- III P RE APC E-Cad. RAR-β SIGMA Continúa en página siguiente

161 Resultados PROMOTORES GENES METILADOS RE APC E- Cadher. RAR-β SIGMA Factores Clínicopat Estadio Tumor T1 T2 T3-4 P <0.05 Estadio Ganglionar N0 N1 N2 P <0.05 Metástasis M0 M1 P Cerb2 + - P P P QT Si No P RT Si No P HT Si No P

162 Resultados 4.7. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA Análisis univariante de los factores pronósticos clínico-patológicos relacionados con la supervivencia libre de enfermedad Los datos a 6 años resultantes de la estimación de supervivencia libre de enfermedad (SLE), en relación con los distintos factores pronósticos en el cáncer de mama conocidos hasta hoy día tales como; edad <35 años, estado de menopausia, tamaño tumoral, afectación ganglionar, grado de diferenciación histológica, receptores hormonales, p53, estado del Cerb2 y triple negativas se presentan a continuación. En todos los casos se ha aplicado el procedimiento de cálculo de supervivencia actuarial mediante el método de Kaplan-Meier así como el test de log-rank para valorar si las diferencias encontradas entre las curvas de supervivencia poseen o carecen de significación estadística. Edad: La SLE a 6 años fue del 50% en el grupo de pacientes menores a 35 años y del 87.80% para las mayores de 35 años. Estas diferencias observadas fueron significativas. (p= 0.03). Figura

163 Resultados 1,1 Supervivencia libre de enfermedad 1,0,9,8 EDAD MENOR 35 AÑOS,7 edad < 35 años edad < 35 años,6 -censurado,5 edad > 35 años edad > 35 años, censurado SLE meses Figura 13. SLE en función de la edad. Edad de la menarquía: La SLE a 6 años fue del 89.20% en el grupo de pacientes con edad de la menarquía mayor o igual a 12 años y del 82.63% para las pacientes con edad de la menarquía menor a 12 años. Estas diferencias observadas no fueron significativas (p= ). Estado de la menopausia: La SLE a 6 años en las pacientes premenopáusicas fue del 83.78% y del 87.18% en las pacientes postmenopáusicas. Estos resultados fueron estadísticamente no significativos (p= ). Tipo histológico: Con resultados de supervivencia a 6 años se encontró que la SLE para los carcinoma ductales infiltrantes fue del 84.69%, para los lobulillares infiltrantes del 88.89% y del 88.21% para el resto de histologías. Las diferencias observadas no fueron significativas (p= )

164 Resultados Grado de diferenciación histológica: La SLE a los 6 años en las pacientes con buen grado de diferenciación histológico fue del y para aquellas con grado de diferenciación moderado o mal diferenciado. Los tumores en los que no se determinó el grado histológico se analizaron como una categoría independiente obteniendo una SLE del 75%. Las diferencias observadas no fueron estadísticamente significativas (p=0.4137). Tamaño tumoral: La SLE a 6 años para las pacientes con tumores 2 cm (T1) fue del 89.16%, para tumores entre 2 y 4 cm (T2) del 81.86% y para tumores 5 cm (T3) o con infiltración en dermis (T4) fue del 80%. Las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas (p= ). Afectación ganglionar: Respecto al número de ganglios afectos, los resultados de SLE a los 6 años fueron del 92.50% en el grupo sin afectación ganglionar, del 79.34% en el grupo de pacientes que presentaron de 1-3 ganglios afectos y del 50% para las pacientes que tenían 4 o más ganglios afectos. Dichas diferencias fueron estadísticamente significativas (p= ). Figura 11. 1,2 Supervivencia libre de enfermedad 1,0,8,6 Estadio ganglionar N2 N2-censurado N1,4 N1-censurado N0/Nx, N0/Nx-censurado SLE meses Figura 14. SLE en función de afectación ganglionar

165 Resultados Estado del receptor hormonal: La SLE a 6 años para pacientes que expresaban receptores hormonales (RH) en el tumor fue del 88.75%, mientras que aquellas que presentaban receptores hormonales negativos fue del 77.01%. El grupo de pacientes con RH desconocidos fue analizado de forma independiente obteniéndose una SLE del 85.71%. Dichas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p=0.2777). Estado del Cerb2: Las pacientes Cerb2 negativo tuvieron un ILE a 6 años del 86.88% mientras que en aquellas pacientes con Cerb2 positivo fue del 89.47% sin alcanzar significación estadística (p= ). Estado del p53: La SLE a 6 años para pacientes con P53 positivo en el tumor fue del 73.99%, mientras que aquellas que presentaban P53 negativo fue del 95.61%. El grupo de pacientes con P53 desconocido fue analizado de forma independiente obteniéndose una SLE del 88.89%. Las diferencias encontradas fueron estadísticamente significativas (p=0.0145). Figura 15. 1,1 1,0,9,8 Supervivencia Libre Enfermedad P53 POSITIVO/NEGATIV NO INDICADO NO INDICADO-censurad o P53 POSITIVO P53 POSITIVO -censurado P53 NEGATIVO P53 NEGATIVO, censurado Figura SLE 15.SLE meses en función de expresión de p

166 Resultados Triple negativo: La SLE a 6 años para pacientes no triple negativas fue del 89.74%, mientras que aquellas que no fueron triple negativas fue del 65%. Las diferencias fueron estadísticamente significativas p= (figura 13). 1,1 Supervivencia Libre de Enfermedad 1,0,9,8 TRIPLE NEGATIVAS si,7 si-censurado no, no-censurado SLE meses Figura 13.SLE en función de fenotipo luminal QT Adyuvante: Respecto a la SLE a 6 años para las pacientes que recibieron QT fue del 80.17% frente al 96.55% para aquellas pacientes que no recibieron QT. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas p= Este resultado casa con ser mujeres con factores de mal pronóstico las que reciben QT y no aquellas con factores de buen pronóstico (figura 14)

167 Resultados 1,1 Supervivencia Libre de Enfermedad 1,0,9 QT,8 SI SI-censurado NO, NO-censurado SLE meses Figura 14. SLE en función de administración de QT. RT Adyuvante: En cuanto a SLE a 6 años y haber o no recibido RT, fue de un 90.91% para aquellas pacientes que realizaron RT y de un para las que no recibieron RT. Las diferencias no fueron significativas p= HT Adyuvante: Respecto a la SLE a 6 años para las pacientes que recibieron HT fue del 90.13% frente al 71.08% para aquellas pacientes que no recibieron HT. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas p= (figura 15)

168 Resultados Supervivencia Libre de Enfermedad 1,1 1,0,9,8 HORMONOTERAPIA SI SI-censurado NO, NO-censurado SLE meses Figura 15.SLE en función de administración de HT. De los resultados obtenidos en nuestra serie, podemos decir que con una SLE media de 51 meses, el grupo de pacientes que presentó menor intervalo de tiempo a la recaída fueron aquellas pacientes con edad de presentación del tumor menor a 35 años, edad de la menarquia menor a 12 años, con tumores con estadio T3-T4 con grado de diferenciación histológica GII-III e inmunohistoquímica triple negativas, con afectación ganglionar y P53 positivo. De todos estos factores clínico patológicos se alcanzó la significación estadística en el caso de edad menor a 35 años, afectación ganglionar, triple negativas y P53 positivas Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y sigma en relación con la supervivencia libre de enfermedad Del estudio estadístico respecto a la SLE y al perfil de metilación aberrante para los promotores de los genes RE y Sigma, no se observaron diferencias estadísticamente significativas respecto a la supervivencia libre de enfermedad

169 Resultados aunque sí una leve tendencia a menor SLE en aquellos donde estaban metilados sin alcanzar significación estadística. Receptor Estrogénico metilado positivo/ negativo: La SLE a 6 años para pacientes con Receptor de estrógenos (RE) metilado positivo en suero de las pacientes fue del 86%, mientras que aquellas que presentaban RE no metilado fue del 87%. Las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas (p=0.9565) Sigma metilado positivo/ negativo: Respecto a la SLE a 6 años para Sigma metilado positivo en suero fue del 89.80% y para aquellas con Sigma metilado negativo fue de un 83.71%. Las diferencias tampoco fueron significativas p= Análisis univariante de los factores pronósticos clínico-patológicos relacionados con la supervivencia global de cáncer de mama Al igual que se realizó el estudio de supervivencia libre de enfermedad de acuerdo con los distintos factores clínico-patológicos del cáncer de mama utilizados en clínica, también se analizaron los datos a 6 años resultantes de la estimación de supervivencia global (SG). Los resultados se presentan a continuación. En todos los casos se ha aplicado el procedimiento de cálculo de supervivencia actuarial mediante el método de Kaplan-Meier así como el test de log-rank para valorar si las diferencias encontradas entre las curvas de supervivencia poseen o carecen de significación estadística. Edad: La SG a 5 años fue del 86.76% en el grupo de pacientes mayores a 35 años y del 75% para las pacientes menores de 35 años. Estas diferencias observadas no fueron significativas (p= )

170 Resultados Edad de la menarquía: La SG a 5 años fue del 91.30% en el grupo de pacientes con edad de la menarquía mayor o igual a 12 años y del 83% para las pacientes con edad de la menarquía menor a 12 años. Estas diferencias observadas no fueron significativas (p= ). Estado de la menopausia: La SG a 6 años en las pacientes premenopaúsicas fue del 93.74% y del 82.90% en las pacientes postmenopáusicas. Estos resultados fueron estadísticamente no significativos (p= ). Tipo histológico: Con resultados de supervivencia a 6 años se encontró que la SG para los carcinoma ductales infiltrantes fue del 86.91%, para los lobulillares infiltrantes del 77.78% y del 87.69% para el resto de histologías. Las diferencias observadas no fueron significativas (p=0.6700). Grado de diferenciación histológica: La SG a los 6 años en las pacientes con grado de diferenciación histológico bueno fue del 100% y del 83.12% para aquellas con grado de diferenciación moderado o mal diferenciado. Los tumores en los que no se determinó el grado histológico se analizaron como una categoría independiente obteniendo una SG del 83.33%. Las diferencias observadas no fueron estadísticamente significativas (p=0.1564). Tamaño tumoral: La SG a 6 años para las pacientes con tumores 2 cm (T1) fue del 91.71%, para tumores entre 2 y 4 cm (T2) del 86.51% y para tumores 5 cm (T3) o con infiltración en dermis (T4) fue del 42.86%. Las diferencias encontradas fueron estadísticamente significativas (p= ). Figura

171 Resultados 1,1 Supervivencia Global 1,0,9,8 Estadio T T3-T4,7 T3-T4-censurado,6 T2 T2-censurado,5 Tx-T1, Tx-T1-censurado SG MESES Figura 16. SG en función de estadio T. Afectación ganglionar: Respecto al número de ganglios afectos, los resultados de SG a los 6 años fueron del 95.57% en el grupo sin afectación ganglionar, del 83.25% en el grupo de pacientes que presentaron de 1-3 ganglios afectos y del 19% para las pacientes que tenían 4 ó más ganglios afectos. Dichas diferencias fueron estadísticamente significativas (p=0.001). Figura

172 Resultados 1,2 Supervivencia Global 1,0,8,6 Estadio Ganglionar N2 N2-censurado,4 N1,2 N1-censurado N0/Nx 0, N0/Nx-censurado SG MESES Figura 17.SG en función del estadio N. Estado del receptor hormonal: La SG a 6 años para pacientes que expresaban receptores hormonales (RH) en el tumor fue del 87.27%, mientras que aquellas que presentaban receptores hormonales negativos fue del 81.06%. El grupo de pacientes con RH desconocidos fue analizado de forma independiente obteniéndose una SG del 90%. Dichas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p=0.7284). Estado del Cerb2: Las pacientes Cerb2 negativo tuvieron un SG a 6 años del 85.23% mientras que en aquellas pacientes con Cerb2 positivo fue del 89.47% sin alcanzar significación estadística (p= ). Estado del p53: La SG a 6 años para pacientes con P53 positivo en el tumor fue del 76.30%, mientras que aquellas que presentaban P53 negativo fue del 93.37%. El grupo de pacientes con P53 desconocido fue analizado de forma

173 Resultados independiente obteniéndose una SG del 91.67%. Las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas (p=0.088). Triple negativo: La SG a 6 años para pacientes con triple negativas fue del 76.15%, mientras que aquellas que no fueron triple negativas fue del 87.58%. Las diferencias no fueron estadísticamente significativas p= De los resultados obtenidos en nuestra serie, podemos decir que con una SG media de 52.6 meses, el grupo de pacientes que presentó mayor supervivencia global fue aquellas pacientes con edad de presentación del tumor mayor a 35 años, edad de la menarquia mayor a 12 años, con tumores con estadio T1, bien diferenciados sin afectación ganglionar, con RH positivos y P53 negativo. De todos estos factores clínico patológicos sólo se alcanzó la significación estadística en el caso de la afectación ganglionar y tamaño tumoral. Presencia de metástasis: Respecto a la SG a 6 años para las pacientes que recayeron fue del 93.19% frente al 32.05% para aquellas pacientes que presentaron metástasis a lo largo del seguimiento. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas p= (figura 18)

174 Supervivencia acumulada Joaquina Martínez-Galán Resultados 1,1 Supervivencia Global 1,0,9,8,7,6 METASTASIS si,5 si-censurado,4 no, no-censurado SG MESES Figura 18. SG en función del estadio M. QT Adyuvante: La SG a 6 años respecto a aquellas paciente que recibieron QT fue del 83.17% frente a aquellas que no recibieron QT con un 92.31%. Las diferencias fueron no significativas p= RT Adyuvante: En cuanto a SG a 6 años y haber recibido RT, fue de un 89.22% para aquellas pacientes que realizaron RT y de un para las que no recibieron RT. Las diferencias fueron significativas p= Este resultado se explica porque la mayoría de las pacientes que no recibieron RT fue por habérseles practicado mastectomía por tratarse de tumores con T elevado (figura 19)

175 Resultados 1,1 Supervivencia Global 1,0,9,8 RT SI,7 SI-censurado NO, NO-censurado SG MESES Figura 19.SG en función de administración de RT. HT Adyuvante: Respecto a la SG a 6 años para las pacientes que recibieron HT fue del 89.85% frente al 80.74% para aquellas pacientes que no recibieron HT. Estas diferencias no fueron estadísticamente significativas p=

176 Resultados Tabla resumen resultados SLE y SG: SLE a 6 años SG a 6 años Factores Clínico-patl. Edad diagnóstico 35 años > 35 años Edad menarquia < 12 años 13 años Estado menopáusico Premenopausia Postmenopausia Grado de diferenciación No indicado GI GII- III Estadio Tumor (T) T1 T2 T % IC 95% P % IC 95% P ( ) (45-55) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (40-100) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Estadio Ganglionar (G) N0 N1 N2 RH Suero No Indicados + - Cerb2 + - P53 No indicados + - Triple (-) + - HT ( ) ( ) (46-54) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) < ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

177 Resultados Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y sigma en relación con la supervivencia global de cáncer de mama Con respecto al estudio estadístico respecto a la SG y al perfil de metilación aberrante para los promotores de los genes RE y Sigma, no se observaron diferencias estadísticamente significativas respecto a la supervivencia global al aplicar el método de libre de enfermedad aunque sí una leve tendencia a menor SG en aquellos casos donde se encontraron niveles más elevados de metilación aberrante sin alcanzar significación estadística. Receptor Estrogénico metilado positivo/ negativo: La SG a 6 años para pacientes con Receptor de estrógenos (RE) metilado positivo en suero de las pacientes fue del 86.77%, mientras que aquellas que presentaban RE no metilado fue del 85.63%. Las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas (p=0.9341) Sigma metilado positivo/ negativo: Respecto a la SG a 6 años para Sigma metilado positivo en suero fue del 88.33% y para aquellas con Sigma metilado negativo fue de un 82.66%. Las diferencias tampoco fueron significativas p= Modelo de regresión multivariante de COX En cuanto al riesgo de muerte en nuestra serie de casos se asoció de forma estadísticamente significativa con la edad al diagnóstico menor a 35 años. Aquellas pacientes con edad al diagnóstico menor a 35 años tienen 34 veces más riesgo de muerte por cáncer que aquellas pacientes con edad al diagnóstico mayor a 35 años, p= El estado menopáusico se relacionó de forma significativa con el riesgo de muerte con un riesgo relativo 20 veces superior para aquellas pacientes que fuesen pre-menopáusicas en el momento del diagnóstico frente a aquellas que fuesen post-menopáusicas, p=

178 Resultados El tamaño tumoral fue otro de los factores pronóstico con el que se relacionó el riesgo de muerte, siendo éste 15 veces superior al observado en el grupo de pacientes con T3-T4 frente a T1 con valor p= No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre T2 y T1. El grado de afectación ganglionar también influyó de forma significativa en nuestra serie en el riesgo relativo de muerte siendo 14 veces superior en el subgrupo de pacientes con afectación ganglionar N2 frente a N0, p= No se observaron diferencias significativas cuando el número de ganglios afectos era de 1 a 3 frente a ningún ganglio afecto. El resto de variables analizadas; estado Cerb2, P53, Receptores Hormonales, Grado Histológico y niveles de metilación aberrante de RE y Sigma no se asociaron de forma estadísticamente significativas con el riesgo de muerte (tabla 52)

179 Resultados Edad diagnóstico 35 años > 35 años Estado menopáusico Pre-menopáusica Post-menopáusica Estadio Tamaño Tumoral T1 T2 T3 Estadio Ganglionar N1 N2 Tabla 52. Resultado del análisis multivariante para el riesgo de muerte P RR Error Estándar N3 Grado Histológico GI GII/III Estado de RH (-) (+) Estado Cerb2 (+) (- ) P53 tumor (+) (- ) RE Metilado (+) (-) Sigma Metilado (+) (-)

180 DISCUSIÓN

181 Discusión 5. DISCUSIÓN 5.1. DIAGNÓTICO PRECOZ EN EL CÁNCER DE MAMA. JUSTIFICACIÓN Despistaje del cáncer de mama mediante las técnicas actuales. Sus ventajas, limitaciones, costes y riesgos El cáncer de mama continúa siendo el tipo de cáncer que con más frecuencia se diagnóstica entre las mujeres de todo el mundo. En efecto, en este sector de población la causa más frecuente de muerte específica por cáncer. Cada año se diagnostican más de 1-2 millones de casos nuevos de cáncer de mama lo que representa que el cáncer de mama lo padecerá aproximadamente un 10-12% de la población femenina mundial. Si a estos datos añadimos que la cifra global de muertes que se producen por cáncer de mama es aproximadamente de muertes al año y que se está observando un aumento de la incidencia de nuevos casos en edades comprendidas entre los 35 a 39 años, la perspectiva de que nos encontremos ante un importante problema de salud pública a nivel mundial hace necesario que se busquen métodos de cribado poblacional que hagan posible que el diagnóstico precoz permita alcanzar mayores tasas de supervivencia y un mejor pronóstico de la enfermedad [5]. Actualmente se dispone de un importante despliegue de medios y técnicas de imagen que puestas al servicio de las campañas de detección precoz del cáncer de mama a nivel poblacional asisten como población de riesgo incluso al estudio de determinadas mujeres que puedan presentar una mayor probabilidad de desarrollar cáncer de mama ligado a la herencia familiar. Todo ello ha permitido divulgar y concienciar a la población global para participar en las campañas de screening con la consiguiente repercusión en alcanzar un diagnóstico más temprano y en definitiva una mejora en el pronóstico de la enfermedad. Se estima que gracias al cribado poblacional del cáncer de mama la mortalidad derivada de su diagnóstico se ha reducido en aproximadamente un 20-15% de los casos. Sin embargo y a pesar de ello los programas de screening tienen importantes limitaciones como es el hecho de que actualmente alrededor de un 32% de los

182 Discusión casos de cáncer de mama se siguen diagnosticando en estadios localmente avanzados y un 6% en estadio metastásico donde la enfermedad no es curable [382]. Entre las técnicas que habitualmente se emplean en el diagnóstico precoz del cáncer de mama se incluyen fundamentalmente la autoexploración y exploración de la mama por el clínico y la mamografía como una de las técnicas que han supuesto una mayor aportación en los programas de cribado poblacional. Hoy sabemos que el diagnóstico del cáncer de mama en etapas tempranas de la enfermedad por medio de técnicas de imagen como la mamografía con una sensibilidad global para el diagnóstico de la enfermedad situada en torno al 75% de los casos, ha demostrado en diferentes estudios aleatorizados realizados en población sana, un impacto positivo en la reducción del número de muertes por cáncer de mama especialmente en mujeres con edades comprendidas entre los años siendo algo menor su beneficio en mujeres con edades entre los ó mujeres mayores a 70 años de edad. Sin embargo aunque la mamografía es una prueba de imagen razonablemente sensible para el diagnóstico precoz en mujeres postmenopáusicas, en el caso de mujeres más jóvenes su sensibilidad desciende de forma significativa al igual que sucede en aquellas mujeres que tienen una predisposición genética al desarrollo del cáncer de mama en las que la enfermedad suele presentarse en edades más tempranas y con mayor índice de proliferación celular que en la población general. Este hecho que parece estar relacionado con la mayor densidad del parénquima mamario que presenta la glándula mamaria de las mujeres premenopáusicas, puede ocultar los signos y matices radiológicos característicos que permiten el diagnóstico de un tumor dificultando así su visualización en los momentos iniciales de la enfermedad. En particular en el cáncer de mama asociado con mutaciones del gen BRCA (concretamente BRCA1) es frecuente la presentación de una imagen mamográfica con un aspecto radiológico ambiguo y que en ocasiones puede confundirse con el de una patología benigna de la mama. Esto, que ha dado lugar a falsos negativos, es una fuente de error conocida que debe ser considerada para examinar cuidadosamente estas imágenes

183 Discusión Unida a esta limitación, la mamografía tampoco está exenta de un porcentaje nada desdeñable de falsos positivos que aunque en términos generales son resultados que pueden ser esperados y que son asumidos por la población de mujeres que aceptan participar en los programas de screening, no deja de generar un cierto estado de ansiedad y preocupación así como ocasionar que se pongan en marcha otras técnicas diagnósticas para intentar confirmar o descartar- el diagnóstico. No se puede dejar de tomar en consideración que cualquier inseguridad en el diagnóstico que obliga a la realización de nuevas pruebas lo que ocasiona gastos que se deberían evitar en la medida de lo posible. La cifra de falsos positivos que según los datos estadísticos publicados podría variar ampliamente entre un 0.7% a un 17% de los casos (6.5% como promedio), probablemente esté en relación con la existencia de diferencias en las políticas de actuación de los programas de cribado poblacional en los que la mamografía puede estar, o no, asociada a otros medios diagnósticos complementarios con lo que se disminuye el porcentaje de error al definir de forma más precisa si el hallazgo radiológico es compatible con malignidad o por el contrario si el diagnóstico más probable es el de lesión benigna [383]. Incluso se ha descrito que en aquellas mujeres en las que se emite un diagnóstico falso positivo como resultado de un primer screening en posteriores controles mamográficos se ha observado en algunos casos un efecto deletéreo por ser atendidas por segunda vez con menos frecuencia de la debida. Esto explica el hecho de que los tumores que se diagnostican en este grupo de personas sean de mayor tamaño que los que se objetivan en las mujeres que son seguidas con arreglo al protocolo y la frecuencia establecida. Por ello se han de analizar los factores que predisponen a la obtención de falsos-positivos y animar a las mujeres en las que este error se produce a seguir el programa en la forma prevista [384]. A parte de lo comentado anteriormente el screening con mamografía puede ocasionar un sobre diagnóstico de casos de cáncer de mama y también que algunas personas resulten sobre tratadas. En efecto, de acuerdo con los datos publicados en la base de datos Cochrane se estima que aunque el cribado poblacional con mamografía para el cáncer de mama reduzca su mortalidad, realmente la magnitud

184 Discusión de este efecto es impreciso ya que también dará lugar a que se diagnostiquen y se traten de cáncer de mama a algunas mujeres cuya lesión se comportaría de forma indolente sin que su presencia se le pueda atribuir el fallecimiento por causa de cáncer. A pesar de lo anterior tenemos que aceptar que, actualmente, a partir de las pruebas de screening no es posible determinar cuáles ni cuantas son las mujeres sobre tratadas y en quién el tumor se comportará de forma más agresiva. Esta incertidumbre determina que se realicen en algunos casos, tratamientos quirúrgicos y se apliquen tratamientos con radioterapia de forma innecesaria [385]. Estudios recientes han sugerido que, además de presentar las limitaciones anteriormente subrayadas, la utilización de la mamografía también puede conllevar algunos riesgos. La dosis media de radiación que recibe la mama durante la realización de una mamografía bilateral es aproximadamente de 4 a 5 mgy aumentando ésta en relación directa a la densidad de la mama. Por otro lado la dosis media acumulativa que recibe una mujer sana incluida en el programa de screening durante 10 años es de 60 mgy. Hoy sabemos que el riesgo de desarrollar cáncer de mama radioinducido sigue una tendencia lineal que aumenta conforme lo hace la dosis recibida (P=0.0001) describiéndose un aumento de la incidencia tras la realización de mamografías seriadas, realizadas por causa del control evolutivo de la patología benigna de la mama fundamentalmente en mujeres que presentan alteraciones en uno de los alelos de genes encargados de reconocer y reparar el daño ocasionado al ADN aún a dosis bajas de radiación [386]. En este sentido la Resonancia Magnética (RM) es otra de las pruebas de imagen que aunque actualmente no se realiza de forma sistemática en las campañas de screening poblacional, cada vez son más los estudios que coinciden en la mejora de la sensibilidad diagnóstica (alcanzándose porcentajes en torno al 90%) cuando, en determinados subgrupos de población, se asocia al estudio mamográfico la RM. Concretamente se ha descrito que la Resonancia Magnética parece tener una mayor sensibilidad que la mamografía en la detección precoz del cáncer de mama especialmente en mujeres de edades más jóvenes donde por tener mayor densidad

185 Discusión el parénquima mamario la mamografía pierde en resolución pudiendo la RM detectar lesiones que son ocultas para la mamografía. Sin embargo la RM no está exenta de desventajas como es su moderada especificidad a la hora de discriminar entre patología benigna y patología maligna. Esto conduce a que la indicación de biopsias se realice con mayor frecuencia con la finalidad de asegurar mejor el diagnóstico y reducir el porcentaje de falsos positivos. Sin embargo no disponemos aun de datos que demuestren de forma concluyente los posibles beneficios que se derivarían a la asociación de la RM a la mamografía en las campañas de cribado poblacional. En resumen todavía, y a pesar de las mejoras en las técnicas de imagen que actualmente se utilizan en el diagnóstico precoz del cáncer de mama, siguen existiendo ciertas limitaciones que dificultan en algunos casos el poder alcanzar un diagnóstico lo más precoz posible. Considerando estas limitaciones creemos que del estudio de nuevos biomarcadores pueden surgir datos que ayuden a predecir el comportamiento biológico del cáncer de mama y a partir de él, conseguir una aproximación al conocimiento de la capacidad de diseminación de un determinado tumor, para a partir de él poder predecir el riesgo de progresión de lesiones benignas a malignas, de carcinoma intraductal a carcinoma infiltrante, así como a diferenciar el perfil molecular de los tumores que potencialmente tiene el mayor riesgo de recidivar o producir metástasis a distancia para indicar el tratamiento que mejor se adapte a sus características moleculares evitando que, en los casos más favorables, se realicen tratamientos loco-regionales o sistémicos innecesarios Papel de los Marcadores Tumorales empleados actualmente en la clínica, sus ventajas y limitaciones El principal papel que tiene actualmente los marcadores tumorales que habitualmente se determinan en muestras de sangre periférica de los pacientes diagnosticados de cáncer de mama, se centra fundamentalmente en su aplicación para evaluar la respuesta clínica al tratamiento oncológico aplicado, así como en la detección temprana del desarrollo de metástasis. En líneas generales aunque han sido propuestos un amplio número de marcadores tumorales son el CA 15.3, CA

186 Discusión 27.29, el CEA (Antígeno Carcinógeno Embrionario) y las citoqueratinas (por ej. TPA, TPS o Cyfra 21.1) los que más comúnmente se indican determinar siendo de todos ellos el CA 15.3 el marcador tumoral que más frecuentemente se utiliza en la práctica clínica asistencial. Sin embargo y a pesar de su utilidad en la práctica clínica diaria, ninguno de los marcadores tumorales actualmente determinados en sangre periférica ha demostrado ser lo suficientemente útil para poder aplicarlo en los programas de diagnóstico precoz del cáncer en general, y del cáncer de mama en particular, debido a las limitaciones que presentan tanto por la baja sensibilidad como por la falta de especificidad que su determinación analítica ha demostrado tener cuando se aplican a los propósitos del diagnóstico precoz. El factor limitante de la sensibilidad es la cantidad de proteína producida por el tumor así como por la transferencia de esta proteína desde el proceso neoplásico hasta el torrente circulatorio donde va a ser analizada. Ambos procesos biológicos, junto con las limitaciones analíticas de la técnica, determinan cuál es el límite de concentración que es detectable en la muestra sanguínea. Concretamente para el CA 15.3, uno de los marcadores tumorales más empleados en la actualidad en cáncer de mama, se ha publicado que su utilidad en el diagnóstico inicial de la enfermedad es muy baja como se demuestra por los valores de sensibilidad que presenta su determinación en el diagnóstico inicial del cáncer de mama. En efecto, de acuerdo con el estadio de la enfermedad en el momento del diagnóstico la sensibilidad oscila entre un % en estadio I, el % en estadios II y el % en estadios III de la enfermedad [387]. Por otro lado asociado a esta baja sensibilidad se añade la falta de especificidad que también caracteriza la utilización de los marcadores tumorales en la clínica. Esta falta de especificidad está relacionada, entre otras causas, con la producción del marcador por células normales pertenecientes a los tejidos donde asienta el tumor primario o, incluso a otros tejidos del mismo organismo. Ambas posibilidades encuentran una explicación lógica en el hecho de que los marcadores tumorales hasta ahora conocidos son sustancias más órgano-específicas que tumor-específicas. Por ello es frecuente la observación de niveles elevados de

187 Discusión marcadores tumorales en personas sin enfermedad así como en personas afectas de algún otro tipo de patología no tumoral. Así se ha demostrado que el CA 15.3 se encuentra frecuentemente elevado en la patología benigna de la mama, en las alteraciones crónicas del metabolismo hepático y en enfermedades del sistema inmune [387]. Por tanto estos problemas de especificidad que afectan a los marcadores tumorales clásicamente utilizados como el CA 15.3 limitan sus aplicaciones en el screening del cáncer de mama. De igual forma los marcadores tumorales en cáncer de mama actuales también presentan determinadas limitaciones cuando se les utiliza como factores indicativos del pronóstico de la enfermedad. En relación con esta cuestión se ha descrito que el nivel de CA 15.3 cuantificado en las pacientes con cáncer de mama antes de la cirugía es un factor pronóstico tanto para la supervivencia libre de enfermedad (SLE) como para supervivencia global (SG), ya que niveles iniciales elevados se correlacionan con una menor SLE y SG. Sin embargo estudios más detallados no han podido demostrar que el CA 15.3 sea un marcador que independientemente de los clásicos marcadores de pronóstico (tamaño tumoral, estado de los linfáticos, etc.) permita precisar la evolución clínica de la paciente afecta por el tumor. Por ello la utilidad de esta proteína como factor pronóstico ha sido muy cuestionada. No obstante en algunos estudios se ha descrito que el nivel de CA 15.3 en el momento del diagnóstico de la enfermedad se relaciona con el riesgo de recidiva y de mortalidad que puede presentar la paciente, tanto en estadios iniciales como cuando la enfermedad alcanza una extensión metastásica. En este contexto su determinación no de forma aislada en el tiempo sino de forma sucesiva a lo largo del seguimiento de la paciente, ha mostrado tener un papel importante en el diagnóstico de la enfermedad metastásica. De hecho se ha descrito en diferentes estudios que la sensibilidad del CA 15.3 para detectar a partir de su elevación progresiva la recidiva de la enfermedad y el desarrollo de metástasis oscila entre el 50 % al 90 % en función del sitio anatómico en donde aparezca el nuevo foco de enfermedad, siendo más alta cuando asienta en el hígado seguida de la localización ósea y pulmonar así como del número de localizaciones y el tamaño de los focos metastásicos [388]. Aún menos resultados existen a favor de

188 Discusión la utilidad del CEA para predecir el pronóstico de las pacientes con cáncer de mama obteniéndose resultados que están en desacuerdo unos de otros por lo que su determinación es de una utilidad muy limitada. Todo lo anterior refleja que la utilidad de los marcadores tumorales en la clínica está limitada por el hecho de que no son lo suficientemente sensibles para que a través de su elevación se pueda asegurar la existencia de un proceso tumoral incipiente, y por ello potencialmente curable, o de descubrir la enfermedad metastásica cuando ésta se encuentra en un momento en el que por su menor carga tumoral sea posible conseguir mejoras en la calidad de vida y en las expectativas de supervivencia de las pacientes NECESIDAD DE BUSCAR NUEVOS BIOMARCADORES EN EL CÁNCER DE MAMA En la actualidad y debido a las limitaciones derivadas de la falta de sensibilidad y especificidad que presenta la determinación de los habituales marcadores tumorales aplicados a la búsqueda del diagnóstico precoz en cáncer, han surgido múltiples iniciativas de investigación que pretenden identificar nuevos biomarcadores y factores moleculares a partir de los cuales establecer vías de investigación y desarrollo que, basadas en técnicas de biología molecular, genómica y proteómica, mejoren los actuales resultados. Los datos publicados hasta ahora resultan prometedores y se confía en que nuevas moléculas permitirán alcanzar el objetivo de conseguir el diagnóstico del cáncer de mama en su estadio más inicial. También los nuevos biomarcadores tumorales deberían ser útiles en la identificación de los individuos con mayor riesgo de padecer cáncer de mama, y su utilidad se reforzaría si aportasen datos válidos para precisar el pronóstico de la enfermedad o predecir la respuesta al tratamiento efectuado, incluyendo el despistaje de la recidiva tumoral o el desarrollo de enfermedad metastásica del paciente. Se sabe desde la década de los 70 que en el suero de los pacientes con cáncer es posible demostrar la presencia de niveles elevados de ADN. Años más tarde se

189 Discusión demostró que parte de ese ADN corresponde a ácidos nucleicos liberados por el propio tumor. Esto ha supuesto un importante avance en la aplicación y estudio de los ácidos nucleicos en la sangre de pacientes con cáncer buscando su utilidad en la patología oncológica y más concretamente en el cáncer de mama [389, 390]. Actualmente conocemos que el defecto primario en el cáncer reside en el ADN genómico en el que, distintas alteraciones moleculares como son las mutaciones, amplificaciones, translocaciones, pérdida de heterocigosidad, inestabilidad de microsatélites así como cambios epigenéticos entre ellos la alteración del perfil de metilación, conducen a la puesta en marcha de cascadas de transducción de señales intracelulares anómalas que, finalmente, pueden dar lugar al desarrollo de una enfermedad tumoral por fracaso de los mecanismos de reparación del ADN y de regulación del ciclo celular normal. Por tanto poder aislar el ADN que se encuentra en el torrente circulatorio y analizar la existencia de deleciones o translocaciones de nucleótidos o de metilación de regiones promotoras de genes con función supresor de tumores podría ayudar a alcanzar el diagnóstico en etapas en donde el tumor aún no se ha manifestado clínica ni radiológicamente o incluso no se ha desarrollado y sólo existen cambios moleculares en el ADN circulante. En los últimos años han sido muchos los intentos de desarrollar técnicas no invasivas persiguiendo lograr el diagnóstico precoz del cáncer de mama. Muchas de ellas han estado basadas en el análisis de ADN extracelular libre que se encuentra circulando en la sangre. En efecto en el plasma se ha demostrado la existencia de niveles elevados de ADN libre circulante lo que, por sí solo, se ha vinculado como un indicador del desarrollo tumoral. Sin embargo, esta determinación carece de especificidad al observarse que en otras patologías como en los pacientes afectos de lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoidea, glomerulonefritis, pancreatitis, hepatitis, etc. también se describe este aumento en la concentración de ADN libre circulante [391]. No obstante numerosos estudios han demostrado que existen diferencias entre el patrón de metilación hallado en la región promotora de numerosos genes, cuando se estudia el ADN circulante en el plasma de pacientes diagnosticados de cáncer mientras que estos cambios en el patrón de metilación no son tan frecuentes al estudiar el ADN circulante extraído

190 Discusión de la sangre de personas sanas [314]. Hoy es posible afirmar que los cambios del estado de metilación de ADN representan una de las alteraciones moleculares más comunes en el cáncer [346], [346], incluyendo el cáncer de mama [238]. Por lo tanto, el análisis de la metilación en los promotores de diversos genes en el suero de la población en general podría ser de gran importancia para la detección temprana de la enfermedad. Además el empleo del ADN en suero de los pacientes con cáncer como marcador tumoral tiene una serie de ventajas respecto a otras moléculas como ARNm, ARNmi y ciertas proteínas. En primer lugar, la molécula de ADN es muy estable. En contraste con lo que le sucede al ARNm y muchas proteínas, el ADN puede sobrevivir incluso en condiciones hostiles durante largos períodos de tiempo permitiéndonos su almacenaje para su posterior análisis. Por otro lado el ADN relativamente intacto se puede aislar y fijar en parafina así como y a diferencia de las proteínas, puede ser amplificado por PCR de manera que partiendo de pequeñas cantidades de material genético, es posible obtener importantes cantidades del mismo. Este proceso de multiplicación del ADN facilita su estudio y análisis [392]. Se ha demostrado que las anomalías de metilación en el ADN circulante, en pacientes con cáncer, ofrece los mejores porcentajes de especificidad en el diagnóstico de las enfermedades neoplásicas [393] y de ello se supone que estas moléculas pueden ser potenciales biomarcadores de la enfermedad tumoral mínima. Sin embargo el hallazgo de resultados falsos positivos es relativamente frecuente y conduce al seguimiento de la persona y a la aplicación de nuevas técnicas analíticas buscando la confirmación diagnóstica lo cual no siempre es real. Por ello, en este asunto hay que tener muy en consideración los costos que el procedimiento global de despistaje de la enfermedad puede acarrear y el sufrimiento provocado en el paciente a causa del estrés y la inseguridad producida por la ausencia de un pronunciamiento diagnóstico claro. Estos hechos han llevado a recomendar que en el despistaje de la enfermedad se asocien los biomarcadores que más específicos hayan resultado en cada caso. Por ejemplo biomarcadores de ADN metilado en combinación con el antígeno PSA en cáncer de

191 Discusión próstata y en combinación con CA 125 para el screening del cáncer de ovario o asociados a la mamografía en el screening del cáncer de mama: es decir, el panel de las pruebas de mayor especificidad y sensibilidad asociadas debe superar la fiabilidad diagnóstica de un simple test aislado [394]. La metilación de citosinas que sucede en el carbono situado en la posición 5 tiene un papel importante tanto durante el desarrollo celular normal como en el proceso de la carcinogénesis. Este evento que ocurre casi exclusivamente en los dinucleótidos CpG que se encuentran agrupados en pequeñas secuencias (islas CpG) de 0.5 a 5kb repartidas por el genoma humano, se localizan preferentemente -en más del 70% de los genes- en la región promotora del gen y concretamente en el primer exón aunque en ocasiones se encuentran localizadas en el extremo final 3 [237]. En las células de los tejidos sanos las regiones CpG en condiciones fisiológicas, se encuentran en estado no metilado reflejando un estado transcripcional activo del gen capaz de formar proteínas que, por tanto, ejercen la acción para la que se ha transcrito. Sin embargo, en situaciones de transformación neoplásica acontecen eventos epigenéticos entre ellos, la metilación de citosinas en las regiones CpG de la región promotora del gen; esta alteración que parece ocurrir en etapas tempranas de la carcinogénesis ocasiona el silenciamiento del gen y la ausencia de su expresión proteica lo que, cuando ocurre en genes supresores de tumores, conduce a la pérdida de su función y en consecuencia a la alteración de los procesos de regulación normal del ciclo celular, proliferación, apoptosis y supervivencia celular [13, 263, 393]. Por tanto la detección del estado de metilación del ADN por técnicas cuantitativas como es mediante PCR en tiempo real y basándonos en un tratamiento del ADN genómico mediante la técnica de modificación bisulfítica, que convierte sólo citosinas no metiladas en uracilos dejando inalteradas las citosinas metiladas, nos podrá permitir inspeccionar y poner de manifiesto este estado metilado de la región promotora del gen a estudiar. A partir de aquí y sabiendo que este proceso ocurre en fases iniciales de la tumorogénesis podría utilizarse su

192 Discusión cuantificación como potencial marcador para identificar a individuos con un mayor riesgo para desarrollar un proceso cancerígeno o para ayudar al diagnóstico de la enfermedad en un estadio temprano, mientras que aquellos genes que sufren este proceso de metilación durante la progresión de la enfermedad podrían ser utilizados como potenciales marcadores pronóstico así como para conocer la resistencia o sensibilidad al tratamiento y por tanto poder ser un factor predictivo de respuesta. Por otra parte una cuestión importante a tratar es la especificidad de órgano que es una de las características que debería reunir un marcador tumoral ideal. Actualmente sabemos que los únicos marcadores específicos de órgano son la Tiroglobulina para el cáncer diferenciado de tiroides [395] y el marcador PSA (antígeno prostático específico), que si bien es específico de la próstata, su elevación no siempre es debida a un proceso cancerígeno es decir carece de especificidad tumoral. Sin embargo y aunque tampoco existe especificidad en cuanto al perfil de metilación y su correlación con un tumor maligno, algunos genes sí que poseen una significativa especificidad de tejido en su patrón de metilación del promotor. Así, el gene hmlh1 se encuentra frecuentemente metilado en el cáncer colo-rectal y el cáncer gástrico mientras que es raro encontrarlo metilado en el cáncer esofágico y en el hepatocarcinoma; el gen BRCA1 está frecuentemente metilado en el cáncer de mama y ovario y no en otros tipos de tumores y la metilación de p73 y p15ink4b parece estar presente de manera casi exclusiva en procesos tumorales hematológicos [396]. Por lo tanto probablemente sean necesarios más estudios prospectivos que analicen el patrón de metilación del ADN y su correlación un determinado tipo histológico que quizás incluso podría ser una herramienta de ayuda en la identificación de los tumores metastásicos de origen desconocido JUSTIFICACIÓN DEL ADN METILADO COMO BIOMARCADOR EN EL CÁNCER DE MAMA En la actualidad y después de décadas de investigación en las que se han estudiado los patrones de expresión de determinados genes y las anomalías que en

193 Discusión ellos es frecuente encontrar, creemos que el cáncer es en gran parte debido al acúmulo de alteraciones genéticas y epigenéticas que, actuando sinérgicamente sobre la cinética celular promueven la ausencia de control del ciclo celular y cascadas de transducción de señales que dan lugar a una pérdida de control y regulación del crecimiento y proliferación celular que conduce en la puesta en marcha del proceso de carcinogénesis. Recientemente Hanahan y Weinberg [397] han descrito las alteraciones moleculares y las cualidades que adquire la célula tumoral hasta conseguir capacidad de crecimiento y proliferación celular independiente de la regulación celular fisiológica que define el crecimiento celular tumoral. Estas características son; i) el potencial ilimitado de las células para replicarse, ii) su autonomía para generar señales autocrinas estimulantes del crecimiento celular, iii) ser insensibles a las señales inhibitorias de proliferación celular, iv) la evasión a los mecanismos de señalización que inducen a las células en condiciones fisiológicas a entrar en apoptosis, v) la secreción de sustancias proangiogénicas a partir de las cuales se estimula la formación de vasos por los que el tumor consigue nutrientes y vi) la capacidad de invadir otros tejidos y dar lugar al desarrollo de metástasis. Entre los eventos que pueden favorecer que la célula adquiera estas capacidades se encuentran las alteraciones que ocurren en la estructura de la cromatina como consecuencia del proceso de desacetilación y metilación de las histonas así como la metilación de las citosinas situadas en el promotor del gen; todo ello afecta a la estructura de la cromatina alterando la expresión génica y ocasionando un cambio en la función proteica derivada de la falta de transcripción de determinados genes. De hecho actualmente se piensa que los procesos epigenéticos que alteran la conformación de la cromatina juegan un papel importante tanto en la iniciación como en la progresión tumoral de numerosos procesos oncológicos. Es así que se considera que los cambios epigenéticos pueden ser tan importantes como las mutaciones genéticas en el desarrollo y proliferación del cáncer [398]. La organización de la cromatina y el estado de metilación de la misma que son responsables de la homeostasis de la expresión proteica en condiciones fisiológicas, en el cáncer esta regulación de la expresión se altera hasta

194 Discusión hacer que las células tumorales sean reconocibles por sus cambios morfológicos al tiempo en que son independientes de la maquinaria de regulación normal de las células normales. Así el genoma de la célula tumoral adquiere una distribución atípica de los grupos metilos respecto a la célula sana exhibiendo un estado de metilación en la región promotora de determinados genes que contrasta con la ausencia de metilación en las regiones CpG reguladoras de la expresión génica de esos mismos genes en la célula normal en condiciones fisiológicas. Consecuencia de esos cambios puede ser la activación de secuencias parasitarias endógenas del ADN, la inestabilidad cromosómica, la pérdida de la actividad génica heredable (imprinting) y cambios en el genoma que conlleven aneuploidía, mutaciones, etc., que responden a algunos de los interrogantes que empezando por cómo ocurre? se formulan en relación al fenómeno de la carcinogénesis. Este patrón aberrante de metilación del ADN puede afectar a diferentes genes implicados cada uno de ellos en distintas etapas del proceso de proliferación, crecimiento o muerte celular. Hoy disponemos de técnicas extraordinariamente sensibles y mínimamente invasivas para el paciente a través de las cuales podemos determinar y cuantificar el ADN metilado correspondiente a la región promotora del gen que deseemos cuantificar en cualquier sujeto diagnosticado de cáncer. Además estas determinaciones son posible en muestras de fluidos naturales como son el suero, orina o esputo tal que cuando se realizan utilizando la técnica de PCR en tiempo real específica para la metilación, podemos conocer la concentración de ADN metilado en la muestra. La utilidad de ADN metilado como un potencial biomarcador para el estudio de los pacientes con cáncer de mama ha sido descrita por diversos autores [278, 280]. Si los hallazgos publicados se confirman en series de pacientes más extensas, la determinación de ADN procedente del tumor a partir de muestras de fluidos biológicos podría convertirse en una herramienta válida para el despistaje y diagnóstico precoz del cáncer de mama. Basándonos en resultados previos y en la propia experiencia de nuestro grupo de investigación [268] hemos realizado este trabajo de investigación para analizar si existen diferencias en el patrón de metilación entre un grupo de pacientes diagnosticadas de cáncer de mama frente a dos grupos control, el primero de ellos

195 Discusión constituido por mujeres sanas y el segundo formado por mujeres con patología benigna de mama. Nuestro objetivos se centraban en evaluar la relevancia clínica de esto biomarcadores en el diagnóstico del cáncer de mama, incluyendo la posibilidad de avanzar hacia un diagnóstico precoz de la enfermedad, y analizar la relación de los biomarcadores elegidos con las variables clínico-patológicas actualmente utilizadas en la práctica clínica diaria, su papel como posible factor pronóstico y su quizás implicación en la no expresión de receptores hormonales de estrógenos como mecanismo de silenciamiento génico mediante metilación. Para ello se seleccionaron 5 genes implicados en diferentes rutas metabólicas importantes en la dinámica y las funciones celulares y que, en estudios previos, habían sido identificados como genes cuya expresión resultaba modificada, por metilación de su promotor, en el espécimen tumoral de mujeres afectas de cáncer de mama [280, 363]. Los biomarcadores así seleccionados fueron: Sigma, RAR-Beta, RE, APC y E-Cadherina. El gen Sigma es un gen tumor supresor implicado en la regulación de múltiples procesos biológicos fundamentales para la célula como son los mecanismos de apoptosis, migración, progresión del ciclo celular y mantenimiento de la integridad del citoesqueleto. Se ha descrito que la ausencia de expresión de la proteína a la que codifica causada por metilación de las citosinas incluidas en las islas CpG del promotor correlaciona con la presencia del tumor. Esto es así porque en condiciones fisiológicas cuando se produce un daño en el ADN y no es reparado, p53 induce la expresión de Sigma que a través de p21 detiene la progresión del ciclo celular en fase G2 y, en asociación con CDK2 y CDK4, parece que también pueda regular la progresión en fase G1/S haciendo que la célula que contiene un daño en su ADN entre en apoptosis protegiéndose así el tejido de que en él se alberguen células con alteraciones en el material genético importantes puedan dar lugar a la iniciación del proceso carcinogénico. Sin embargo cuando este mecanismo de protección fisiológico que la célula utiliza para hacer frente al daño producido en el ADN celular es bloqueado por distintos eventos como el silenciamiento génico mediante metilación, la célula no entra en apoptosis y continúa el proceso de diferenciación y proliferación celular transmitiendo a

196 Discusión futuras células hijas información errónea y aberrante que puede iniciar y, más adelante, promover el proceso carcionogenético [399, 400]. Otro de los genes incluidos en este trabajo de investigación ha sido RAR-Beta (RAR-B). La proteína que este gen codifica es importante por su implicación como gen tumor supresor en los mecanismos de control crecimiento y diferenciación celular, estableciendo un equilibrio entre procesos de proliferación y apoptosis. El gen RAR-Beta actúa como factor de transcripción dependiente de ligando que uniéndose a la región promotora de numerosos genes diana, dan lugar a su expresión o represión transcripcional. Es un importante gen tumor supresor que se ha observado que se encuentra metilado y por tanto no se expresa favoreciendo consecuentemente el crecimiento celular ininterrumpido, en diversos tumores sólidos como son el cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama [356]. Se cree que el silenciamiento del gen RAR-Beta favorece el crecimiento celular ininterrumpido. Concretamente, en muestras tisulares de cáncer de mama el promotor del gen se encuentra metilado hasta en un 43% de los tumores infiltrantes [352] relacionándose su estado de metilación con la mayor frecuencia de metástasis óseas, cerebrales y pulmonares [359]. Esto es, la metilación del gen podría, además, corresponderse con pacientes que presentan enfermedad tumoral diseminada. Por tanto determinar el estado de metilación en suero de este gen y derivado de ello, la consiguiente pérdida de expresión proteica derivada de la ausencia de su transducción proteica, podría servir como biomarcador predictivo del riesgo de metástasis en el cáncer de mama. Además, en diversos trabajos se ha observado que es posible la reactivación endógena de RAR-B al inducir la reacetilación de histonas en la secuencia promotora RAR-B P2 en líneas celulares de cáncer de mama sugiriendo también que RAR-B podría ser un objetivo importante para la terapia contra el cáncer [361]. Por otro lado la importancia pronóstica y predictiva de respuesta a la hormonoterapia que, con seguridad científica, se atribuye a la expresión intracelular de la proteína receptora de estrógenos nos hizo considerar el interés de analizar el perfil de metilación del promotor del gen RE en mujeres afectas de cáncer de mama. Es clásica la división del cáncer de mama en tumores, unos que

197 Discusión son hormonosensibles y aquellos otros que son hormono-independientes. El primer grupo lo constituyen aquellos tumores que expresan receptores hormonales y por lo tanto son subsidiarios de recibir tratamiento con hormonoterapia, tienen mejor pronóstico. En cambio aquellos que son hormonoresistentes por carecer de la expresión de estos receptores hormonales y que como consecuencia de la ausencia de esta proteína no se benefician del tratamiento hormonal, circunstancia además, les confiere un peor pronóstico. Otro de los genes que decidimos estudiar fue E-Cadherina por su implicación en el desarrollo de metástasis, al estar directamente relacionada con el mantenimiento de la correcta adhesión y polaridad existente de célula a célula, e implicada a su vez en los procesos de diferenciación celular, así como en el mantenimiento de la correcta homeostasis tisular. La proteína E-Cadherina es una glicoproteína transmembrana de 120kDa que interviene en la adhesión celular mediada por calcio indispensable para mantener la adhesividad e integridad de las células normales de los ductos mamarios. El papel de E-Cadherina es ligar las células epiteliales entre sí y mantener la integridad del epitelio estratificado y se ha descrito que su ausencia o su débil expresión contribuye a la pérdida o a la reducción de la adhesión celular favoreciendo la diseminación de las células del tumor y así la progresión tumoral, la invasión tisular y el desarrollo de metástasis en el cáncer a partir de estudios que se remontan a 1990 [401, 402]. En líneas generales se sabe que los tumores epiteliales pierden a menudo la expresión de E- Cadherina parcial o completamente y que esta pérdida se acompaña de la progresión hacia un proceso neoplásico invasivo debido a que los cambios en rutas de señalización y la pérdida de inhibición del contacto celular, actúan estimulando la migración celular así como interacciones estromales aberrantes que son responsables del desarrollo de metástasis a distancia [403]. El gen CDH1 que codifica para E-Cadherina, es un gen supresor de tumores asociado a las características de multicentricidad, invasividad, metástasis y mal pronóstico del carcinoma de mama principalmente en el cáncer lobulillar. Los mecanismos moleculares implicados en la disminución o pérdida de la expresión de E- Cadherina, pueden ser variables, mutaciones, pérdida de uno de los alelos con

198 Discusión pérdida de heterocigosis y procesos de metilación en el promotor del gen CDH1. Se ha descrito en al menos 8 tipos de tumores entre ellos el cáncer de mama, que el promotor de E-Cadherina se encuentra aberrantemente metilado correlacionándose este evento con la ausencia de su expresión proteica y consecuentemente con un mayor riesgo de desarrollo de metástasis [404, 405]. Finalmente también se incluyó en este trabajo la cuantificación de APC. La mayor parte de las veces las deficiencias en la función de APC son debidas a mutaciones dentro de la secuencia codificante del gen, y esto conduce a la falta de degradación, y a la acumulación nuclear de b-catenina que actúa como un activador transcripcional causando la pérdida del control del crecimiento celular [406]. Además las funciones de APC se centran en las rutas metabólicas que contrarrestan la diseminación metastásica a través de la mediación de esta proteína en la adhesión celular y la estabilización del cito esqueleto [407]. La pérdida de la expresión de APC y la regulación incrementada de b-catenina han sido descritas en líneas celulares de cáncer de mama humano y en células de los tumores mamarios [408]. Las mutaciones somáticas de APC han sido encontradas en una minoría de los casos de cáncer de mama[409], a pesar de la alta frecuencia con la que ocurre la pérdida de un alelo en el locus cromosómico 5q21. Sin embargo la inactivación epigenética de APC debida a la metilación del AND correspondiente a su región promotora es un hecho que ocurre con alta frecuencia tanto en las líneas celulares derivadas de cáncer de mama humano como en el tejido tumoral mamario. En la mayor parte de células de cáncer de mama que se han conseguido cultivar existe una complete concordancia entre la metilación de promotor de APC y el silenciamiento de su transcrito [410]. Lo anterior nos indujo a seleccionar este fragmento de ADN como posible biomarcador del cáncer de mama y a incluirlo en este estudio Discriminación entre casos - controles y entre controles sanos - controles con patología benigna En el caso del cáncer de mama, recientemente se ha propuesto que las alteraciones en el perfil de metilación del ADN aislado a partir de muestras de

199 Discusión pacientes con cáncer de mama pueden ser utilizadas como posibles marcadores del aumento del riesgo de desarrollar cáncer de mama en mujeres sanas. En este sentido se han descrito recientemente dos alteraciones en el perfil de metilación del ADN presentes en pacientes con cáncer y que podrían indicar que existe un patrón de metilación distinto en estos sujetos predispuestos. En una de estas observaciones se describe que la activación del REα que a su vez se encuentra relacionado con el riesgo aumentado de desarrollar cáncer de mama, se correlaciona con un bajo nivel de metilación del gen que codifica para RE (ERT) y por otro lado como un conjunto de genes (polycomb group target genes PCGT) que se encuentran relacionados con la biología de las células madre, se encuentran metilados con mayor frecuencia que otros genes en pacientes afectas de cáncer de mama. A partir de estos hallazgos se ha sugerido [411] que el análisis del estado de metilación de RE y PCGT podrían en un futuro contribuir a predecir el riesgo de desarrollar cáncer de mama. De igual forma también se ha descrito en estudios moleculares realizados una posible relación entre el estado de metilación de los genes RASSF1A y RAR-B en relación con un aumento del riesgo de desarrollar cáncer de mama incluso con independencia de una historia familiar de lesiones benignas y malignas de mama [412]. Incluso se ha publicado por autores como Lewis y col. que en mujeres que presentan lesiones benignas de mama en las que al aplicar el modelo predictivo de riesgo de Gail se obtienen cifras de 2, es decir en mujeres que presentan un riesgo elevado para desarrollar cáncer de mama, el porcentaje de metilación de los genes tumor supresor RASSF1A y APC se sitúa en torno a un 70% para RASSF1A y un 56% para APC frente al 29% y 20% encontrado en aquellas otras mujeres no afectas de cáncer de mama, en las que el modelo de Gail ofrece un resultado bajo o intermedio para el riesgo de padecer cáncer. De igual forma la ausencia de expresión transcripcional por silenciamiento de otros genes como RAR-B fundamentalmente correlacionado con la presencia de una historia familiar de cáncer de mama, se ha asociado con la presencia de cambios histológicos en el epitelio benigno de mama previo al desarrollo de un proceso tumoral. Estos

200 Discusión hallazgos podrían ser utilizados para la estratificación del riesgo de cáncer de mama de forma individualizada [352, 392]. Otros trabajos que han encontrado diferencias significativas en el perfil de metilación del ADN al comparar los resultados extraídos del estudio de mujeres sanas y compararlos con los procedentes de muestras tomadas en mujeres con cáncer de mama y que podrían contribuir al diagnóstico precoz han sido los realizados por Krassensteiny col. [302], Dulaimi y col. [272] y Hoque y col. [413]. En efecto de estos estudios se sabe que tras analizar un panel de genes, entre ellos p16ink4a, p14arf, RASSF1 y DAP kinasa, en pacientes afectas de cáncer de mama, al menos uno de ellos se encuentra metilado en una proporción que oscila entre el 100 y el 94% de las pacientes con cáncer de mama mientras que no está metilado en las mujeres sanas. Paralelamente se han correlacionado los niveles de metilación obtenidos en muestras tomadas de la sangre periférica y en muestras procedentes del lavado de los conductos galactóforos en pacientes diagnosticadas de cáncer de mama, obteniéndose una correlación del 82%, sin observarse diferencias significativas entre las muestras apareadas. Estos datos preliminares sobre el análisis del perfil de metilación en suero sugieren que el estudio de la metilación del ADN puede ser superior al CA 15-3 como marcador para el desarrollo de un cáncer de mama. Si se confirman estos resultados en nuevos estudios prospectivos, la metilación de determinados genes podría ser utilizada conjuntamente con la mamografía en el cribado poblacional del cáncer de mama. Así, en las mujeres en las que, por factores epidemiológicos, se pensase que tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama y en las que, al hacerles el estudio mamográfico éste fuese negativo, se podría realizar el análisis de un determinado panel de genes tal que si se encontrara ADN metilado para esos genes específicos se podría indicar el estudio de la mama mediante técnicas como la RNM y recomendar el seguimiento estrecho de la paciente para tratar de alcanzar un diagnóstico más precoz [392]. Por tanto, en nuestra opinión, deberían realizarse más estudios que comparasen el perfil de metilación del ADN en fluídos biológicos de sujetos sanos y en pacientes

201 Discusión con cáncer para así poder conocer, a través de su análisis, si es posible establecer un diagnóstico precoz del cáncer de mama y poder aplicarlo en la clínica. Este trabajo de investigación se ha realizado con el objetivo de evaluar la frecuencia y relevancia clínica que tiene la metilación de la región promotora de 5 genes implicados en distintas rutas de transcripción y que se han descrito como frecuentemente alterados en cáncer de mama así como analizar si este patrón de metilación aberrante puede ser utilizado como biomarcador plasmático de la presencia de enfermedad. Todo lo anteriormente expuesto parte del conocimiento de que el ADN derivado del tumor puede detectarse en el suero sanguíneo de los pacientes con cáncer, en nuestro caso cáncer de mama y que es posible aislar y cuantificar este ADN por medio de técnicas caracterizadas por su alta sensibilidad como es el caso de la PCR específica de metilación en tiempo real [414, 415]. Los resultados que hemos obtenido en este trabajo demuestran que existen diferencias en el patrón de metilación encontrado en las muestras extraídas de las personas incluidas en el grupo de pacientes con cáncer de mama y en las muestras de sangre extraídas a las personas que formaron parte del grupo control. Concretamente se ha observado que los niveles medios de los promotores de ESR1 y de sigma que se detectan en las muestras de suero son estadísticamente diferentes cuando se comparan los valores correspondientes a las pacientes con cáncer de mama y los valores que pertenecen a las personas constituyentes del grupo de controles sanos (p= para ESR1 y p= para sigma); no hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas al comparar los niveles medios de metilación encontrados en el subgrupo de controles sanos y en el subgrupo de controles sanos con patología benigna; en este último subgrupo es frecuente encontrar valores relativamente altos para algunos de los promotores de los genes estudiados, y esto es especialmente frecuente en el caso del promotor de sigma. No obstante es importante comentar que aunque las diferencias cuantitativas de metilación entre los genes analizados en el grupo control sano y con patología benigna en nuestro trabajo no han resultado ser estadísticamente significativas, en

202 Discusión otras series de pacientes en las que se han se han analizado patologías premalignas como hiperplasia DIN3 o CDIS estos niveles han sido estadísticamente diferentes respecto a los obtenidos en sujetos sanos. Este resultado sugiere que el proceso de metilación y su alteración juega un papel importante y temprano en el proceso de carcinogénesis de la mama y que es posible detectar pequeñas diferencias, y anomalías en este perfil de metilación, en etapas pre-invasivas de la enfermedad lo que confiere a estos procedimientos el potencial suficiente para ser utilizados en el diagnóstico precoz de la enfermedad [416]. En nuestra serie de controles sanos con patología benigna de mama este resultado no ha podido ser confirmado creemos que debido al bajo número de muestras recogidas y posiblemente también al hecho de haber incluido dentro del grupo a personas con lesiones benignas de la mama consideradas como no pre-invasivas. Nuestros resultados están en consonancia con recientes publicaciones en las que también se ha observado la existencia de diferencias entre el patrón de metilación en pacientes con cáncer de mama respecto al patrón de metilación encontrado estudiado en población sana. Esta concordancia sugiere que este tipo de ensayos podrían ser de aplicación para el screening del cáncer de mama [416, 417]. Sabemos que no existe ningún biomarcador que, con independencia del resultado anatomo-patológico correspondiente al estudio del tumor, pueda aportar información fidedigna que ayude a distinguir entre lesiones premalignas como el CDIS y lesiones benignas de la mama en etapas previas a hacerse invasivas. Es así que no podemos identificar aquellas lesiones premalignas que tiene mayor potencial para evolucionar y dar origen a un proceso tumoral maligno. Quizás el estudio del perfil de metilación pueda ayudar en un futuro a reconocer estas lesiones identificando las que tienen mayor potencial para hacerse infiltrantes. Si esto se consiguiese se avanzaría hacia una detección más temprana de la enfermedad, diagnosticando las lesiones pre-malignas antes de que se conviertan en procesos tumorales malignos propiamente dichos

203 Discusión Los resultados obtenidos demuestran la existencia de diferencias significativas en los valores de concentración sérica de metilación en el promotor de los genes ESR1 y sigma entre las pacientes con cáncer de mama y el grupo de pacientes sanas. De los resultados obtenidos en nuestro trabajo es posible calcular la sensibilidad y la especificidad diagnóstica que tendría un hipotético test basado en la determinación cuantitativa de ESR1 y sigma al aplicado al estudio de la población en general para el diagnóstico de personas con cáncer de mama. El primer paso fue elegir el punto de corte a partir del cual se considera que una concentración de promotor metilado excede del valor normal. Para ello hicimos uso del método de análisis estadístico basado en las curvas ROC (figura 8) y utilizando el programa GraphPad Prism, seleccionamos como punto de corte, tanto para ESR1 como para sigma, aquel valor de concentración de promotor que ofreciese los índice de Sensibilidad (S) y Especificidad (E) de manera que la razón de probabilidades fuera máxima (likelihood ratio). Estos valores han resultado ser de 0.02 para ESR1 y 0.05 para sigma. Para estos valores los resultados para sigma fueron Sensibilidad (S)= 75 % (IC del 95 %: 64-85) y Especificidad (E) = 53 % (IC del 95 %: 45-65) y de S = 65 % (IC del 95 %: 53-76) y E = 62 % (IC del 95 %: 52-71) para ESR1 respectivamente. Como quiera que los valores de S y de E difieren claramente de los óptimos (S = 1; E = 1) nuestros resultados no son los suficientemente consistentes como para que el test pueda ser aplicado al diagnóstico del cáncer. No obstante al ser ESR1 y sigma factores independientes (p=0.9721), es posible analizar los valores de sensibilidad y especificidad que se obtienen cuando se combina el resultado de la determinación del nivel de metilación de ambos promotores, ESR1 y sigma, aplicando para ello el test exacto de Fisher. Con esta nueva aproximación se observa que mejoraba sustancialmente tanto la sensibilidad como la especificidad. Así si definimos la presencia de enfermedad en un sujeto elegido al azar cuando uno de los dos genes (+/-, -/+) o ambos (+/+) estuviesen metilados y la ausencia de ésta cuando ninguno de los dos estuviesen metilados (-/-), la sensibilidad del test sería del 81% (95% IC: 72-88) y la especificidad del 55% (95% IC: 40-67) con p< Es decir mejoramos el índice de sensibilidad a cambio de una

204 Discusión relativamente baja especificidad. En cambio si consideramos como enfermedad sólo aquellos casos en los que ambos genes se encuentran metilados (+/+) y ausencia de enfermedad en el resto de los casos (+/-, -/+, -/-), alcanzaríamos una baja sensibilidad 37% (95% IC: 73-47) a consta de una alta especificidad 88% (95% IC: 78-94) p= Tabla 53. Tabla 53. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test para el diagnóstico de cáncer de mama usando RE y sigma como biomarcadores RE ó Sigma Cáncer mama Controles Sanos RE ó Sigma Cáncer mama Controles Sanos Enfermedad (+) +/- -/+ +/ Enfermedad (+) +/ Enfermedad (-) -/ Enfermedad (-) +/- -/+ -/ P < P = Sensibilidad = 81% (95% IC: 72-88) Sensibilidad = 37% (95% IC: 73-47) Especificidad = 55% (95% IC: 40-67) PPV = 72% (95% CI: 63 80) Especificidad = 88% (95% IC: 78-94) El análisis de estos resultados es un ejemplo de un clásico dilema que nos encontramos habitualmente en la decisión diagnóstica. Es decir si el objetivo es diagnosticar el mayor número de casos de cáncer de mama, el teórico caso es descrito como un caso potencial cuando los valores de ESR1 y/o los valores de sigma están por encima de los valores definidos como normales, por lo tanto necesitaríamos un test con una alta sensibilidad. Sin embargo, si el objetivo es identificar el mayor número de individuos sin cáncer, el sujeto caso es considerado sin enfermedad cuando los valores de ambos marcadores biológicos son inferiores a los puntos de corte identificados y por lo tanto necesitaríamos un test con una alta especificidad. De igual forma si analizamos lo que ocurriría al aplicar este hipotético test en población sana incluyendo dentro de esta población a las mujeres afectas con patología mamaria benigna, es fácil entender que si consideramos como completamente sanas aquellas mujeres en las que los niveles de metilación en

205 Discusión ambos genes están por debajo del rango de la normalidad (-/-), existe una mayor proporción de sujetos con niveles bajos de ambos biomarcadores en el grupo de mujeres incluidas dentro del grupo control sin enfermedad alguna que en el grupo de mujeres afectas de patología benigna con p < Este hecho sugiere que un test de este tipo también podría ayudar a diferencias entre ambos grupos de mujeres (tabla 54). Tabla 54. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test cuando se compara el Grupo casos con enfermedad tumoral benigna de la mama con el Grupo control. RE ó Sigma Patología Benigna mama Controles Sanos RE ó Sigma Patología Benigna mama Controles Sanos Enfermedad (+) +/- -/+ +/ Enfermedad (+) +/+ 9 9 Enfermedad (-) -/ Enfermedad (-) +/- -/+ -/ P < P = 0.09 Sensibilidad = 70% (95% CI: 53 85) No significación estadística Especificidad = 55% (95% CI: 43 67) Incluso si analizamos lo que sucedería al encontrarse metilado alguno o ambos genes los resultados serían estadísticamente no significativos. Esto podría ayudar en el diagnóstico de patologías benignas que en ocasiones puede ser una potencial fuente de confusión para el diagnóstico de lesiones malignas. Así, el empleo de biomarcadores unidos a los estudios mediante la imagen que habitualmente se realizan ante la presencia de una lesión mamaria sospechosa de malignidad, quizás pueda ser en un futuro un complemento importante para mejorar la exactitud diagnóstica no cruenta preoperatoria. No obstante, estas son sólo observaciones iniciales que requieren más investigaciones y estudios que permitan esclarecer la importancia de los biomarcadores en clínica así como encontrar las combinaciones óptimas de promotores génicos metilados a estudiar en cada caso

206 Discusión Monitorización y respuesta biológica de los biomarcadores en sangre periférica tras tratamiento Uno de los actuales desafíos en la práctica clínica oncológica es el poder evaluar la respuesta al tratamiento durante la administración del mismo para poder anticiparnos a una posible resistencia, a la recurrencia o a la progresión de la enfermedad durante el tratamiento. Hasta el momento, ningún método de imagen, tampoco ningún test analítico, ha resultado ser lo suficientemente sensible ni específico para, supervisando la eficacia de los tratamientos administrados, pueda servir para alertar sobre la resistencia terapéutica, la reaparición de la enfermedad o la presencia de metástasis a distancia. Actualmente uno de los métodos que hoy día se emplean con este fin, se basan en la monitorización de la respuesta al tratamiento mediante la determinación en sangre de marcadores tumorales durante el tratamiento y, posteriormente, a lo largo del tiempo en el que el paciente está sometido a revisiones periódicas. De esta forma intentamos identificar aquellas pacientes que son resistentes al tratamiento, progresan durante éste o presentan una recurrencia de la enfermedad. Sin embargo sabemos que estas determinaciones bioquímicas están sujetas a múltiples limitaciones y que en ocasiones fracasan en el intento de alertarnos sobre la mala evolución de la enfermedad sometida a tratamiento. En este sentido la determinación cuantitativa de nuevos biomarcadores como el estudio del estado de metilación de determinados genes quizás podría ser una herramienta válida potencialmente más sensible para la predicción y monitorización de la respuesta al tratamiento a partir de la cuantificación de fragmentos de ADN tumoral metilado obtenidos de muestras del suero de las pacientes. En nuestro trabajo de investigación hemos observado que existen diferencias entre los valores de concentración sérica de los biomarcadores sigma y ESR1 cuando se comparan los grupos constituidos por pacientes con cáncer de mama y por sujetos sanos. Partiendo de este resultado y del supuesto de que una vez resecado el tumor y tratado con RT y/o QT adyuvante, por lo tanto quedara eliminada la fuente de ADN metilado procedente del tumor, hemos

207 Discusión querido analizar los cambios que se producen en los niveles séricos de metilación correspondientes a los 5 genes estudiados. Esta parte de nuestro trabajo tenía como objetivo investigar si alguno de los biomarcadores ensayados puede ser utilizado como indicador capaz de predecir el riesgo de desarrollar metástasis o de recidiva de la enfermedad con anterioridad a que la enfermedad recurrente o la metástasis fuesen clínicamente manifiestas. Para ello cuantificamos los niveles séricos de metilación de los promotores de E-Cadherina, RAR-β, sigma, RE y APC antes y después de realizado el tratamiento indicado en cada caso. Los resultados obtenidos en este trabajo nos permiten describir que al término del tratamiento se observa un descenso en el nivel de metilación con respecto al nivel de metilación que se encontró en las mismas enfermas antes de iniciar el tratamiento. En la comparación estadística de los resultados obtenidos no pudimos encontrar diferencias significativas los que puede atribuirse al bajo intervalo de tiempo transcurrido, aproximadamente 2 semanas, entre el fin del tratamiento y la extracción sanguínea final. Probablemente hubiese sido necesario medir estos biomarcadores después períodos de tiempo más largos para clarificar su importancia y comportamiento al final del tratamiento. Sin embargo lo que sí hemos podido demostrar es que, en el subgrupo de pacientes que desarrollaron metástasis a distancia en nuestra serie (12 pacientes) y de las que dispusimos de muestras (7 pacientes), de ESR1 y sigma metilado a partir de las muestras extraídas inmediatamente tras finalizar el tratamiento fue inferior que en el resto de las pacientes que no desarrollaron metástasis a distancia y que incluso en una tercera toma sanguínea que pudo conseguirse en el momento de la aparición de la metástasis en 5 de las pacientes con metástasis se observó un aumento de los valores de ESR1 y sigma metilado lo que podría indicarnos que, la escasa disminución inicial, y el subsiguiente ascenso de los niveles de biomarcadores presentes en el suero de las enfermas, correspondiese con la existencia de masa tumoral residual y con su crecimiento posterior

208 Discusión En cualquier caso nos parece claro que la metilación aberrante de las regiones promotoras en determinados genes es un acontecimiento clave en el desarrollo y progresión del cáncer, y que estos cambios epigenéticos ocurren en etapas tempranas del desarrollo tumoral, manifestándose como alteraciones específicas de los tumores. Por todo ello pensamos que la determinación cuantitativa del nivel de metilación de las regiones del promotor de determinados genes puede contribuir de forma significativa a la detección temprana del cáncer, ayudar a determinar de forma más precisa el pronóstico de la enfermedad así como contribuir a la predicción de la respuesta al tratamiento indicado. Una revisión de la literatura científica en relación con este tema nos permite saber que la determinación del estado de metilación de GSTP1 puede ayudar al diagnóstico precoz del cáncer de próstata, la metilación de MGMT a la predicción de respuesta a la terapéutica con agentes alquilantes en pacientes diagnosticados de Glioblastoma Multiforme y que la determinación del estado de metilación de PITX2 ayuda a predecir la supervivencia en pacientes afectas de cáncer de mama sin afectación ganglionar, aun cuando la validación de estos resultados exige su confirmación mediante estudios prospectivos en los que se incluyan un mayor tamaño muestral [418, 419] Correlación de los Biomarcadores hipermetilados y las variables clínico patológicas La afectación ganglionar, la sobreexpresión de Her2-neu, así como el tamaño tumoral y la expresión de receptores hormonales son algunos de los factores pronóstico más importantes conocidos en el cáncer de mama [420]. Otros factores han sido investigados para analizar su potencial para predecir el pronóstico de la enfermedad en los pacientes diagnosticados de cáncer de mama aun cuando los resultados obtenidos carecen de significación. Así, se ha sido investigado el papel de las proteínas reguladoras del ciclo celular [421], y la presencia de células tumorales en médula ósea de las pacientes, en donde si bien los resultados obtenidos sugieren cierta validez indican, también, que estos hallazgos precisan de una evaluación aun más rigurosa [422]

209 Discusión Sin embargo hasta ahora, hemos encontrado muy pocos trabajos en los que se haya estudiado el valor pronóstico de las alteraciones epigenéticas encontradas en el ADN extraído de muestras de sangre de las pacientes afectas de cáncer de mama, o que se haya estudiado la correlación de estos parámetros con los aspectos clínico patológicos que caracterizan el tumor o con la expresión de los receptores hormonales. En este trabajo de investigación hemos evaluado el potencial pronóstico de ADN metilado cuantificado en el suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama y, específicamente hemos centrado nuestro trabajo en la cuantificación de RE, E-Cadherina, sigma, RAR-Beta y APC para conocer si los niveles plasmáticos de estos fragmentos de ADN añaden información de utilidad para estimar de forma más precisa el pronóstico de las pacientes con cáncer de mama y que pudiese ser complementaria a la que nos proporcionan los parámetros que actualmente utilizamos en la clínica diaria. Para avanzar en este supuesto hemos estudiado las posibles correlaciones entre los distintos genes analizados y las variables pronósticas tanto demográficas como aquellas dependientes del tumor. De acuerdo con nuestros resultados parece que la metilación aberrante de sigma se correlaciona con factores pronósticos adversos como son la afectación ganglionar y el tamaño tumoral; así, las pacientes con afectación ganglionar presentan niveles de metilación de sigma superiores a los que se encuentran pacientes sin afectación ganglionar y estas diferencias son estadísticamente significativas (p<0.05). De igual forma se observó que cuanto mayor es el T mayores son los niveles de metilación de sigma siendo las diferencias encontradas estadísticamente significativas. La explicación que podríamos dar a este hecho está relacionada con la implicación que tiene sigma en los procesos que conducen a la proliferación y a las ventajas que las células tumorales tienen para prolongar su supervivencia. Sin embargo hasta ahora, pocos estudios han analizado el valor pronóstico de las alteraciones epigenéticas a partir de muestras sanguíneas de las pacientes así como su correlación e influencia en el tumor de la expresión de marcadores moleculares como la expresión de los receptores hormonales

210 Discusión En este trabajo de investigación evaluamos el potencial pronóstico de ADN metilado en el suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama a partir de la cuantificación de RE, E-Cadherina, sigma, RAR-Beta y APC para conocer si podía aportar algún dato más que nos aproximara a estimar de forma más precisa el pronóstico de las pacientes con cáncer de mama y que pudiese ser complementaria a la información pronóstica que actualmente utilizamos en la clínica diaria. Para ello correlacionamos los distintos genes analizados con las variables pronósticas tanto demográficas como aquellas dependientes del tumor. De acuerdo con ello observamos que la metilación aberrante de sigma se correlacionaba con factores pronósticos adversos como son la afectación ganglionar y el tamaño tumoral, tal que se observó que las pacientes con afectación ganglionar presentaban niveles de metilación de sigma superiores de forma estadísticamente significativas respecto a las pacientes sin afectación ganglionar (p<0.05). De igual forma se observó que cuanto mayor es el T mayores niveles de metilación de sigma se obtuvieron de forma estadísticamente significativa. La explicación que podríamos dar a este hecho está relacionada con la implicación que tiene sigma en la proliferación y supervivencia celular tumoral [423]. Actualmente ssabemos que sigma, es un gen tumor supresor que actúa regulando negativamente el ciclo celular promoviendo la parada de las células en fase G2-M. Su incremento de expresión, cuando se estudian líneas celulares de cáncer de mama, parece ser antagonista de la promoción del crecimiento celular impulsada por oncogenes y de la transformación de las células hacia elementos con mayores características malignas [399]; mientras que por otra parte su silenciamiento permite a los queratinocitos humanos primarios crecer indefinidamente alcanzando características de inmortalización evadiendo la senescencia [424]. Nuestros resultados no nos han permitido encontrar ninguna otra relación entre variables clínicas tales como la edad de la menarquía, la menopausia o la paridad y las variables moleculares introducidas en este trabajo. Estos resultados están en consonancia con recientes estudios realizados donde se ha observado como el encontrarse metilado de forma aberrante los genes APC y

211 Discusión RASSF1A en mujeres afectas de cáncer de mama antes de cualquier tratamiento oncológico es factor pronóstico independiente para la supervivencia global, asociándose a una peor supervivencia que aquellas otras pacientes en las que estos mismos genes se encontraban metilados [425]. Otros estudios como los realizados por Feng Jing [426] obtuvieron resultados similares al analizar la repercusión de presentar metilados los genes p16 y BRCA1 en mujeres con cáncer de mama concluyendo que se asociaba junto a la afectación ganglionar a un peor pronóstico y a un mayor riesgo relativo (RR) de muerte por cáncer de 6.4 y 5.5 respectivamente. En este sentido se ha sugerido que la presencia de anomalías epigenéticas en el ADN extraído de muestras del ganglio centinela afectas por metástasis de cáncer de mama podría aumentar la sensibilidad para la predicción de una recidiva ganglionar y alertar sobre el peor pronóstico de la paciente afecta si bien son necesarios más estudios, incluyendo un mayor seguimiento de las pacientes para extraer conclusiones fidedignas [281] CORRELACIÓN DE FENOTIPOS LUMINALES EN CÁNCER DE MAMA Y METILACIÓN El cáncer de mama es una patología compleja en la que múltiples factores histológicos, anatomo-patológicos, moleculares y clínicos se interrelacionan. De su análisis pormenorizado es posible extraer datos que, aproximándonos al pronóstico de la enfermedad, nos permiten ofrecer las opciones terapéuticas más adecuadas a cada caso. Recientemente y gracias a los avances producidos en el campo de la Biología Molecular, la Proteómica y la Genómica, se ha conseguido avanzar en el conocimiento molecular del cáncer y, través del análisis de rutas de transcripción de señales y de la funcionalidad de los receptores de membrana, avanzar hacia tratamientos determinados por el perfil molecular que expresan las células del tumor. Todo esto ha permitido el avance del conocimiento molecular en el cáncer de mama y la descripción de distintos subtipos fenotípicos principalmente atendiendo a su perfil de expresión. Esta clasificación es importante porque contiene elementos que facilitan el pronóstico y permiten la

212 Discusión predicción de la respuesta al tratamiento oncológico. Es bien sabido que la expresión de receptores de estrógenos (RE) en el espécimen tumoral representa uno de los principales factores pronóstico de supervivencia a largo plazo y es predictivo de la respuesta de la enfermedad al tratamiento hormonal. También se sabe que esta proteína juega un importante papel en la iniciación y progresión del cáncer del cáncer de mama. Así aquellas pacientes con tumores que expresan REpositivos se asocian a un pronóstico más favorable y, en su tratamiento se debe incluir la terapia hormonal con Tamoxifeno y/o Inhibidores de la Aromatasa; sin embargo en aquellas pacientes que presentaban tumores con RE-negativos el tratamiento hormonal carece de utilidad terapéutica aunque sí es un elemento que incide sobre el pronóstico de la enfermedad al asociarse más frecuentemente con los casos en los que el curso de la enfermedad es más adverso. Sabemos que alrededor del 25 % de los cánceres de mama no expresan RE en el momento del diagnóstico siendo por lo tanto resistentes al tratamiento hormonal [372].Incluso en algunos casos la expresión de RE inicial puede negativizarse a lo largo del curso de la enfermedad perdiendo la sensibilidad a dicho tratamiento hormonal [427]. Explicar este hecho y encontrar la causa por la que el cambio de fenotipo sucede es complejo sin que actualmente se haya podido describir una causa genética como deleciones, translocaciones, reagrupamientos o inserciones que puedan ser responsables del cambio en el perfil de expresión de RE [428]. En nuestra revisión de la literatura relacionada con este tema no hemos podido encontrar que se hayan realizado estudios que correlacionen el perfil epigenético de metilación y su relación con el estado de expresión de RE o con otros factores pronósticos como la amplificación de HER2-neu. Distintos autores han descrito que la expresión de RE en el tumor correlaciona con la metilación de diferentes genes y a su vez con un mejor o peor pronóstico, pero aún no se ha analizado la metilación del promotor del gen RE con la ausencia de expresión de RE en tumor. Así autores como Widschwendter y col.[337] han descrito la existencia de relación entre el estado de metilación de APC y casos de cáncer de mama RE-positivo mientras que otros trabajos como el de Li y col. [429] han sugerido que en pacientes RE-positivo parecía existir hipermetilación de los promotores del gen Twist con mayor

213 Discusión frecuencia mientras que la metilación del promotor del gen CDH1 ocurría con mayor frecuencia en pacientes con tumores RE-negativos. En este trabajo de investigación y partiendo de los casos en los que hemos encontrado hipermetilación del promotor de ESR1 en el suero de las pacientes con cáncer de mama, hemos sometido a análisis esta señal de silenciamiento epigenético del gen ESR1 con el fenotipo luminal encontrado al estudiar histopatológicamente el tumor con la ausencia de expresión de la proteína RE en el tumor. Para ello hemos analizado la correlación entre el estado de expresión de RE en el tumor y el estado de metilación de la región promotora de ESR1 aislado en el suero de las pacientes. De los resultados obtenidos se observó que el estado metilado de ERS1 en el suero se correlacionaba de forma estadísticamente significativa con la ausencia de expresión de RE en tumor y viceversa (p=0.0179). Este resultado concuerda con los datos publicados por Lapidus y col. y Ottaviano y col. [375, 430] en líneas celulares de cáncer de mama. En efecto, estos autores han descrito que el promotor ubicado en el exón 1 del gen RE se encuentra altamente metilado en las líneas celulares que no expresan RE y en cambio no está metilado en el tejido mamario normal y en las líneas celulares de cáncer de mama que expresan una proteína receptora de estrógenos funcionante. Al analizar lo que sucede al correlacionar el fenotipo luminal con estado de metilación de RE, observamos que en los casos con fenotipo de mejor pronóstico (luminal A y luminal B) predomina la forma molecular no metilada del promotor del gen ESR1, es decir, existe cierto nivel de correlación entre la expresión de RE y mejor pronóstico, mientras que en los fenotipos con peor pronóstico (Her2-neu y triple negativo) predomina la forma molecular metilada (p<0.05). Incluso al analizar en cada fenotipo luminal el porcentaje de ESR1 metilado frente a ESR1 no metilado, observamos como dentro de cada subgrupo aquellos que presentan ESR1 no metilado y por lo tanto expresan receptores de estrógenos tienen una tendencia a mejor supervivencia que aquellos que son ESR1 metilados. Por lo tanto parece que el la variante molecular del promotor del gen ESR1 metilada, no-metilada, aporta información pronóstica adicional a los factores pronósticos que actualmente manejamos en oncología clínica del cáncer de mama

214 Discusión Es decir a la vista de estos resultados podemos decir que el silenciamiento génico por metilación de la región promotora del gen del receptor de estrógenos ESR1 tiene un importante papel en la expresión de la proteína que dicho gen codifica, que repercute sobre su presencia en el tumor primario, encontrándose que la proteína está ausente en el tumor (RE-negativo) cuando en sangre periférica el promotor del gen está metilado y viceversa. Estos datos demuestran que el ADN del tumor llega a la circulación periférica donde puede identificarse y que de su estudio pueden surgir elementos que faciliten el pronóstico o indiquen cual puede ser la respuesta a determinado tipo de tratamiento. Por otra parte como la metilación en cáncer es un evento reversible también es claro que su modulación pueda en un futuro constituirse como una diana terapéutica sobre la que sea posible actuar clínicamente

215 CONCLUSIONES

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217 Conclusiones 6. CONCLUSIONES. Los resultados obtenidos en este trabajo nos han permitido formular las siguientes conclusiones: 6.1 Las alteraciones epigenéticas del genoma como la metilación de la región promotora del ADN y remodelación de la cromatina que tienen un papel clave en la iniciación y progresión del cáncer, pueden ser detectadas y cuantificadas a partir de muestras procedentes del suero de pacientes mediante la técnica de detección del ADN por la reacción cadena de la polimerasa específica de metilación. 6.2 La cuantificación en sangre periférica del perfil de metilación en población sana a partir de los resultados obtenidos podría ser utilizada como prueba complementaria a las conocidas en el momento actual en el diagnóstico precoz si bien aún son necesarios más estudios prospectivos que validen esta técnica para dicho fin. 6.3 Así mismo la cuantificación en sangre periférica del perfil de metilación en población afecta de cáncer de mama de los promotores sigma y RE puede ser de utilidad para monitorizar la respuesta al tratamiento así como para aportar información pronóstica adicional sobre la evolución de las pacientes tratadas de cáncer de mama. 6.4 De la correlación entre ESR1 metilado en suero y la ausencia de expresión de RE en el tumor, podemos deducir que la metilación representa un importante mecanismo de silenciamiento génico en la carcinogénesis del cáncer de mama que explica en gran parte la ausencia de expresión de receptores hormonales en el tumor y con ello la hormonoresistencia al tratamiento hormonal. 6.5 La metilación del ADN puede diferenciar subgrupos pronósticos dentro del fenotipo luminal que nos aproximan a un mejor conocimiento de los mecanismos de silenciamiento implicados en la ausencia de transcripción de factores implicados la correcta regulación del ciclo celular favoreciéndose la actividad de factores estimulantes de proliferación y supervivencia celular incontrolado. 211

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222 Publicaciones y Comunicaciones

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