Regulación de la expresión en Eucariotas

Transcripción

1 Regulación de la expresión en Eucariotas Amplificación Génica Proteínas o RNAs que se requieren en abundancia están codificados por genes múltiples Duplicación génica Control genómico La estructura de la cromatina impide la accesibilidad de factores de transcripción a promotores Control Transcripcional Elementos en cis secuencias específicas en el DNA Elementos en trans Proteínas regulatorias Control Postranscripcional 1

2 Control Transcripcional Elementos de la región promotora: Transcripción basal 2

3 Promotor eucariota Elementos upstream Promotor basal core Enhancers 3

4 PROTEINAS ACTIVADORAS Factores de transcripción específicos que reconocen secuencias cortas consenso en promotores o enhancers Actúan incrementando la frecuencia de transcripción Proteínas activadoras Constitutivas: Se expresan ubicuamente Regulatorias: reconocen secuencias consenso llamadas: elementos de respuesta. Se unen a su elemento de respuesta cuando están disponibles o activas. Coactivadoras: dominio de activación. Se unen a otra proteína activadora 4

5 Factores de Transcripción Regulatorios Actividad del Factor de Transcripción regulada en tiempo y espacio por distintos mecanismos 5

6 Regulación de la expresión: gen de Metalotioneina Expresión constitutiva (baja): TATA box, GC box, BLE, TRE Expresión inducida (alta): MRE, GRE 6

7 Proteínas reguladoras de la transcripción Proteínas activadoras (o represoras) Dominios independientes Dominio de unión a DNA Unión a secuencias específicas en el DNA Secuencias dentro de la región promotora UPE (afectan únicamente al promotor al cual están ligadas) Enhancer Dominios de activación Contacto directo con complejo de pre-iniciación Mediator: Interfase entre proteínas activadoras y RNA polimerasa 7

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9 Dominios de activación Modificaciones de la cromatina Complejos remodeladores de cromatina SAGA, Swi/SNF Modificación de histonas Introducción de modificaciones en el DNA Interacción con el complejo de iniciación (aparato basal o RNA polimerasa) 9

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11 Maquinaria transcripcional de levaduras 11

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14 Dominios de Unión al DNA Permite la unión específica de la proteína a secuencias de DNA Interacción con la secuencia de nt penetración en surcos mayor o menor de la doble hélice Interacción general con la superficie de la molécula de DNA estabiliza el complejo DNA-proteína Motivos de Unión a DNA Helix turn helix Zinc finger Helix loop helix Leucine zipper Homeodominios Dímeros: Unión específica más fuerte Modulación Mayor repertorio de proteínas 14

15 Helix turn helix 2 hélices separadas por un giro -turn de 4 aminoácidos 1er helice y -turn posicionan a la 2nda hélice contacto con el surco mayor del DNA. La secuencia de aminoácidos de la segunda helice determina especificidad de secuencias. Represor del operón lactosa Represor Fago lambda CAP-AMPc 15

16 Motivo homeodominio Homeobox: Secuencia que codifica para un dominio de 60 aminoácidos. Presente en muchos genes relacionados con regulación del desarrollo temprano 3er alfa hélice: reconocimiento específico de DNA (surco mayor) 16

17 Zinc finger Cys2 His2 Factor de transcripción TF III A (9 repeticiones) SP1 (3 repeticiones) Cada alfa hélice 2 contactos específicos con DNA 17

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19 Receptor esteroide Zinc finger Cys2 Cys2 2 alfa hélices plegadas formado un dominio globular Actúan como dímeros reconocimiento de secuencias repetidas (box P). Distancia entre repeticiones determinadas por box D 19

20 Zn Finger: Dímeros Reconocimiento de secuencias cortas repetidas (palindrómicas o repeticiones directas) 20

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22 Modo de acción glucocorticoides Receptores esteroides Reg central: Unión a DNA (Zn Finger) y dimerización. Reg C-terminal: Unión al ligando (hormona) N-Terminal: activación transcripción a través de complejo co-activador (Ej: acetilación de histonas) 22

23 Homodímeros : GR, MR, AR, PR (sec.consenso: TGTTCT) ER (TGACCT) Heterodímeros: RXR (9 cis ácido retinoico + otros 15 receptores (T3R, VDR, RAR)) 23

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25 LEUCINE ZIPPER Homo y heterodímeros Motivo de leucine zipper dimerización Región de aminoácidos básicos adyacente (Unión al DNA) Secuencia target repeticiones invertidas sin separación. C/EBP (CAAT box) Jun/Fos (Factor AP1) 25

26 Helix loop helix 2 Hélices alfa anfipáticas separadas por una región linker (loop) Región adyacente básica: Unión al DNA (bhlh) HLH : Dimerización Orientación correcta de regiones básicas 26

27 Mecanismos postranscripcionales Procesamiento del RNAm Splicing alternativo Sitio de clivaje y poly A Editing Exportación Localización del RNAm Estabilidad del RNAm RNAi Traducción 27

28 Exportación de RNAm 28

29 Mecanismos de localización del RNAm Transporte activo por citoesqueleto: Microfilamentos de actina (distancias cortas) Microtúbulos (distancias largas) Proteínas motoras (miosina, dineína y kinesina) Difusión pasiva y anclado del mrna Degradación generalizada y protección local del mrna 29

30 Localización del RNA: Determinada por secuencias específicas en el 3 UTR (cis) reconocidas por factores en trans (en general proteínas) Producción de alta concentración de proteína localizada. ( actina en fibroblastos) Gradiente de morfógeno (Proteína bicoid en huevos de Drosophila) Localización de mrna en distintas células hijas o blastómeros (iniciación de linajes celulares) 30

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32 Mecanismos de degradación de RNAm Competencia entre traducción y degradación del RNAm ARE (sec de 50b ricas en AU) Característica común de algunos ARNm inestables, localizada en 3 UTR. Favorece deadenilación Secuencias de reconocimiento de endonucleasas 32

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34 Regulación de la traducción en Eucariotas Regulación de la Iniciación Regulación global : Corregulación temporal y espacial de la mayor parte de los transcriptos. Disminución de la síntesis de proteínas por: Estres, Infección, UV, Hipoxia, Ayuno Aumento de síntesis de proteínas por estimulación hormonal o factores de crecimiento. Regulación específica de transcripto Regulación por proteínas de unión al mrna que se unen a elementos en cis en las UTRs 34

35 Regulación de la traducción por disponibilidad de factores de iniciación Regulación global Fosforilación de subunidad eif2 (inhibe reciclado de GDP/GTP) PK dependiente de dsrna (PKR) Inhibición regulada por carencia de grupo hemo GEF (eif-2b) limitante para traducción 35

36 Regulación específica de transcripto Elementos en cis en las regiones no codificantes: 5 UTR Elementos (secuencias) de unión de proteínas ORFs upstream 3 UTR Estabilidad del mrna Localización Regulación de iniciación» Bloqueo de circularización (impide reciclado desubunidad pequeña)» Proteínas inhibitorias que desensamblan o inactivan el complejo de iniciación 36

37 Iniciación en Eucariotas Regulación de la Traducción 37

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39 Regulación de la traducción mediada por hierro 39

40 Modelos de control de la Traducción que involucran circularización del mrna Regulación por inhibición de la circularización Regulación dependiente de circularización 40

41 Largo de las regiones no traducidas 5 y 3 (UTRs) de los mrna en distintas especies 41

42 Interferencia de RNA y Silenciamiento de genes (PTGS) Presente en plantas y animales Rol en defensa viral y mecanismo de silenciamiento de retrotransposones Rol en regulación de la expresión Herramienta para generar knock out de la expresión de genes específicos 42

43 Mecanismo de RNAi 43

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47 SISTEMAS DE EXPRESIÓN EUCARIOTAS MAMÍFEROS Expresión Constitutiva Promotores virales (CMV, RSV, SV40) Expresión Inducible Lac Tetraciclina Ecdisona 47

48 Promotores Eucariotas Constitutivos Enhancer-promotor CMV (inmediato temprano) ENHANCER PROMOTOR TATA CREB/ATF SRE AP1 SP1 YY1 RA Elementos regulatorios constitutivos e inducibles Expresión alta en células diferenciadas y baja en cél. no diferenciadas (elementos represores) 48

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50 Promotores Inducibles Originalmente Heat Shock Metales pesados Esteroides Desventajas Efectos pleiotrópicos de los inductores Actividad basal alta Bajo nivel de inducción Nuevos sistemas Vector regulatorio Vector de expresión 50

51 Promotores Inducibles por Lac Promotor constitutivo laci P laco Gen de interés 51

52 Expresión regulada por Tetraciclina Represor Tet bacteriano operador tet (operón de resistencia a Tetraciclina Tn10) Inductor: Tetraciclina VP6: proteína activadora de la transcripción con dominio acídico (HSV) 52

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