Manual de Laboratorio

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1 Universidad Central de Venezuela Facultad de Ciencias Escuela de Biología Departamento de Biología Celular Unidad Docente de Genética Electiva 1451 Fundamentos de Genética Molecular Manual de Laboratorio Autores: Dra. Palmira Guevara Lic. Riward Campelo Morillo Lic. Richard Clark Lic. Verónica Guariglia Lic. Félix Moronta Lic. Kamran Rizzolo

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3 INDICE 1er BLOQUE Técnicas básicas en Genética Molecular 5 INTRODUCCION 5 Práctica 1 Transformación bacteriana 8 Anexo 1 Genes reporteros in vivo: La proteína de fluorescencia verde y vectores de clonamiento 15 Práctica 2 Aislamiento de ADN plasmídico Minipreparación de ADN plasmídico 16 Práctica 3 Análisis del ADN en geles horizontales de agarosa 20 Práctica 4 Cuantificación de ADN por espectrofotometría 26 Práctica 5 Caracterización de plásmidos recombinantes por análisis de restricción 29 Anexo 2 Patrones de restricción esperados para pegfp y peyfp 32 2do BLOQUE Aplicación de técnicas de la genética molecular al diagnóstico de enfermedades hereditarias humanas 33 INTRODUCCION 33 Práctica 6 Análisis de perfiles genéticos humanos Parte I mediante PCR-RFLP: detección de una mutación puntal o single nucleotide polymorphism (SNP) en el gen de la -globina 34 Preparación y tratamiento de muestras 1.1 Aislamiento de ADN a partir de epitelio bucal Anexo 3 Consentimiento informado 42 Parte II Ensayos de amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 44 Parte III Digestión del amplicón con la enzima Bsu36 I y análisis del patrón de restricción. 51 Anexo 4 Resultados esperados del diagnóstico por PCR-RFLP en el gen de la -globina humana 54 Anexo 5 Lectura: Genética y Sociedad 55 BIBLIOGRAFIA

4 <!> GLOSARIO DE BIOSEGURIDAD DE MATERIALES PELIGROSOS<!> Ácido acético (concentrado) manipular con gran cuidado. Puede causar daño por inhalación, ingestión, o absorción cutánea. Utilizar guantes y lentes apropiados. Utilizar dentro de una campana. Ampicilina puede causar daño por inhalación, ingestión, o absorción cutánea. Utilizar guantes y lentes. Manipular en campana. Bromuro de Etidio mutagénico poderoso y tóxico. Evitar inhalación del polvo. Utilizar guantes al trabajar con soluciones de BrEt. Consultar para su descarte. Cloroformo irritante a la piel, ojos, membranas mucosas, y tracto respiratorio. Es un carcinógeno voátil y puede causar daño al hígado y riñones. Evitar inhalación de vapores. Utilizar guantes y lentes. Manipular en campana. Dodecil sulfato de sodio (SDS) es tóxico, irritante, y posee un alto riesgo de daño a los ojos. Puede causar daño al ser inhalado, ingerido, o absorbido por la piel. Utilizar guantes y lentes. Manipular en campana. No inhalar el polvo. Etanol puede causar daño si es inhalado, ingerido, o absorbido por la piel. Utilizar guantes y lentes apropiados. Hidróxido de sodio y las soluciones que contengan hidróxido de sodio son altamente tóxicas y cáusticas, deben ser manipuladas con mucho cuidado. Utilizar guantes apropiados y mascarilla. Todas las bases concentradas deben ser manipuladas de igual manera. Isopropanol es irritante puede causar daño al ser inhalado, inherido, o absorbido por la piel. Utilizar guates apropiados y lentes de seguridad. El vapor no debe ser respirado. Mantener alejado del calor, chispas, y la llama. Luz UV y/o radiación UV es peligrosa y puede causar daños a la retina de los ojos. Jamás se debe ver directamente la luz UV desprotegida. La luz UV es también mutagénica y carcinogénica. Para minimizar el riesgo de exposición, la fuente de luz UV debe ser resguardada adecuadamente. Utilizar guantes protectores adecuados al sostener materiales bajo una fuente de luz UV. 3

5 Fenol es extremadamente tóxico, altamente corrosivo, y puede causar quemaduras graves. Puede causar daño por inhalación, ingestión, o absorción cutánea. Utilizar guantes, lentes, y bata. Utilizar dentro de una campana. Enjuagar con mucha agua y lavar con agua y jabón cualquier área de la piel que tenga contacto con el phenol.!no utilizar etanol! Tris puede causar daño si es inhalado, ingerido, o absorbido por la piel. Utilizar guantes y lentes apropiados. 4

6 1ER BLOQUE Técnicas básicas en Genética Molecular INTRODUCCIÓN La contribución de la genética y en particular de la genética molecular, disciplina que nace con la publicación del modelo de la doble hélice para la molécula de ADN propuesto por Watson y Crick en 1953, ha transformado la visión y la dimensión de las ciencias biológicas. Esta transformación, que conlleva el entender el funcionamiento integrado de la célula desde la molécula responsable de la herencia y los procesos que resultan de su mantenimiento y la expresión de esta información en el fenotipo, han tenido un impacto en todas las áreas relacionadas a la biología. Este alcance tiene dimensiones cotidianas si consideramos que la transferencia horizontal de conocimientos y tecnologías están presentes en la agroindustria y en los nuevos medicamentos a nivel mundial. Gran parte de esta rápida transferencia tecnológica es producto de un conjunto de metodologías de rutina del trabajo en el laboratorio conocidas como ingeniería genética. Es posible aislar e identificar secuencias específicas de genes o fragmentos del genoma de una especie, insertarlos en vehículos o vectores de clonamiento y transferirlos y expresarlos en otra especie, fundamentalmente con objetivos asociados a la investigación básica. Sin embargo la inmediata aplicabilidad derivada de la relativa accesibilidad de las metodologías, incentivadas por su gran potencial de desarrollo biotecnológico, ha empujado los límites de la biología molecular y sus aplicaciones fuera del ámbito netamente académico, teniendo hoy día una marcada presencia en la medicina, el desarrollo agropecuario, el estudio de poblaciones, e inclusive la identificación de individuos a través del perfil de su genoma y el desarrollo de armas biológicas. Las herramientas de la biología molecular y el 5

7 conocimiento generado permiten derivar aplicaciones útiles y con valor comercial que alcanzan a todos los sistemas biológicos. El conocimiento bioquímico de los procesos asociados al funcionamiento y mantenimiento del ADN, fundamentalmente la replicación, la transcripción, la recombinación, la reparación, su empaquetamiento en los cromosomas y la segregación durante la división celular, han sido la base de las metodologías utilizadas en la manipulación de los genomas desde las primeras experiencias de clonamiento de genes en los años 70, la secuenciación de genomas completos durante los 90 y continúan siendo punto de partida para el diseño de nuevas técnicas de análisis en investigación en el siglo XXI. El dominio tecnológico hoy permite la masificación del análisis con el surgimiento de nuevas disciplinas como la genómica y la proteómica que investigan en masa los eventos celulares a nivel molecular. Con el objetivo de iniciar al estudiante de biología en el proceso de construcción y adquisición del conocimiento en la disciplina de la genética molecular hemos diseñado un manual de prácticas que complementan los conceptos discutidos en la teoría. En esta primera parte, se describen las herramientas básicas utilizadas para el análisis genético molecular en el quehacer diario de un laboratorio de investigación. Estas herramientas aprovechan enzimas y reacciones químicas que ocurren naturalmente en las células desde las formas de vida más simples, tales como las células bacterianas y los virus, hasta células eucariotas. El conjunto de estas herramientas y reacciones dirigidas a la manipulación del material genético se conocen como tecnología del ADN recombinante. Las enzimas más importantes en este conjunto de herramientas son aquellas que actúan sobre la misma molécula de ADN: las enzimas de restricción que cortan el ADN en sitios específicos, las ligasas que permiten unir dos moléculas de ADN o ARN, las polimerasas que sintetizan nuevas 6

8 hebras de ADN, y las transcriptasas reversas que sintetizan ADN complementario a partir de ARN. La reacción bioquímica no-catalizada más importante para los análisis en la genética molecular es la hibridación mediante la cual ocurre el enlace de dos hebras de ADN con secuencias nucleotídicas complementarias. La hibridación resulta de la tendencia natural de moléculas de ADN o ARN cadena-sencilla complementarias para formar una doble-cadena estable. El primer bloque comprende los ejercicios de transformación bacteriana, aislamiento de ADN plasmídico, minipreparación de ADN plasmídico, análisis del ADN en geles horizontales de agarosa, registro y análisis de resultados, cuantificación de ADN por espectrofotometría y la caracterización de recombinantes por análisis de restricción. Todas estas experiencias ponen en práctica los fundamentos y conceptos básicos presentados en la teoría e ilustrados en las referencias escogidas para su discusión. El trabajo está dirigido para que al finalizar el curso el estudiante domine los conocimientos fundamentales de la metodología del ADN recombinante y su aporte a los progresos en la biología molecular. Igualmente, deberá estar en capacidad de interpretar una publicación sobre esta materia, tanto en la escogencia de una metodología adecuada para alcanzar un objetivo, como en la correcta interpretación de los resultados. 7

9 PRÁCTICA 1 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA Objetivos Familiarizar al estudiante con el fenómeno de transformación bacteriana y la transferencia horizontal de genes. Conocer los métodos de transformación bacteriana en el laboratorio. Hacer competente una cepa de E. coli con tratamiento químico y transformarla con un plásmido. Analizar transformantes a través de medios selectivos. Reconocer los usos prácticos de los genes reporteros y marcadores selectivos. Introducción La transformación es un proceso por el cual las células procariotas captan ADN libre presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero con variaciones en su eficacia entre especies. Para que ocurra la transformación, la bacteria tiene que encontrarse en un estado de competencia, en el cual la célula presenta modificaciones en su pared y membrana, que permiten la entrada del material genético desde el exterior celular. En el laboratorio se han normalizado técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de Escherichia coli. Estas técnicas se basan en diversos tratamientos químicos o físicos que producen poros en la pared celular. El tratamiento químicos con cloruro de calcio (CaCl 2 ) y la electroporación, que consiste en inducir la competencia mediante la aplicación de un pulso eléctrico muy breve e intenso, son dos métodos utilizados con frecuencia en el laboratorio de investigación. 8

10 Sin embargo tras estos tratamientos no todas las células del cultivo se hacen competentes y se afecta la viabilidad de la célula. La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir plásmidos recombinantes en casi cualquier tipo de bacteria. El método que se describe a continuación es, por su simplicidad, uno de los más utilizados para transformar E. coli. Para seleccionar las células transformantes, el ADN introducido llevará un marcador selectivo de resistencia a antibióticos que proporciona una ventaja selectiva bajo las condiciones de crecimiento, con respecto a las células no transformadas y un gen reportero, que confiere un fenotipo de emisión de fluorescencia fácilmente detectable. Ambos marcadores genéticos permitirán identificar las células transformantes. 9

11 Materiales, reactivos y equipos Cultivo de Escherichia coli DH10B. Genotipo: F - mcra (mrr-hsdrms-mrcbc) 80dlacZM15 lacx74 deor reca1 enda1 arad139 (ara, leu) 7697 galu galk - rpsl nupg ADN del plásmido pegfp o peyfp 2 ml de medio LB líquido 10 ml de medio LB líquido+ estreptomicina 40 g.ml -1 3 Placas de agar LB +estreptomicina 40 g.ml -1 2 Placas de agar LB +ampicilina 100 g.ml -1 +estreptomicina 40 g.ml ml 0,85% Solución Salina 15 ml CaCl 2 50 mm Rastrillo de vidrio Cava y hielo para incubaciones a 4 C Microcentrífuga. 3 Tubos de microcentrífuga estériles 1,5 ml 4 Tubos estériles 15 ml 6 Tubos de dilución estériles Baños de incubación. Micropipetas Puntas para micropipetas L y 1 ml Pipetas estéritles de 10 ml, 5 ml y 1 ml 10

12 Protocolo Nota: Durante todo el proceso trabaje en condiciones de esterilidad. Preparación de células competentes 1. Previo al día de la práctica, partiendo de una colonia aislada, inocular las bacterias en 2 ml de medio LB+ estreptomicina (40 g.ml -1 ) en un tubo estéril. 2. Incubar a 37ºC con agitación toda la noche. 3. Agregar 8 ml de medio LB+estreptomicina (40 g.ml -1 ) al cultivo en fase estacionaria de la noche anterior. 4. Incubar a 37ºC con agitación por 1 hora. 5. Transferir el cultivo a un tubo estéril de 15 ml. 6. A partir de este paso trabajar a 4 C. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m. 7. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 2 ml de solución salina (0,85% SS) agitando el tubo. Luego completar el volumen a 10 ml. 8. Centrifugar estérilmente a 4º C a 5000 r.p.m por 10 minutos. 9. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de CaCl 2 50 mm recientemente preparado y frío. 10. Incubar 1 hora en hielo. 11. Centrifugar estérilmente y a 4º C a 5000 r.p.m por 10 minutos. 12. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de bacterias en 1 ml de CaCl 2 50 mm y guardar a 4ºC. 11

13 Transformación 1. Pre-incubar dos tubos de 1,5 ml estériles en hielo. Marcarlos como A y B. Colocar en cada uno 200 L de las células competentes del paso 11 del protocolo de preparación de las células competentes. 2. Al tubo A, añadirle aproximadamente 0.1 µg del ADN plasmídico en un volumen no mayor a 10 µl. Al tubo B no colocarle el plásmido. 3. Incubar 1 hora en hielo cada tubo. 4. Someter las células a un choque térmico a 45ºC por 90 segundos exactos. 5. Agregar 1 ml de medio LB e incubar a 37ºC por 60 min. 6. Sembrar por rastrilleo 100 L de cada tubo en una placa de LB+ampicilina (100 g.ml -1 )+ estreptomicina (40 g.ml -1 ). 7. Para el cálculo de la eficiencia de transformación y control de viabilidad realizar una titulación del cultivo transformado (tubo A) hasta un factor de dilución de 10-7 y Sembrar por rastrilleo 100 μl de las diluciones 10-7 y 10-8 en placas de agar LB. 8. Incubar las placas a 37ºC por 24 horas. 9. A las 24 horas registre el número de colonias en cada tipo de placa y calcule el título de células receptoras y de células transformantes. 10. Evalué la expresión de los genes reporteros GFP o YFG según sea el caso, en las colonias transformadas exponiendo la placa a la luz UV. Nota: utilice lentes para protegerse la vista. 11. Sembrar por agotamiento al menos cuatro colonias transformantes en placas de LB+ampicilina (100 g.ml -1 )+ estreptomicina (40 g.ml -1 ) que utilizará en la práctica 2 para el aislamiento del ADN plasmídico. 12

14 Preguntas de la práctica 1. Calcular la eficiencia de transformación en base a la concentración de ADN plasmídico y en base al título de las células receptoras con las fórmula: nº de colonias transformantes / g ADN añadidos)x10 nº de colonias transformantes / título de células receptoras) 2. Describa qué se observa en la placa de LB+ampicilina sembrada con 100 l del tubo B. Sabrías explicar por qué? Para qué se realiza este control? 3. Discuta el genotipo de la cepa utilizada E. coli DH10B. Por qué se utiliza estreptomicina en el medio? 4. Desde el punto de vista genético Qué características especiales deben tener las cepas bacterianas a ser usadas en experimentos de transformación? 5. Discuta las características de los vectores pegfp y peyfp y su relevancia para el clonamiento de genes. Qué importancia tienen los sitios múltiples de clonamiento ubicados en las regiones 5 y 3 de los genes GFP y YFP? Por qué es posible observar el fenotipo de fluorescencia en las células E. coli DH10B transformadas con los plásmidos pegfp y peyfp? 6. Describa otros tipos de tipos de vectores de y estrategias de clonamiento. 7. Explique qué otros métodos son utilizados para hacer competente a una cepa bacteriana. 8. Desde el punto de vista evolutivo Cuál es la importancia de los fenómenos de transformación bacteriana en la naturaleza? 13

15 Figura 1. Mapa de los plásmidos pegfp y peyfp. Se muestran: el tamaño del plásmido en kb, los sitios únicos de restricción, los sitios múltiples de clonamiento (MCS), los genes de resistencia a ampicilina (Amp r ), los genes reporteros EGFP/EYFP, el promotor del operon Lactosa (P Lac ) y el origen de replicación de puc (pucori). Los números en paréntesis indican la ubicación en pb desde el sitio 1. ( y 14

16 ANEXO 1. Genes reporteros in vivo: La proteína de fluorescencia verde y vectores de clonamiento La Proteína de Fluorescencia Verde (GFP por sus siglas en inglés Green Fluorescent Protein), aislada originalmente de la medusa Aequorea victoria, se utiliza como una molécula reportera para analizar el funcionamiento in vivo de regiones reguladoras, así como para determinar la localización subcelular de proteínas. La GFP emite una fluorescencia de color verde brillante al ser expuesta a luz UV, lo que la hace fácilmente detectable. La Proteína de Fluorescencia Amarilla (YFP por sus siglas en inglés Yellow Fluorescent Protein) se deriva de una mutación puntual en el gen de la GFP por lo que absorbe a una longitud de onda diferente y emite una fluorescencia más tenue. Ambas proteínas son fácilmente detectables y de amplio uso en el análisis funcional de genes. Los vectores de clonamiento pegfp y peyfp tienen su origen en el plásmido puc19 al cual se le ha insertado un fragmento de ADN conteniendo a los genes GFP y YFP respectivamente (Figura1). La estructura base del puc19 proporciona el gen de resistencia al antibiótico ampicilina y un origen de replicación relajado que permite su propagación en E. coli y genera múltiples copias del plásmido en la célula. Los genes GFP y YFP están insertados en fase al codón de iniciación del gen lacz por lo que la proteína de fusión del marcador fluorescente se expresa a partir del promotor de lac. De esta forma, el fenotipo de resistencia al antibiótico ampicilina y la presencia de fluorescencia servirán como indicativo de la presencia del plásmido en una célula bacteriana hospedera. En este caso, nos servirá para determinar si el ensayo de transformación tuvo éxito. Sin embargo las aplicaciones y usos de este tipo de plásmidos son muy amplias. Podrías sugerir en qué tipo de experimentos serían útiles los plásmidos pegfp y peyfp? 15

17 PRÁCTICA 2 AISLAMIENTO DE ADN PLASMÍDICO Minipreparación de ADN plasmídico Objetivo Manejar fundamentos teóricos y prácticos del aislamiento de ADN plasmídico y genómico en bacterias. Estudiar el efecto de detergentes aniónicos, como el Dodecil Sulfato de Sodio (SDS por sus siglas en inglés Sodium Dodecyl Sulfate), sobre la célula bacteriana. Extraer y aislar de la célula bacteriana E. coli DH10B el plásmido transformado en la práctica 1. Introducción La lisis alcalina, en combinación con el detergente Dodecil Sulfato de Sodio, SDS, ha sido usada por más de 20 años para aislar ADN plasmídico de E. coli. La exposición de suspensiones bacterianas a detergentes aniónicos fuertes en valores de ph altos desestabiliza la envoltura celular, desnaturaliza el ADN cromosomal y las proteínas, y libera el ADN plasmídico al sobrenadante. Aunque la solución alcalina separa completamente las bases apareadas del ADN, las hebras de un plásmido circular no se separan completamente unas de otras debido a que están topológicamente entrelazadas. Mientras la intensidad y la duración de la exposición al OH - no sea demasiado larga, ambas hebras del ADN plasmídico se renaturalizarán cuando los niveles de ph retornen a sus valores neutros reconstituyendo una molécula de ADN doble cadena circular. Durante la lisis, las proteínas bacterianas, la pared celular rota y el ADN cromosomal desnaturalizado constituyen grandes complejos que se agregan y son cubiertos con SDS. Estos complejos 16

18 son precipitados eficientemente de la solución acuosa cuando los iones sodio son reemplazados por potasio. Después que este material ha sido removido por centrifugación, el ADN plasmídico puede ser recuperado del sobrenadante. La lisis alcalina en presencia de SDS es una técnica flexible que trabaja muy bien con todas las cepas de E. coli y con cultivos bacterianos en fase logarítmica en un rango de 1 ml a >500 ml. El ADN plasmídico circular cerrado recuperado del lisado puede ser purificado de distintas maneras y en diferentes grados, dependiendo de las necesidades del experimento. Materiales y reactivos Medio LB líquido+estreptomicina 40 g.ml -1 +ampicilina 100 g.ml -1 Solución Salina (NaCl 0,85 %) Solución I (glucosa 50 mm, EDTA 10 mm, Tris ph mm) Solución II (NaOH 0.2 M, SDS 1%) Solución III (Acet. de potasio 3 M, ácido acético glacial 5 M, ph 4.5) Solución cloroformo:fenol (1:1) Isopropanol grado Biología Molecular Etanol 70% v/v Tampón TE (Tris-HCl ph mm, EDTA 1 mm) Microcentrífuga 3 tubos plásticos de microcentrífuga estériles de 1.5 ml Micropipetas Puntas para micropipetas L Hielo/cava 17

19 Protocolo 1. Previo al día de la práctica, partiendo de una colonia aislada, crecer toda la noche un cultivo de 4 ml de medio LB+ampicilina (100 µg.ml -1 ) + estreptomicina (100 µg.ml -1 ) de la cepa bacteriana transformada con el plásmido pegfp o peyfp obtenida en la práctica Transferir el cultivo a un tubo estéril de 15 ml. 3. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m. 4. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 2 ml de solución salina (0,85% SS) agitando el tubo. Luego completar el volumen a 10 ml. 5. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m. 6. Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 100 µl de solución I con agitación. 7. Transferir este sobrenadante a un tubo de 1,5 ml. 8. Añadir 200 µl de solución II. Tapar el tubo y mezclar las dos soluciones invirtiendo dos o tres veces el tubo muy suavemente. Incubar en hielo por 5 min. 9. Añadir 150 µl de solución III fría. Mezclar por inversión del tubo e incubar en hielo de 5 a 8 min. 10. Centrifugar a r.p.m. por 15 min. 11. Tomar el sobrenadante CON MUCHO CUIDADO, evitando tomar del sedimento, pues éste es la principal fuente de contaminación por ADN cromosomal. De ser necesario, centrifugue este sobrenadante una vez más para asegurarse que no contiene ninguna contaminación. 12. Calcular el volumen de sobrenadante y extraer con un volumen igual de mezcla cloroformo-fenol (1:1). Mezclar bien. Nota: el fenol es muy corrosivo, evite su contacto con la piel. 18

20 13. Centrifugar esta mezcla por 3 min. a r.p.m. Deben separarse dos fases. 14. Tomar la fase acuosa superior, con cuidado de no tocar la interfase ni la fase fenólica, y transferirla a un nuevo tubo de 1,5 ml. 15. Agregarle un volumen de isopropanol igual al volumen del sobrenadante. Mezclar por inversión e incubar por 10 min. en hielo. 16. Centrifugar a r.p.m. por 15 min. 17. Eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento con etanol 70% y centrifugar por 5 min. a r.p.m. 18. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y dejar el tubo en posición invertida sobre un toallín a fin de que drene todo el etanol. Dejar secar completamente a temperatura ambiente. 19. Resuspender el sedimento con los ácidos nucleicos en un volumen no mayor a 50 µl de tampón TE y guardar en la nevera. Esta muestra que contiene al ADN del plásmido será examinada en un gel de agarosa en la próxima práctica. Preguntas de la práctica 1. Explique cómo y por qué se logra separar el ADN plasmídico del ADN cromosómico durante la lisis alcalina. 2. Explique qué se logra al añadir consecutivamente las soluciones I, II y III? 3. En qué paso del protocolo se elimina al ARN? Con qué tratamiento adicional podría eliminar al ARN? 4. Cómo se desnaturalizan las proteínas? 5. Cómo se eliminan los lípidos de la preparación? 6. Por qué se realiza un lavado con etanol 70%? 19

21 PRÁCTICA 3 ANÁLISIS DEL ADN EN GELES HORIZONTALES DE AGAROSA Objetivo Manejar los fundamentos teóricos de la electroforesis en geles de agarosa. Conocer y evaluar las ventajas de la técnica de electroforesis en geles horizontales de agarosa para el análisis y caracterización de ácidos nucleicos. Separar ácidos nucleicos según su tamaño y configuración. Comprobar si la minipreparación de plásmidos realizada en la práctica 2 fue exitosa. Reconocer las diferentes conformaciones del ADN circular. Introducción La electroforesis en geles de agarosa es una de las técnicas analíticas utilizadas en la caracterización de ácidos nucleicos en base a la forma y tamaño de las moléculas. La carga neta negativa, producto de los grupos fosfatos en el ADN y el ARN, resulta en una migración de las moléculas hacia el ánodo cuando se aplica un campo eléctrico; sin embargo la matriz, formada por la agarosa (un polisacárido ramificado de unidades de D-galactosa y 3,6-anhidrogalactosa altamente hidrofóbico) en la sales del tampón, ofrece una resistencia al movimiento (Figura 2). Las moléculas lineales de mayor tamaño tendrán dificultad para pasar por los poros de la matriz, quedándose en la región superior del gel, mientras que los fragmentos de menor tamaño se movilizarán con facilidad, alcanzando la parte inferior del gel. 20

22 BOLSILLOS Figura 2. Esquema representativo de una corrida electroforética Dependiendo de la concentración de agarosa en el gel, la matriz formada permitirá la separación efectiva de diferentes tamaños de ADN durante la electroforesis (Tabla 1), en consecuencia, la masa molecular relativa puede ser calculada utilizando un marcador de ADN de peso molecular conocido, como referencia. Sin embargo existen otros factores que influyen en el grado de resolución de los geles de agarosa. La conformación de las moléculas afecta la migración. El ADN plásmidos migra en orden de velocidad desde el más rápido al más lento, de acuerdo a si está en forma superenrollada, lineal o circular abierta. Tabla 1. Rango de separación de moléculas lineales de ADN doble cadena por electroforesis en geles horizontales de acuerdo al porcentaje de agarosa. % de Agarosa en ADN (kb) el gel 0,6 20-1,0 0,7 10-0,8 0,8 7-0,5 1,3 4-0,2 El voltaje es otro factor que influye en la velocidad de migración del ADN, a mayor voltaje una migración más rápida; sin 21

23 embargo el calor generado produce que el gel se derrita además de desmejorar la resolución de la separación de las moléculas. Generalmente los geles de agarosa en corrida horizontal son utilizados para separar fragmentos entre 100 pb hasta 20 kb. Para la separación de moléculas de menor tamaño se utilizan geles de poliacrilamida y para moléculas mayores a 0,1 Mb hasta 2 Mb se han diseñado los sistemas de electroforesis de campo pulsado (Pulse Field Gel Electrophoresis o PFE) y electroforesis de campos invertidos (Field Inverted Gel Electrophoresis, FIGE), ambos realizados en geles de agarosa de alta concentración (agarosa 1,5% a 2 %). Previa a la colocación de la muestra en los bolsillos del gel, se mezcla con el tampón de carga, compuesto por un reactivo que incremente la densidad, como el glicerol o la sacarosa, y uno o dos colorantes que permitan hacer el seguimiento de la corrida en tiempo real. Generalmente se utiliza el azul de bromofenol y el cileno cianol, los cuales están cargados negativamente y migran a un peso molecular equivalente a 5 kb y 300 pb de ADN doble cadena respectivamente. El método más conveniente y comúnmente usado para la visualización del ADN separado en estos geles de agarosa es la tinción con el colorante fluorescente bromuro de etidio (BrEt), el cual contiene grupos planares tricíclicos que se intercalan entre las bases del ADN, sin especificidad de secuencia. Bajo estas condiciones, el colorante aumenta su fluorescencia, de modo que emite luz visible (color naranja) cuando es excitado por radiación ultravioleta. Para el registro del resultado de la electroforesis que se visualiza mediante la exposición a la luz UV del gel teñido con BrE, desde hace algunos años se utiliza un aparato de fotodocumentación que digitaliza la imagen, el cual hace uso de programas especialmente diseñados para este fin. 22

24 Materiales y reactivos. Agarosa 0,8% en tampón TAE 1X Tampón TAE 1X (Tris-acetato 40 mm, EDTA 1 mm). Tampón de carga III 6X. (azul de bromofenol 0,25% p/v; cileno cianol 0,25% p/v; Glicerol 30% v/v) Bromuro de etidio 0.5 g.ml -1 Agua destilada Cámara de electroforesis horizontal/fuente de poder Peines, moldes y bandeja para la preparación de geles Balanza Horno microondas Fiola de 125 ml Bandeja para tinción Cilindros graduados de 100 y 500 ml Papel Parafilm Micropipetas Puntas para micropipetas µl Agujas de inyectadotas Transiluminador UV/sistema de fotodocumentación Guantes desechables 23

25 Protocolo 1. Preparar 100 ml de la solución de agarosa 0,8% en tampón TAE 1X. Para ello, pesar 0,8 g de agarosa requeridos en una fiola y agregar 100 ml del tampón TAE 1X. 2. Disolver la agarosa calentando hasta hervir en el microondas por 2-5 minutos evitando la evaporación. Dejar enfriar. Cuando la temperatura se acerque a los 50ºC (temperatura tal que se pueda visualizar a la solución aún como líquido), verter la agarosa en el molde con los peines. Evite la formación de burbujas, en caso de que se formen, removerlas con una aguja. Dejar solidificar el gel a temperatura ambiente. 3. Una vez solidificada la agarosa, remover los peines y colocar el gel en la cámara de corrida con tampón TAE 1X. 4. En un trozo de papel Parafilm fijado al mesón, mezclar 5 µl de la solución de ADN con 2 µl del tampón de carga 6X y colocar cada muestra en el bolsillo correspondiente. Recuerde colocar un marcador de peso molecular mezclado con tamón de carga y tomar nota de la ubicación de sus muestras. 5. Aplicar un voltaje no superior a 5 V.cm -1 y dejar correr hasta que el primer colorante alcance ¾ partes del gel. 6. Al finalizar la corrida, y utilizando guantes, teñir el gel en una solución de Bromuro de etidio a 0,5 g.ml -1 durante 1 minutos. Transferir el gel a una bandeja con agua destilada. Registre la imagen mediante la exposición sobre un transiluminador de luz UV (312 nm) y utilizando el aparato de fotodocumentación. 7. NOTA: El BrEt es un poderoso agente mutágeno. Use siempre guantes. No permita su contacto con la piel. No exponga ninguna parte de su cuerpo a la luz UV. 24

26 Preguntas de la práctica 1. Explique por qué la matriz del gel de agarosa ofrece resistencia al paso de las moléculas de ADN? 2. Por qué un fragmento de ADN de 10 kb no migra más rápido que un fragmento de 0,5 kb, cuando se someten a un campo eléctrico en la electroforesis en geles de agarosa, si el primero posee mayor número de grupos fosfato y por tanto más cargas negativas? 3. Cuáles son las funciones de los tampones de electroforesis como el TAE 1X? Qué otros tampones de electroforesis son frecuentemente usados en laboratorio? 4. Con qué propósito se mezcla la solución de ADN con el tampón de carga? Cuáles son las funciones de cada uno de de los componentes, el glicerol, el azul de bromofenol y el cileno cianol? 5. Qué otros métodos existen para la visualización del ADN en geles de agarosa? 6. La electroforesis en geles de agarosa a diferentes concentraciones resuelve fragmentos desde 100 pb hasta 20 kb. Con qué otra metodología se logra resolver fragmentos menores a 100 pb? Explique. 7. En la práctica se utilizó un marcador de ADN de moléculas lineales. Sirve este marcador para calcular el peso molecular de moléculas circulares? Explique. 25

27 PRÁCTICA 4 CUANTIFICACIÓN DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRÍA Objetivos Conocer y manejar el fundamento de la técnica de espectrofotometría para la cuantificación de la concentración de una muestra de ADN. Estimar la concentración de ADN plasmídico aislado de las células transformantes de E. coli DH10B en la práctica 2. Introducción Existen diversos métodos para estimar la concentración de ácidos nucleicos en una preparación. Si la muestra es pura (no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol, agarosa o incluso otros ácidos nucleicos), su medición mediante espectrofotometría de la luz UV absorbida por las bases nitrogenadas es la más adecuada. Por el contrario, si la cantidad de ADN o ARN es muy pequeña, o si la muestra contiene grandes cantidades de impurezas, la estimación de los ácidos nucleicos se puede llevar a cabo por la intensidad de fluorescencia emitida por compuestos como el bromuro de etidio. En esta práctica se cuantificará la cantidad de ADN mediante espectrofotometría, donde se tomarán lecturas de la Densidad Óptica (D.O.) a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permite calcular la concentración del ADN en la muestra. Una D.O. 260 de 1.0, corresponde aproximadamente a 50 µg.ml -1 de ADN doble cadena, a 33 µg.ml -1 de ADN cadena sencilla, a µg.ml -1 de oligonucleótidos entre 20 a 40 bases y a 40 µg.ml -1 de RNA. La relación entre las medidas a 260 y 280 (D.O. 260 :D.O. 280 ) 26

28 proporciona un estimado de la pureza de la muestra. Las preparaciones puras de ADN deben tener un valor D.O. 260 :D.O. 280 de 1,8 a 2. Valores por debajo de este rango son un indicativo de contaminación con proteínas o fenol. Debido a su rapidez, simplicidad y ausencia de daño, la cuantificación de ADN por espectrofotometría ha sido ampliamente utilizada. Sin embargo, esta técnica es poco sensible, y para la mayoría de los espectrofotómetros se requiere una concentración de ADN de al menos 1 µg.ml -1 en la muestra para poder realizar estimaciones válidas. En esta práctica utilizaremos la técnica de cuantificación de ácidos nucleicos mediante espectrofotometría, para evaluar la muestra de ADN plasmídico aislado de las células transformantes de E. coli en la práctica 2. Materiales y Reactivos Tampón TE (Tris-HCl ph mm, EDTA 0.1 mm) Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Micropipetas P20, P200 y P1000 Puntas para micropipetas L Cubetas de cuarzo de 1 ml Espectrofotómetro con lámpara de luz UV Protocolo 1. Realizar una dilución 1:200 (5 L en 1 ml) de la muestra de ADN plasmídico aislado en la práctica 2 utilizando tampón TE, en un volumen final de 1 ml. 2. Calibrar a cero el espectrofotómetro con tampón TE. Colocar el volumen total de la dilución de la muestra en una cubeta de cuarzo de 1 ml. Mida y registre el valor de la D.O. a 260 y 280 nm. 27

29 3. Estime la concentración de ADN en la muestra utilizando la siguiente relación: [ADN] = 50 g.ml -1 x D.O. 260nm x factor de dilución Como alternativa a la estimación directa de la concentración de ADN utilizando el espectrofotómetro, es posible correr la muestra problema simultáneamente con una serie de diluciones de ADN plasmídico de concentración conocida. Una vez realizada la corrida electroforética, teñido el gel en una solución de BrEt y registrada la imagen, siguiendo las indicaciones del paso 6 del protocolo de la práctica 3, estime la concentración de la muestra por comparación con los ADNs de las diluciones. Preguntas de la práctica 1. Por qué considera usted que es necesario realizar la estimación de la concentración del ADN aislado? 2. Por qué se debe realizar una dilución de la muestra antes de medir la D.O. en el espectrofotómetro? 3. Por qué sólo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la estimación de la concentración del ADN? Qué información nos provee la D.O. a 280 nm? Por qué utilizó el valor de 50 g.ml -1 en la fórmula para calcular la concentración de su muestra? 4. Calcule el grado de pureza de la muestra aislada en la práctica 2 y compare con el valor teórico. Discuta sus resultados. 5. Compare sus resultados (Concentración de ADN y relación de pureza D.O. 260 :D.O. 280 ) con los del resto del curso. Discuta. 28

30 PRÁCTICA 5 CARACTERIZACIÓN DE PLÁSMIDOS RECOMBINANTES POR ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN Objetivos Manejar los principios metodológicos básicos del uso de las enzimas de restricción para la caracterización de moléculas de ADN. Evaluar mediante la técnica de electroforesis en geles de agarosa, los tamaños de los fragmentos generados por la digestión con enzimas de restricción de los plásmidos aislados en la práctica 2 y comparar el patrón obtenido con el reportado en los mapas físicos. Introducción Las enzimas o endonucleasas de restricción, ER, son proteínas que reconocen secuencias definidas del ADN entre 4, 6 o más nucleótidos, cortando en sitios específicos dentro de esta secuencia o en sitios vecinos a ella. Desde su descubrimiento en los años 70 se han aislado más de 300 enzimas de restricción dándoles denominaciones de acuerdo a las diferentes especies de bacterias donde se originan; por ejemplo EcoR I fue aislada de E. coli, Hind III de Haemophilus influenzae y Hpa I de Haemophilus parainfluenzae. Las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción son generalmente palíndromos y cada enzima reconoce una secuencia diferente. En su conjunto las ER constituyen una herramienta para obtener fragmentos discretos de ADN con extremos cuya secuencia es conocida. Los fragmentos de ADN resultantes de una digestión con enzimas de restricción pueden ser separados por electroforesis 29

31 en geles de agarosa en un rango de 200 pb a 20 kb. A la combinación de digestión con enzimas de restricción y al análisis mediante electroforesis en geles se le llama análisis de restricción. La representación de una molécula de ADN, ya sea circular o lineal, donde se indiquen a escala con el tamaño en pb, la ubicación de los sitios de restricción que poseen, se denomina mapa de restricción. En este ejercicio práctico se realizará la verificación del mapa de restricción de los plásmidos pegfp y peyfp aislados en la práctica 2 (Figura 1). Materiales y reactivos ADN plasmídico aislado en la práctica 2 Enzimas Hae II, Xba I y EcoR I Tampón 10X específico de cada enzima Agua bidestilada, autoclavada Estufa a 37ºC Tubos plásticos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml Micropipetas P20 y P200 Puntas para micropipetas L Protocolo Nota: Cada equipo va a realizar tres digestiones por separado para la muestra de ADN plasmídico, con cada una de las enzimas Hae II, Xba I y EcoR I. Previo a montar las digestiones, registre los reactivos, sus concentraciones y el volumen a utilizar en un cuadro similar al descrito en la Tabla Siguiendo el orden de la Tabla 2, colocar la solución de ADN (pegfp o peyfp proveniente de la miniprep de la práctica 2), en un tubo de 1,5 ml estéril. Estime el volumen de la solución 30

32 de ADN de acuerdo a la evaluación del rendimiento del aislamiento en el gel de agarosa y a la concentración estimada en el espectrofotómetro o a través de comparación en geles. 2. Añadir 1,5 L del tampón de la enzima (10x). 3. Agregar 0,5 L la enzima (Hae II, Xba I o EcoR I). 4. Completar hasta 15 L con H 2 O bidestilada y autoclavada. 5. Incubar a 37ºC por 2 horas. 6. Analizar la digestión en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% en tampón TAE 1X. Mezclar 4 L de tampón de carga con cada tubo de digestión previo a colocarla en el gel. Incluir un marcador de peso molecular. 7. Utilizando guantes para manipular el gel, teñirlo en una solución de BrEt 0.5 g.ml -1 por 1 minuto. Transferirlo luego a una bandeja con agua destilada. 8. Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador UV y utilizando un aparato de fotodocumentación. Tabla 2 Registro de los reactivos, concentraciones y volúmes a utilizar en las digestiones con las enzimas Hae II, Xba I y EcoR I de los plásmidos pegfp y peyfp. Concentración Digestión Digestión Digestión Reactivo del stock HaeII (L) XbaI (L) EcoRI (L) DNA Tampón 10X enzima 8-10 u.l -1 H 2 O bd Volumen final

33 ANEXO 2. Patrones de restricción esperados para pegfp y peyfp. M M M)Marcador PM escalera de 1kb 1) peyfp sin digerir 2) peyfp colonia 1 dig. HaeII + RNasa 3) peyfp colonia 2 dig. HaeII + RNasa 4) pegfp sin digerir 5) pegfp colonia 1dig. XbaI + RNasa 6) pegfp colonia 2 dig. XbaI + Rnasa Figura 3. Resultado esperado del aislamiento de los plásmidos pygfp y pegfp y de su caracterización con las enzimas Hae II y Xba I. Corrida electroforética de las digestiones especificadas para cada carril en un gel de agarosa 1% p/v en tampón 1x TAE. Preguntas de la práctica 1. Investigar la nomenclatura de las enzimas de restricción. Por qué las enzimas utilizadas en la práctica se denominan Hae II, Xba I y EcoR I? 2. Indar sobre el origen de las enzimas de restricción y la importancia de su uso en la biología molecular. 3. Cuáles son los componentes del tampón de cada ER y cuáles son sus funciones? 4. Estimar el tamaño de los fragmentos generados en cada digestión y compárelo con el mapa de restricción en cada caso. Visite el sitio Por qué en el carril 6 de la figura 3 se observan cuatro bandas? 32

34 2DO BLOQUE Aplicación de técnicas de la genética molecular al diagnóstico de enfermedades hereditarias humanas INTRODUCCION En la genética clásica o Mendeliana el estudio del genotipo implica la realización de cruces y el análisis de las proles en las diferentes generaciones que revelen la expresión de los genes y las interacciones alélicas a través del fenotipo. Para el estudio de enfermedades hereditarias en humanos se analizan los pedigríes familiares, no siempre disponibles, en la búsqueda de patrones hereditarios asociados al fenotipo de la enfermedad. Afortunadamente, hoy en día existe la posibilidad de analizar directamente al genotipo de un individuo. Las herramientas disponibles, producto de la biología molecular, permiten establecer de manera exacta la secuencia de nucleótidos en el ADN de un gen determinando la presencia de mutaciones asociadas a un fenotipo en particular. El potencial de las nuevas tecnologías radica en su resolución y sensibilidad. La combinación de metodologías que permiten aislar fragmentos específicos de ADN utilizando la reacción de amplificación en cadena de la polimerasa o PCR, por su siglas en inglés Polymerase Chain Reaction, y métodos análogos de amplificación de ácidos nucleicos, así como estrategias que detectan variaciones en la secuencia de nucleótidos, como lo son la hibridación molecular, secuenciación directa del ADN o la ganancia o pérdida de sitios de reconocimiento y corte de enzimas de restricción detectados mediante técnicas de electroforesis, proporcionan las herramientas necesarias para identificar la presencia de mutaciones asociadas a enfermedades hereditarias y la certera posibilidad de hacer diagnóstico genético. Con las 33

35 metodologías existentes y disponibles es posible detectar y analizar la única copia de cada uno de los genes presentes en una célula. Históricamente fue Linus Pauling en 1941 quien acuñó el término enfermedad molecular al directamente relacionar la causa de la inmunoglobulinopatía o anemia drepanocítica sickle cell con la molécula de la hemoglobina. Por primera vez fue demostrado que una proteína anormal podía causar una enfermedad y que los genes determinaban la estructura de las proteínas. Utilizando el análisis electroforético, Pauling y sus colaboradores observaron que la hemoglobina Hb-SS mostraba un cambio en la movilidad electroforética respecto a la hemoglobina normal Hb-AA; este cambio era producto de una mutación en el gen de la -globina que daba lugar a un cambio en un aminoácido en la proteína madura. La hemogloblina Hb-SS se origina de la sustitución A -> T en el sexto codón del gen de la cadena de -globina. Este cambio en un nucleótido cambia al sexto aminoácido en la cadena peptídica de ácido glutámico a valina, cambio que a su vez afecta la forma y función de la molécula de hemoglobina adulta. Los eritrocitos que portan estas moléculas pueden tener formas anormales que obstruyen los capilares o son degradados en los riñones. El individuo que hereda un alelo mutado de -globina de uno de sus padres y un alelo normal, se dice que porta el carácter y tendrá una hemoglobina adulta del tipo Hb-AS. Si tiene ambos alelos normales para la -globina, este individuo tendrá una hemoglobina adulta del tipo Hb-AA. En caso de heredar ambos alelos mutantes el individuo tendrá una hemoglobina adulta Hb-SS. La anemia drepanocítica es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva introducida en el continente Americano con el tráfico de esclavos desde África y que afecta 1 de cada 600 afrodescendientes norteamericanos. Fue el primer desorden hereditario en ser diagnosticado utilizando métodos moleculares dirigidos al genotipo. A finales de los años 70, se realizó el diagnóstico 34

36 molecular combinando técnicas de hibridación Southern utilizando una sonda del gen de la -globina, marcada radiactivamente, para detectar polimorfismos en el tamaño de los fragmentos generados por la digestión con una enzima de restricción (diagnóstico RFLP por sus siglas en inglés Restriction Fragment Length Polymorphism). Esta primera prueba era indirecta y detectaba el ligamiento genético de la mutación en el gen de la -globina a la presencia/ausencia de un sitio polimórfico Hpa I vecino al gen. En 1982 se identificó la mutación puntual en el gen de la -globina que da origen a la Hb-SS y posteriormente se determinó que la mutación destruye un sitio de corte para la enzima Mst II y sus isoesquizómero Bsu36 I, asociando directamente un RFLP al diagnóstico genético. La metodología del RFLP requiere del aislamiento de células fetales mediante amniosistesis para la obtención de suficientes cantidades de ADN genómico a analizar en las hibridaciones Southern. Este requerimiento del ensayo constituía una limitante que ha sido solventada acoplando la amplificación de la región del gen de -globina mediante PCR a la digestión del amplicón con la enzima MstII o la Bsu36I. Luego del análisis electroforético de los patrones de fragmentos generados en la digestión, es posible identificar el genotipo. Las pruebas de diagnóstico molecular están disponibles en la actualidad para un gran número de desórdenes genéticos y permiten evaluar familias completas, así como el realizar el diagnóstico prenatal del feto con profundas implicaciones sociales que deben ser consideradas mucho antes de su implementación. Es necesario que se establezcan criterios y marcos referenciales, conjuntamente con los programas de diagnóstico, en los que se contemplen aspectos como la certeza y efectividad de la prueba, su verdadera utilidad, particularmente para enfermedades genéticas sin cura, y el asesoramiento o consejo genético que debe acompañar al programa de diagnóstico. En el caso de la anemia 35

37 drepanocítica, para la cual no existe un tratamiento curativo, se considera que la única medida a nivel mundial para prevenir la enfermedad es el diagnóstico prenatal. El procedimiento del diagnóstico molecular ha sido simplificado y estas pruebas pueden ser realizadas de forma segura en muchos países, lo suficientemente temprano como para permitir una elección segura de terminación del embarazo. En este segundo bloque del laboratorio realizaremos la aplicación de métodos de biología molecular para el análisis directo del genotipo con la finalidad de identificar la presencia de los alelos salvajes y mutantes del gen de -globina asociados al fenotipo de la anemia drepanocítica. Utilizaremos una metodología sencilla para el aislamiento del ADN del epitelio bucal, a partir del cual será amplificada una región del gen de -globina que contiene la región N-terminal de la proteína donde se ubica la mutación. Mediante el patrón de RFLP de este amplicón con la enzima Bsu36 I, será posible identificar el genotipo de la muestra con respecto al gen de la - globina. Consideraremos en este bloque dos aspectos asociados y consecuencia de la aplicación de técnicas moleculares al análisis del genoma para el diagnóstico de enfermedades hereditarias y la identificación de individuos: la incorporación del consentimiento informado para los individuos participantes en las pruebas y una lectura que ilustra la pertinencia de estas metodologías para resolver problemas legales en los tribunales con un verdadero impacto en la sociedad. De esta manera, el contenido del segundo bloque del manual de laboratorio cubre los aspectos técnicos básicos del análisis a nivel del genoma de las enfermedades hereditarias humanas como las implicaciones éticas de su aplicación. 36

38 PRÁCTICA 6 ANÁLISIS DE PERFILES GENÉTICOS HUMANOS MEDIANTE PCR-RFLP: DETECCIÓN DE UNA MUTACION PUNTUAL O SINGLE NUCLEOTIDE POLIMORPHISM, SNP, EN EL GEN DE LA -GLOBINA Objetivos Aislar ADN genómico de células de epitelio bucal humano para análisis de RFLP-PCR Manejar los fundamentos de la técnica de amplificación de ADN por PCR. Analizar mediante la técnica de PCR-RFLP, la presencia de mutaciones puntuales o del Single Nucleotide Polymorphism, SNP, en el gen de la ß-globina humana responsable de la anemia drepanocítica. PARTE I PREPARACIÓN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS La efectividad en la aplicación de una reacción de amplificación de ADN o ARN depende principalmente de la calidad del material de partida para el análisis. En primer lugar es imprescindible la selección adecuada de la fuente del material genético del organismo a identificar. El origen del material genético a evaluar puede ser variado. En el caso de bacterias y parásitos la fuente ideal es el cultivo del organismo. Sin embargo, no siempre es posible tener un cultivo por razones técnicas y/o biológicas, en consecuencia se debe obtener una muestra que contenga al microorganismo o su genoma, como 37

39 muestras de suelos, biopsias, sangre o suero. Para el análisis de genotipos humanos en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, determinación de filiación e investigaciones forénsicas, se aísla ADN a partir de muestras de sangre o de células fetales provenientes del líquido amniótico en el caso del diagnóstico prenatal. Sin embargo, la altísima sensibilidad de las técnicas de amplificación de ADN in vitro permiten ampliar la fuente del ADN a todo tipo de muestras que contengan células del individuo; células del epitelio bucal son utilizadas rutinariamente en el análisis de perfiles genéticos humanos. Una vez seleccionada la fuente de ADN, la muestra debe ser sometida a un proceso de extracción de ácidos nucleicos con el fin de preservarlos y evitar la acción degradativa de enzimas u otros compuestos presentes inicialmente en la misma; así como eliminar sustancias que interfieran o inhiban de alguna manera la reacción de amplificación. El protocolo de procesamiento previo de la muestra depende exclusivamente del tipo y origen de la misma, así como de la calidad del material que se desea obtener. En general, los métodos de preparación de muestras buscan degradar proteínas y extraer el ADN. Las proteínas son desnaturalizadas o degradadas enzimáticamente y posteriormente separadas de los ácidos nucleicos. Luego de descartar las proteínas, el ADN puede extraerse por separación del precipitado proteico o con extracción fenólica. Es importante saber que, siempre que se trabaje con muestras de origen humano debe existir un Consentimiento Informado del sujeto al cual se le extrae la muestra. El Consentimiento Informado es un proceso mediante el cual un sujeto confirma voluntariamente su deseo de participar en un estudio en particular, después de haber sido informado sobre todos los aspectos de éste que sean relevantes para que tome la decisión de participar. El Consentimiento Informado se documenta por medio de un formulario donde se registra por escrito la información del estudio y 38

40 la manifiesta aceptación del individuo en participar, confirmando el conocimiento de su contenido. Este documento es firmado y registra la fecha de su elaboración. 1.1 Aislamiento de ADN a partir de epitelio bucal. El epitelio bucal está en constante regeneración y sus células son reemplazadas continuamente. Aprovechando esta propiedad, este protocolo permite extraer ADN genómico de células provenientes la capa más superficial del epitelio estratificado mediante el raspado de las paredes internas de las mejillas y de las encías, utilizando para ello hisopos de algodón. La proteinasa K rompe enlaces peptídicos, lo que permite digerir las proteínas que se encuentren junto al ADN en el lisado celular. Materiales y reactivos Proteinasa K 10 mg.ml -1 Tampón de lisis 1X (Tris-HCL 0,05 M ph 8; EDTA 0,05 M ph 8; glucosa 0,05 M; SDS 0,5%; NaCl 0,1 M) Hisopos estériles Micropipetas P20, P200 y P1000 Puntas para micropipetas L, 1 ml Baños de incubación Centrífuga refrigerada alcance a r.p.m. Tubos plásticos estériles de 1,5 ml y 15 ml 39

41 Protocolo NOTA: Recuerde rotular todo el material que vaya a utilizar. 1. Con un hisopo estéril raspar o rayar generosamente la parte interna de su mejilla derecha y el espacio entre su mejilla y encía durante un minuto; intente recolectar tanto material como le sea posible. 2. Colocar el hisopo con las células del epitelio bucal en el tubo que contiene 1 ml de tampón de lisis 1X. Agitar vigorosamente el hisopo para liberar las células en el tampón, para transferir la mayor cantidad de células posibles. 3. Usando un segundo hisopo estéril, raspar o rayar la parte interna de su mejilla izquierda y el espacio entre su mejilla y encía, así como en la parte más interna de la boca como lo hizo en el paso (1). Trate de recolectar la mayor cantidad posible de material que le sea posible. Coloque el segundo hisopo en el tubo con tampón de lisis como hizo en el paso (2). 4. Tapar e invertir gentilmente el tubo 5 veces para mezclar el contenido. 5. Agregar 1 µl de proteinasa K (10 mg.ml -1 ) al tubo. 6. Tapar nuevamente el tubo e invertir gentilmente varias veces para mezclar el contenido. 7. Incubar los tubos en un baño de temperatura a 37 ºC durante 20 minutos. 8. Pasado este tiempo, colocar los tubos en un baño de temperatura a 50 ºC durante 10 minutos. 9. Añadir 200 µl de NaCl 8 %. Tape el tubo e invierta suavemente 5 veces. 40

42 10. Trasvasar el contenido de este tubo a un tubo de 15 ml. Añadir lentamente por las paredes del tubo, 2 ml de etanol 100%. Deje reposar durante 5 min. 11. Transcurridos los 5 min., sellar el tubo con parafilm e invertir 5 veces para ayudar a precipitar el ADN. 12. Centrifugar durante 15 min. a r.p.m. Descartar el sobrenadante y dejar secar todo el alcohol. 13. Resuspender el ADN en un volumen no mayor a 200 µl de tampón TE o agua MiliQ (calidad PCR, libre de ADNasas y ARNasas) 14. Correr 5 µl del ADN en un gel de agarosa 0.8% para verificar la cantidad e integridad del ADN aislado. 15. Diluir el ADN 1/100 antes de iniciar el protocolo de PCR. Observaciones La recolección de un número abundante de células es crítica para lograr los objetivos. Asegúrese de emplear el tiempo recomendado para la colección y transferencia de las células del epitelio bucal. Es muy importante incubar la solución junto con la proteinasa K a 37 ºC para purificar el ADN que se encuentra en la solución. Asegúrese de realizar las digestiones durante el tiempo recomendado, note que un mayor tiempo de digestión permitirá obtener un ADN mucho más puro. Preguntas de la práctica Compare los pasos y reactivos utilizados en el aislamiento de ADN plasmídico (Práctica 2) y ADN genómico (Práctica 6, Parte I). Qué diferencias y similitudes observó? 41

43 ANEXO 3 CONSENTIMIENTO INFORMADO En el Laboratorio de Genética Molecular, como parte de la Práctica 6, se propone realizar un análisis de perfiles genéticos humanos mediante RFLP-PCR. El objetivo del trabajo es evaluar, mediante esta técnica, la presencia de una mutación puntual en el gen de la ß-globina humana, responsable de la anemia drepanocítica. Los datos obtenidos en este estudio contribuirán inicialmente a la realización de la práctica, y posteriormente, con la acumulación de datos año tras año, podrá llevarse a cabo la construcción de un banco de datos de este polimorfismo, que eventualmente permitirá calcular la frecuencia de esta mutación en la población venezolana. Yo, C.l.:, Nacionalidad Estado Civil siendo mayor de 18 años, en uso pleno de mis facultades mentales y sin que medie coacción ni violencia alguna, en completo conocimiento naturaleza, forma, duración, propósito, inconvenientes y riesgos relacionados con el estudio que mas abajo se índica, declaro mediante la presente: 1.- Haber sido informado de manera objetiva, clara y sencilla, de todos los aspectos relacionados con la práctica número 6 del laboratorio de la materia electiva Genética Molecular. 2.- Tener conocimiento claro de que el objetivo del trabajo antes señalado es: es evaluar, mediante la técnica RFLP-PCR, la presencia de una mutación puntual en el gen de la ß-globina humana, responsables de la anemia falciforme. 3.- Conocer bien el protocolo experimental expuesto por el investigador; en el cual se establece que mi participación en el trabajo consiste en donar al laboratorio de la materia electiva Genética Molecular de la Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, 42

44 Universidad Central de Venezuela, una muestra de células del epitelio bucal. 4.- Que la muestra de células del epitelio bucal que acepto donar así como la información que suministre al equipo de profesores del laboratorio de la materia electiva Genética Molecular coordinados por la Dra. Palmira Guevara, será utilizada única y exclusivamente para determinar la presencia de mutaciones puntuales en el gen de la ß- globina humana. 5.- Que el equipo de profesores coordinados por la Dra. Palmira Guevara, me ha garantizado confidencialidad, relacionada tanto a mi identidad como de cualquier información a la que tengan acceso, por concepto de mi participación en el proyecto antes mencionado. 6.- Que bajo ningún concepto podré restringir el uso, para fines académicos, de los resultados obtenidos en el presente estudio. 8.-.Que mi participación en dicho estudio no implica riesgo ni inconveniente alguno para mi salud, así como que dicho estudio no forma parte de una terapia paliativa o curativa. 7.- Que cualquier pregunta que yo tenga en relación con este estudio, me será respondida oportunamente por parte del equipo de profesores antes mencionados con quienes me puedo comunicar por el teléfono de la dirección de la Escuela de Biología con la Dra. Palmira Guevara. 8.- Que bajo ningún concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir ningún beneficio de tipo económico producto de los hallazgos que puedan producirse en el referido proyecto de investigación. 9.- Que los resultados de las pruebas realizadas me serán entregados oportunamente. Caracas a los días del mes de del 20 Firma: Nombre y apellido: 43

45 PARTE II ENSAYOS DE AMPLIFICACIÓN MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE ß- GLOBINA HUMANA El desarrollo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (del inglés Polimerase Chain Reaction) es uno de los avances tecnológicos de mayor impacto en las técnicas de Biología Molecular y debido a sus múltiples aplicaciones constituye un importante progreso en el área de diagnóstico e identificación molecular. Posiblemente, una de sus mayores ventajas corresponde a la simplicidad de la reacción y la relativa facilidad en los pasos de manipulación de material de trabajo, permitiendo la adopción de la técnica de PCR en diversos ámbitos. En esta técnica, la amplificación de un fragmento específico de ADN, por ciclos sucesivos, es un proceso de multiplicación exponencial, que genera suficiente producto que puede acumularse y ser visualizado. De esta manera, una sola molécula puede generar más de un billón de copias de si misma, luego de 30 ciclos de replicación exponencial. El PCR se utiliza para amplificar un fragmento definido de ADN a partir de una mezcla compleja de material, usualmente llamada ADN templado. Para la obtención del templado se precisa de un proceso de purificación a partir de la muestra, tal como se señala en la Práctica 6, Parte I del presente manual. Además del templado, se requiere el conocimiento de las secuencias de ADN que flanquean al fragmento a ser amplificado, conocido como ADN blanco. A partir de esta información se pueden diseñar y sintetizar químicamente dos oligonucleótidos iniciadores. Cada uno de estos oligonucleótidos es complementario al extremo 3 de la hebra de ADN de la secuencia blanco, un oligonucleótido para cada una de las 44

46 dos hebras del ADN (Figura 4). La técnica de PCR es un proceso de síntesis in vitro de ADN, en el cual se copia una hebra complementaria a partir de un templando, extendiéndose en dirección 3 5 a partir de un iniciador, cebador o primer. Consiste en tres pasos definidos de tiempo y temperatura, conocidos como desnaturalización, alineamiento y extensión, y cada conjunto secuencial de pasos o ciclos es repetido de 30 a 40 veces (Figura 4). En el primer ciclo el templado de ADN doble cadena es inicialmente desnaturalizado por calentamiento de la mezcla de reacción a una temperatura por encima de 90 C. Con esta primera etapa, la región de ADN que será específicamente amplificada (secuencia blanco o diana) se hace accesible, dentro de la muestra de ADN total. Posteriormente, la temperatura se baja hasta alcanzar entre 40 a 60 C para iniciar el segundo paso, el alineamiento de los oligos o cebadores. En este período los cebadores, presentes en exceso en la mezcla de reacción, se ubican mediante hibridación por complementaridad de bases con la secuencia blanco. Los oligonucleótidos alineados actúan como iniciadores para la síntesis del ADN, dado que proveen del grupo hidroxilo 3 libre para la ADN polimerasa. La precisión en la temperatura de esta fase es crítica y está definida por el Tm de cada cebador, en cada sistema de PCR debe optimizarse tomando en cuenta este parámetro. Las reacciones que no están optimizadas pueden generar productos de ADN adicionales al blanco específico si la temperatura esta muy por debajo del Tm o pueden no producir ningún producto amplificado si son muy elevadas. El tercer paso, la síntesis del ADN o extensión, es realizada a 72 C por una ADN polimerasa termoestable, mas comúnmente llamada Taq ADN polimerasa, porque es originaria de la bacteria Thermus aquaticus. Finalmente, el ADN sintetizado posee los sitios de anclaje para los oligonucleótidos, sirviendo como templado para 45

47 los sucesivos ciclos de PCR. Cada sistema de PCR sigue el mismo principio básico, sin embargo la secuencia de los oligonucleótidos, los componentes de la mezcla de reacción, así como las temperaturas y los tiempos de cada paso de un ciclo son específicos. En la presente sección se presentan un esquema general de los pasos de la reacción de PCR con rangos de temperaturas para diversos sistemas. Figura 4. Pasos de cada ciclo en la reacción de PCR 2.1 Diagnóstico molecular de la anemia drepanocítica: PCR-RFLP, amplificación de un segmento del gen de la β-globina mediante la reacción de PCR El diagnóstico de la anemia drepanocítica se realiza por diferentes métodos, las pruebas moleculares detectan la presencia de la mutación a nivel de la proteína o directamente en el gen. En el primer caso se evalúa el cambio de la movilidad de la hemoglobina en electroforesis en acetato de celulosa, isoelectroenfoque o 46

48 cromatografía líquida de alta resolución, asociado a la presencia de una valina en lugar de un ácido gluámico en la posición seis de la cadena de β-globina (Figura 5). La mutación puntual que resulta en el cambio del codón GAG del ácido glutámico al codón GTG de la valina, también cambia el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción MstII y su isoesquisómero Bsu36I. En la prueba de PCR- RFLP de la anemia drepanocítica que incluimos en este manual, luego de la amplificación de un fragmento de 536 pb, correspondiente a la región N-Terminal del gen de la β-globina, se realizará una digestión de este amplicón con la enzima Bsu36 I y se evaluará el patrón de los fragmentos generados en la restricción (Figura 6) para la identificación del genotipo del individuo entre homocigoto normales HbAA, homocigotos que sufren la enfermedad HbSS y heterocigotos o portadores del caracter con hemoglobina HbAS. Mutación en el Codón ß6 GAG GTG Acido glutámico ß6 Reemplazo del aa Valina ß6 Variante de hemoglobina HbAA, HbAS y HbSS Forma del eritrocito Normal Falciforme Figura 5. Esquema del origen de los eritrocitos falciformes. 47