Prácticas integradas de Ecología molecular microbiana

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1 Prácticas integradas de Ecología molecular microbiana Indice. Página 1. Introducción 1 2. Cronograma 1 3. Esquema de trabajo 2 4. Reactivos utilizados 3 5. Preparación de las Muestras 3 6. Hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) 5 7. Extracción del ADN 7 8. Amplificación por PCR 8 9. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) Amplificación del gen del ARNr 16S para la construcción de genotecas 16

2 1. Introducción Las técnicas de microbiología tradicionales requieren la obtención de cultivos puros (lo que no siempre es posible) y múltiples ensayos de laboratorio, por lo que son poco adecuadas para estudiar la biodiversidad de un ecosistema. Durante la década de los 90 se desarrollaron una serie de técnicas de biología molecular que han supuesto una revolución en el campo de la Ecología microbiana. Dichas técnicas, basadas en el 16S rrna, permiten estudiar la biodiversidad microbiana de un ecosistema sin necesidad de proceder al aislamiento de las especies que lo integran. En estas prácticas vamos a emplear tres de las principales técnicas aplicables a estudios de ecología molecular microbiana: la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE/TGGE), la hibridación in situ con sondas de DNA marcadas con un cromóforo fluorescente (FISH), y la construcción y rastreo de genotecas. Se trabajará con muestras naturales (suelo) y artificiales: flóculos de la depuradora de fangos activos de la UAM (aerobia) y biomasa (lodo granular) un reactor UASB (anaerobio). 2. Cronograma Este grupo de prácticas se estructura en cinco sesiones intensivas de laboratorio (4-6 horas de duración), más una sesión teórica previa y una sesión de análisis de resultados posterior. 1ª Sesión. Fijación de las muestras para FISH (lo harán los monitores por la mañana) Preparación de las muestras Extracción y limpieza del DNA Análisis del DNA en gel de agarosa. PCR gen 16S rrna utilizando cebadores universales para los dominios Bacteria (para genoteca) y Archaea (para PCR anidada). Dejar overnight. Lavado de las muestras para FISH. 2ª Sesión PCR utilizando cebadores universales para los dominios Bacteria y Archaea (para DGGE, fragmento del gen 16S rrna). Si es posible, hacer PCR directa y anillada. Preparar y correr gel de agarosa para analizar productos PCR de la primera sesión. Preparar geles de agarosa para analizar la PCR para DGGE. FISH: observar mediante contraste de fases o tras tinción con DAPI para ver dilución adecuada para conteo. 1

3 Clonación: ligación para hacer una genoteca. Dejar overnignt. 3ª Sesión Preparar las placas LB Clonación: transformación y plaqueo en placas LB-Amp Preparar gel DGGE Correr gel de agarosa para analizar la PCR para DGGE FISH: fijar las muestras en portas. Recoger y guardar placas genoteca 4ª Sesión FISH: hibridación y lavado Picar colonias genoteca en placa maestra. Cálculo eficiencia clonación. Correr DGGE (o.n.) 5º Sesión Revelar y ver DGGE Observación revertientes Análisis microscópico (cuantificación) de las hibridaciones del FISH. 3. Esquema de trabajo. MUESTRA Extracción de ADN Hibridación in situ PCR DGGE Genoteca 2

4 4. Reactivos utilizados. 29-HindIII ADN 4,6-diamino-2-fenol-dihidrocloruro (DAPI) Acrilamida / bisacrilamida (40%) (37,5:1) Acido clorhídrico Acido bórico Agarosa Bromuro de etidio Citifluor AF-1 Cloruro sódico dntps Dodecilsulfato sódico (SDS) EcoRI Etanol Formaldehído Formamida Sau3AI Taq-polimerasa Tritiplex III (EDTA) Tris-Trizma Base Sondas FISH: ver tabla. Cebadores 341f-GC, 622fGC, 907r, 1492r, 27f, 948f, 1492r Kit Fast DNA kit for soil BIO101 Kit Microcon-Centrifugal filter devices Kit pgemt-easy vector Ampicilina Células competentes Agar X-gal CBM MERCK BIORAD MERCK GIBCO-BRL SIGMA SIGMA CITIFLUOR Ltd. MERCK PHARMACIA MERCK BIOLABS MERCK MERCK PHARMACIA BIOLABS PROMEGA /BIOTOOLS MERCK SIGMA BIOTOOLS/ TAPER QUIAGEN MILLIPORE PROMEGA BRITEPEN CBM PRONADISA DUCHEFOR 5. Preparación de las muestras. Las muestras serán preparadas según sus características físicas y su procedencia. Puesto que las muestras para hacer FISH deben fijarse en el momento de su recogida, los procedimientos descritos a continuación se realizarán con dos alícuotas independientes: una fijada en formaldehído (para hacer FISH, protocolo 6) y otra sin fijar (para extraer DNA, protocolo 7). Muestra de suelo o lodo de depuradora. Para extracción de DNA: 1. Pesar aproximadamente 0,5 2 g, resuspender en 5 ml de NaCl 0,9% 2. Disgregar por sonicación (potencia media 0.50 w, frecuencia constante, durante 3 minutos). Agitar la muestra en el vortex durante 10 minutos. 3. Dar un pulso de centrífuga para eliminar el material inerte grueso y quedarse con el sobrenadante. 3

5 4. Centrifugar éste a 5000 rpm durante 10 minutos y tomar el pellet (desechar el sobrenadante). 5. Resuspender el pellet en 1000 l de PBS 1X 1. Guardar a 4 C. Para FISH: Las muestras se entregarán fijadas. Lo más habitual es hacerlo con formaldehído (el concentrado está al 37%) a una concentración final del 4% (v/v) en PBS. El tiempo de fijación suele variar entre 2 y 16 horas a 4 C. 1. Centrifugar la suspensión en formaldehído durante 5 minutos a r.p.m. Resuspender el pellet en 1000 l de PBS. 2. Repetir el lavado con PBS. Centrifugar 7 minutos a r.p.m. 3. Resuspender el pellet en PBS o NaCl y continuar con los pasos 2-4 del protocolo anterior. 4. Resuspender el pellet resultante en 1000 l en Etanol: PBS (1:1). Conservar a -20 C. Lodo granular. Para la extracción de DNA. Tomar 2-5 gránulos, resuspenderlos en 1 ml de PBS 1X y disgregar por sonicación (potencia media 0.50 w, frecuencia constante, durante 30 segundos) o con un potter. Guardar a 4 C. Para FISH 1. Decantar el formaldehído y lavar abundantemente con PBS. 2. Repetir el lavado con PBS para eliminar el formaldehído externo a los gránulos. 3. Pesar aproximadamente 0.05 g (5-10 gránulos), resuspender en 1 ml de PBS y disgregar por sonicación (potencia media 0.50 w, frecuencia constante, durante 30 segundos). Puede requerirse repetir el proceso para romper y disgregar bien los gránulos. Alternativamente, los gránulos pueden disgregarse con un potter y un vortex. 4. Centrifugar a baja velocidad (3.000 rpm, 1 minuto) para eliminar los restos de gránulos. 5. Descartar el pellet y centrifugar el sobrenadante durante 5-7 minutos a rpm. 6. Resuspender el pellet en 1 ml de PBS. 7. Centrifugar 5-7 min a rpm. 8. Resuspender el pellet resultante en 1 ml de la mezcla PBS:etanol (1:1). Conservar a -20 ºC hasta su utilización. PBS (buffer fosfato sódico): 130 mm NaCl 10 mm Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 Ajustar el ph a 7.2 Esterilizar en autoclave. 4

6 6. Hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH). El FISH permite identificar in situ la presencia de microorganismos al nivel taxonómico que se requiera. Las sondas son oligonucleótidos de DNA (16-20 nucleótidos) marcadas en su extremo 5 con un cromóforo fluorescente cuya secuencia es complementaria de una región del 16S rrna. Debido a su pequeño tamaño, son capaces de penetrar en las células fijadas, hibridando (apareamiento DNA-RNA) in situ con los ribosomas de las células completas, generando una señal fluorescente que permite su identificación, localización y posterior cuantificación. La especificidad de la sonda utilizada, que es función de la conservación de la secuencia de rrna seleccionada, nos permite detectar/identificar al nivel taxonómico que deseemos: desde dominio hasta especie. El proceso de hibridación in situ se divide en cuatro etapas: i) toma de muestra y fijación en el momento de la recogida para preservar la integridad celular y, especialmente, de sus ribosomas; ii) hibridación con una sonda específica marcada con un fluorocromo; iii) tinción de contraste con un marcador universal (DAPI, que se une al DNA de cualquier célula) u otra sonda más general marcada con otro fluorocromo de distinto color; iv) visualización mediante un microscopio de fluorescencia. La cuantificación puede hacerse mediante contaje directo en el microscopio (epifluorescencia o láser confocal), análisis de imágenes (tratamiento de las imágenes tomadas con cámara CCD o microscopio láser confocal) o citometría de flujo. La relación entre las células hibridadas con la sonda específica de grupo y las teñidas con DAPI o hibridadas con la sonda general nos dará el porcentaje de nuestras bacterias en la muestra con respecto al número total de bacterias presentes o con respecto al grupo general cuya sonda hayamos utilizado (v.g. bacterias o arqueas). Es la única técnica cuantitativa, aunque el proceso puede ser tedioso y subjetivo (microscopio de epifluoroscencia) o muy complejo (microscopio láser confocal). Permite estudiar la estructura de agregados microbianos (biopelículas, flóculos, gránulos), si bien lo ideal para ello sería disponer de un microscopio confocal. Su principal limitación es la disponibilidad de sondas para el taxón o grupo bacteriano que queremos localizar. Si no es así, es preciso diseñar la sonda y poner a punto sus condiciones de hibridación, lo que requiere tiempo y experiencia. 5

7 Tabla 1. Sondas para FISH y sus características Sonda Secuencia (5-3 ) Formamida (%) / Especificidad NaCl (mm) EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT 35 / 80 Bacteria ARC915 GTGCTCCCCCGCCAATTCCT 20 / 225 Archaea ALF968 GGTAAGGTTCTGCGCGTT 20 / 225 Alpha-proteobacteria BET42a GCCTTCCCACTTCGTTT 35 / 80 Beta-proteobacteria HGC69A TATAGTTACCACCGCGT 25 / 159 Gram-positivos con alto G+C (Actinobacteria) MX825 (**) TCGCACCGTGGCCGACACCT 20 / 225 Methanosaeta AGC (*): solo en el lodo granular. 6.1 Fijación. Las muestras se fijan con formaldehído o para-formaldehído a una concentración final del 4%. El tiempo más habitual es de 4 horas a 4 o C, si bien puede variar entre 2-20 dependiendo de la muestra. El procedimiento de fijación y lavado del formaldehído es el descrito en al apartado 5. Las muestras en PBS:etanol pueden conservarse a -20 o C durante meses. 6.2 Hibridación y lavado Paso 1: estimación de la dilución adecuada. Preparar cuatro diluciones (1/5, 1/10, 1/100, 1/1000 en etanol:pbs 1:1) -de la muestra preparada en 5- y añadir 5 l de cada suspensión a un pocillo del portaobjetos multipocillos ( 0,5 cm. FEDELCO. ER-308). Secar durante aprox. 15 minutos en estufa (30-46 o C) y teñir con DAPI (1 mg/ml), durante 3 minutos. El exceso de DAPI se lava primero con H 2 O Milli-Q y luego con Etanol 70%. Dejar secar y añadir una gota de CITIFLUOR en cada pocillo, poner el cubre y contar las bacterias teñidas de azul al microscopio de fluorescencia con el filtro para DAPI. Para realizar la hibridación debemos seleccionar la dilución en la cual contemos aproximadamente bacterias por campo. Paso 2: hibridación. Añadir 5 l de la dilución seleccionada en un pocillo del portaobjetos excavado multipocillos. Secar. Deshidratar la muestra introduciéndola en disoluciones de etanol de concentración creciente (50%, 80%, 100%), 3 minutos en cada concentración. Dejar secar a temperatura ambiente. Añadir 8 l del tampón de hibridación (tablas 2, 3) y 1 l de cada sonda de FISH a utilizar (tabla 1). Poner el porta en una cámara de hibridación y dejar hibridando durante 2 horas (entre 1.5 y varias horas) a 46 o C. Paso 3: lavado. Tras la hibridación debe eliminar el tampón de hibridación (cuidado con los restos. La formamida es tóxica!) mediante un lavado con alta fuerza iónica. Para esto, llenar la cámara de hibridación con 50 ml de tampón de lavado (tablas 2 y 3) y mantenerlo durante 15 minutos ( exactos!) a 48 o C (tener el baño pre-calentado). Pasado este tiempo eliminar el tampón de lavado, quitar los restos con agua y secar (aire, estufa). Teñir con DAPI (1 mg/ml), 6

8 durante 3 minutos y eliminar el exceso de DAPI lavando primero con H 2 O Milli-Q y luego con Etanol 70%. Tabla 2: Composición química del tampón de hibridación y del tampón de lavado. (Los valores de X,Y,Z se indican en la tabla 3). Tampón de Hibridación Concentración Cantidad NaCl 5 M 180 l Tris HCl 1 M ( ph = 8) 20 l Formamida 100 X SDS 10 % 1 l Agua Milli-Q PURA Hasta 1000 l Tampón de lavado Concentración Cantidad NaCl 5 M Y Tris HCl 1 M ( ph = 8) 1000 l EDTA 0.5 M ( ph = 9) Z SDS 10 % 50 l Agua Milli-Q PURA Hasta 50 ml Tabla 3: Valores de X, Y, Z. Estos dependen del porcentaje de formamida utilizada para cada sonda (V hibridación = 1 ml; V lavado = 50 ml). Formamida (%) X( l)= Formamida Y ( l) = NaCl (5M) Z ( l) = EDTA (0.5M) Paso 4: observación y conteo. Las muestras se observan al microscopio con los filtros específicos para cara fluorocromo. Para proteger la fluorescencia añadir una gota de citifluor. 7- Extracción del ADN de los microorganismos presentes en la muestras utilizando el FastDNA Kit for soil BIO Tomar la muestra preparada en el paso 5 y mezclar con 120 μl de MT Buffer. Añadir la mezcla en los tubos (Lysing Matriz E tube). 7

9 2- Romper las bacterias en el equipo Fastprep FP120, con los siguientes parámetros: Cuatro ciclos de ruptura a 5,5 potencia y 40 segundos. Enfriar 5 minutos en hielo entre el segundo y tercer ciclo. 3- Centrifugar el tubo a rpm, durante 1 minuto y transferir el sobrenadante a un eppendorf de 1,5 ml. 4- Añadir al sobrenadante 250 μl de PPS y mezclar invirtiendo 12 veces. 5- Centrifugar a rpm durante 5 minutos. 6- Transferir el sobrenadante a un eppendorf de 5 ml y añadirle 1 ml de Binding Matriz Suspensión. 7- Agitar la mezcla lentamente en un rotor vertical durante 20 minutos a 4 o C. 8- Filtrar en un SPIN filter, añadiendo al filtro volúmenes no superiores a 600 μl de la mezcla, centrifugar a rpm durante 1 minuto y desechar el sobrenadante. Repetir las veces que sean necesarias hasta filtrar toda la mezcla. 9- A la resina retenida en el filtro añadirle 500 μl de SEWS-M y centrifugar a rpm durante 1 minuto. 10- Centrifugar el SPIN filter a rpm durante 3 minutos, para secar la muestra. 11- Descartar el tubo eppendorf, meter el filtro en un nuevo tubo y dejarlo abierto 5 minutos para que se seque. 12- Añadirle 100 μl de DES y resuspender la resina (homogenizar 2 minutos). 13- Centrifugar a rpm durante 3 minutos. El líquido filtrado contiene el ADN. Conservarlo a 4 o C. 8- Amplificación por PCR de un fragmento del gen del ARNr 16S para DGGE. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método rápido y versátil de amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN presentes en una mezcla compleja de secuencias (ADN total). Para poder llevar a cabo una amplificación selectiva es necesario conocer las secuencias flanqueantes a la diana. Con ellas se construyen dos oligonucleótidos, de entre 15 y 30 bases, que actúan como cebadores (primer) en la reacción. Estos cebadores están diseñados para que se pueda iniciar la reacción de síntesis de ADN en presencia de una ADN polimerasa termoestable adecuada (Vg. Taq, TthI,..) y de los precursores del ADN (los cuatros desoxinucleótidos trifosfato: datp, dctp, dgtp y dttp). Cada cebador inicia la síntesis de una hebra de ADN complementaria a una de las hebras del segmento de la diana con lo que las dos hebras de nueva síntesis serán complementarias entre sí. Las hebras de ADN de nueva síntesis servirán de moldes para las reacciones de síntesis en los ciclos posteriores. En estas prácticas la PCR se utilizará para amplificar fragmentos de DNA que serán separados 8

10 mediante DGGE (apartado 9) y para la formación y rastreo de librerías genéticas (apartados 10 y 11). Condiciones de la PCR para posterior DGGE (volumen de 100 μl) Tampón 10X (sin MgCl 2 ) 10 μl. Solución de MgCL 2 (25 mm).. 12 μl 1 dntps (50 mm). 1 μl Cebadores (50 μm) μl (de cada uno: Forward y Reverse). ADN. Depende de las características de la muestra y su Concentración (1-10 μl. Puede ser necesaria su dilución previa) Taq ADN Polimerasa. 0,5 H 2 O MilliQ..Hasta 100 μl 1 : la concentración final de Mg 2+ es de 3 mm. Si el tampón 10X incluye Mg 2+ debe tenerse en cuenta. 2 : 50 pmoles/ μl Para amplificar por PCR fragmentos del gen del ARNr 16S a partir de una muestra compleja, y que posteriormente serán resueltos mediante DGGE se utilizarán los siguientes pares de cebadores (tabla 4): 341F-GC - 907R (T = 52 o C) para bacterias y 622F-GC R (T = 42 o C) para arqueas. Programa: 94 o C 94 o C 10 min. 1 min. T 72 o C 72 o C 2 min. 10 min. 1 min. 4 o C 35 Ciclos Tabla 4. Cebadores utilizados para la amplificación por PCR del gen ARNr 16S de Bacterias y Arqueas. Cebador Diana Secuencia (de 5 a 3 ) Especificidad Referencia 907R CCGTCAATTCMTTTGAGTTT Dominio Bacteria Brosius, F-GC* CCTACGGGAGGCAGCAG Dominio Bacteria Brosius, F-GC* TGAAATCYYRTAATCCC Dominio Arquea Chan, R TACGGYTACCTTGTTACGACTT Universal Lane, 1991 Nota: GC*: secuencia de 40 nucleótidos rica en GC, unida al extremo 5 del cebador. La secuencia GC es: 5 - CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCC CCG CCC-3. (M = C:A, Y = C:T, R = A:G) 9

11 9. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). La DGGE/TGGE se basa en la diferente movilidad electroforética de fragmentos de DNA parcialmente desnaturalizados con igual longitud pero diferente secuencia, lo que da lugar a un patrón de bandas reflejo de la diversidad genética presente en la comunidad microbiana. El número de bandas corresponde con el número de miembros predominantes, y su secuenciación y posterior análisis filogenético dan una buena perspectiva sobre la composición de dicha comunidad. A partir de la muestra que se quiera estudiar se lleva a cabo la extracción de DNA y RNA. Mediante PCR se procede a una amplificación parcial (entre pb) del gen del 16S rrna utilizando cebadores específicos. Las distintas moléculas de DNA correspondientes a diferentes microorganismos o unidades taxonómicas operacionales (OTUs) se separan mediante electroforesis desnaturalizante. Para ello se utilizan geles de poliacrilamida con un gradiente creciente de urea-formamida (DGGE) o de temperatura (TGGE). Cada molécula de DNA se desplaza hacia el polo positivo y deja de moverse cuando la concentración de ureaformamida/temperatura provoca su desnaturalización (separación de las dos moléculas del DNA de doble hebra según su temperatura de fusión -Tm). Cada banda obtenida en el gel corresponde a un microorganismo presente en la muestra original, por lo que el simple patrón de bandas puede ser suficiente para determinados estudios. Las bandas pueden ser recortadas y el DNA secuenciado. Comparando las secuencias resultantes con una base de datos de 16S DNA de bacterias y arqueas, podremos saber con que organismos tienen mayor similitud los microorganismos presentes en nuestra muestra. La DGGE/TGGE y otras técnicas de huella genética son técnicas rápidas y sencillas si se limitan a la obtención de un patrón de bandas, aunque puede aumentarse su complejidad y la información obtenida si se incluye la secuenciación y análisis filogenético de las mismas. Generan una información taxonómica y filogenética relativamente precisa (menos que la clonación, pero más que el FISH) sobre los microorganismos predominantes en el sistema, y es útil para seguir la evolución espacial y temporal de las poblaciones de microorganismos y su respuesta a cambios físico-químicos y nutricionales. G P 9.1- Preparación del gel de DGGE. 1- Para hacer el gel se utilizan 2 cristales: (G)- cristal grande (20cm x 20cm) y (P)- cristal pequeño (20cm x 18cm). Además se utilizan dos separadores (1 mm de espesor). 1 10

12 G P 2 2- Se colocan los separadores encima del cristal grande (G). Se puede poner un poco de vaselina en la superficie de los separadores para que el cierre lateral sea más hermético. 3- Posteriormente se coloca el cristal pequeño encima Se utilizan dos pinzas (A, B) para ajustar los cristales. A B 4 5- Primero se pone una pinza y luego se coloca la otra. 5 11

13 6 6- Ajustar bien las pinzas ( cuidado!: no apretar excesivamente. Tanto las pinzas como los vidrios pueden romperse) y verificar que los cristales están colocados correctamente. Poner el sistema formador de gel sobre una base, que tiene en la parte inferior una lámina de plástico que sella herméticamente todo el sistema. 7- El sistema formador de gel se ajusta a la base mediante dos llaves laterales Formación del gel: Montar un sistema como se indica en la figura 8. Se prepararán dos soluciones de urea-formamida (20% y 70%) a partir de los stock (0% y 80%). H L 8 Composición del Stock 0%: 37,5 ml de Acrilamida/Bisacrilamida 40%. 5 ml de TAE 50X llevar hasta 250 ml con agua MilliQ. 12

14 Composición del Stock 80%: 37,5 ml de Acrilamida/Bisacrilamida 40%. 5 ml de TAE 50X 84 g de Urea 80 ml formamida desionizada. llevar hasta 250 ml con agua MilliQ. Preparación de las soluciones de urea-formamida Solución al 20%: Se mezclan 2,5 ml del stock al 80% y 7,5 ml del stock al 0%. Homogenizar levemente y añadir 6,9 μl de TEMED y 53 μl de APS (1%). Solución al 70%: Se mezclan 8,75 ml del stock al 80% y 1,25 ml del stock al 0%. Homogenizar levemente y añadir 6,9 μl de TEMED y 53 μl de APS (1%). TEMED : N,N,N,N -tetrametilentilendiamina. APS: Peroxidisulfato de amonio. Las soluciones 20% y 70% se añaden en los depósitos del formador de gradientes. La solución del 20% en el compartimiento (L) y la solución del 80 en el compartimiento (H). Cerciorarse que la comunicación entre ambos compartimientos este cerrada. Al compartimiento (H) se le introduce una mosca magnética y todo el sistema se coloca encima de un agitador magnético para garantizar que la mezcla se homogenicé de forma continua. El agitador magnético se pone en marcha en cuanto se añaden las dos soluciones. Posteriormente, de forma simultánea se pone en marcha la bomba peristáltica y se abre la comunicación entre los compartimientos (H) y (L). Observaremos como en el compartimiento (H) se van mezclando poco a poco ambas soluciones y la bomba peristáltica bombea esta mezcla al sistema formador del gel. Cuando prácticamente no queda solución en los compartimientos, se inclina el formador del gradiente para bombear todo. Posteriormente se mezclan 10 ml de la solución stock del 0% con 6,9 μl de Temed y 53 μl de APS (1%) y se homogeniza. De esta mezcla se adiciona 9 ml al sistema formador del gel, por la parte superior con la ayuda de una pipeta pasteur. Luego se introduce suavemente el peine formador de los pocillos y añade más mezcla hasta completar el gel. Dejar polimerizar, a 4 o C, durante un mínimo de 4 horas y un máximo de 24 h. 13

15 Se preparan 7,5 L de TAE 1X a partir del stock de TAE 50X ( mezclar 242 g de Tris base, 57,1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de 0,5 M EDTA, disolver hasta 1 L con agua destilada y esterilizar 20 minutos a 1 atm) 9- Después de gelificado se saca el peine y se lavan los pocillos con el buffer TAE 1X. Se coloca el sistema formador de gel sobre la pieza de sujeción Introducir el conjunto en la carcasa que contiene 7,5 L del buffer TAE 1X Las muestras (producto de PCR) que se van a cargar en el gel se concentran al vacío hasta reducir su volumen a unos 15 μl. Añadir a cada muestra 10 μl tampón de carga y cargarlas en los pocillos con mucho cuidado y evitando que pase muestra de un pocillo a otro. El gel se corre con las siguientes condiciones electroforéticas: Potencial eléctrico: 200 v Tiempo: 4 horas.temperatura: 60 o C 12- Después de correr el gel de DGGE, se apaga la fuente, el sistema de agitación y calentamiento y se saca el conjunto de la carcasa

16 13- El sistema formado de gel se separa de la pieza de sujeción Se quitan las 2 pinzas con mucho cuidado y con la ayuda de los separadores se quita solo el cristal pequeño. Quedando el gel pegado al cristal grande. Luego el gel (junto con el cristal grande) se tiñe durante 20 minutos en una solución de Bromuro de Etidio (alternativa: GelRed) y, posteriormente, se lava con agua durante 10 minutos Foto de un gel de DGGE (gradiente 20-70), después de teñido. Cada carril corresponde a una muestra y, en teoría, cada banda a un microorganismo con diferente secuencia. Estas bandas se cortan, se reamplifican con los mismos primer, se purifican y se secuencian. 15

17 10. Amplificación del gen del ARNr 16S para la construcción de genotecas. A partir de los ADNs extraídos en el punto 7, vamos a volver a amplificar el ADN correspondiente al gen que codifica el ARN 16S. El producto de la PCR se utilizará para la construcción de genotecas en plásmidos. La amplificación se realizará utilizando los siguientes cebadores: Cebador Secuencia Especificidad 27f AGAGTTTGATCMTGGCTCAG Bacteria 25f CYGGTTGATCCTGCCRG Archaea 1492r TACGGYTACCTTGTTACGACTT Universal Y: C/T; R: A/G Las condiciones de la reacción de PCR son las siguientes: 2,5 L de tampón de reacción (10x), 5pmol de cada cebador, 3,75mM MgCl 2, 0,2mM dntps, 5 g de Albúmina de suero bovino (BSA) y 0.5-1u de ADN polimerasa, en un volumen final de 25 L. El programa de PCR consiste en 5min de desnaturalización a 94 C seguido por 25 ciclos de 1min a 94 C (desnaturalización), 1 min a 55ºC (anillamiento), 2 min a 72 C (elongación) y un ciclo final de 10 min a 72 C. Los productos de PCR se clonarán en el plásmido pgemt easy vector de Promega (Madison, E.E.U.U.). Para ello, se realizará la siguiente reacción de ligación: 2X Rapid ligation buffer 5 l P-Gem vector 1 l Producto de PCR 3 l T4 DNA Ligasa 1 l Los tubos se incubarán como mínimo 1 hora a temperatura ambiente (alternativa: 4 C toda la noche, lo que aumenta la eficiencia). Los productos de las ligaciones se transformarán en células competentes de E. coli DH5, según el siguiente protocolo: 1. Dejar un tubo de células competentes (si fuera necesario hacer alícuotas de 50 l) en hielo hasta que se descongele (unos 5 min). Mezclar suavemente. 2. Centrifugar las ligaciones con un breve pulso. Añadir 2 l de cada reacción de ligación a un tubo esteril de 1,5 ml. Colocar en hielo 3. Incubar 30 min en hielo 16

18 4. Incubar la mezcla durante 1 30 a 42 o C (shock térmico). No agitar. Inmediatamente poner los tubos en hielo otros 2 min. 5. Añadir 500 l de medio SOC o LB a temperatura ambiente a las reacciones de transformación. 6. Incubar 1 / 1.5 h a 37 o C, con agitación. 7. Plaquear 100 l de la transformación en una placa de LB/ampicilina/X-Gal 8. Centrifugar el resto de la transformación, eliminar la mayoría del líquido y plaquear otra placa de LB/Ampicilina/X-Gal (Amp: 100 ng/ l ; X-Gal: 100 ng/ l) 9. Incubar las placas a 37 o C durante la noche. 17