DESARROLLO DE UN BANCO DE ADN DEL GENERO NICOTIANA

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1 DESARROLLO DE UN BANCO DE ADN DEL GENERO NICOTIANA Yosvanis Acanda Artigas, Humberto García Cruz, Anabel Díaz Ramos Javier Jiménez Rico Instituto de Investigaciones del Tabaco. Carretera Tumbadero, km 8 ½, San Antonio de los Baños, La Habana, Cuba RESUMEN Los bancos de ADN permiten la conservación de la información genética durante un largo período de tiempo. Cuando se quiere hacer estudios de polimorfismo o variabilidad genética, mediante marcadores moleculares u otras técnicas que empleen ADN genómico como material de estudio, es necesario proceder primeramente a la extracción de ADN, la cual no es una técnica de mucha dificultad pero requiere de tiempo y recursos. El objetivo de este trabajo es iniciar el desarrollo de un banco de ADN del género Nicotiana, que dé abasto de este material a las investigaciones que se realizan en el campo de la genética en nuestro Instituto o en otras entidades, y que esté disponible en la web para usuarios interesados en adquirir o intercambiar muestras. Para la extracción de ADN se emplearon nueve variedades, once especies y un híbrido interespecífico y se siguió el protocolo propuesto por Rong-Cheng et al., La calidad del ADN obtenido se chequeó por electroforesis en gel de agarosa 0,6 % y por la relación de absorbancia a 260/280 nm. Se cuantificó mediante espectrofotometría a 260 nm. Se diseñó una aplicación web ASP.NET mediante el lenguaje de programación C# (C SHARP) y la plataforma de desarrollo VisualStudio.net. Las muestras de ADN se almacenaron etiquetadas a -30 ºC en buffer TE en alícuotas de 150 μl. Se pudo establecer un banco preliminar de ADN que contiene 21 muestras. Palabras claves: ADN, banco, germoplasma, tabaco, base de datos ABSTRACT DEVELOPMENT OF NICOTIANA SPP DNA BANK The DNA banks allow preserving genetic information for a long time. DNA extraction is not a complex technique, but is necessary for polymorphism or variability studies and marker assisted selection in plants. To initiate the development of a Nicotiana DNA Bank is the goal of this work. The bank will provide of DNA to researches and institutions related with molecular genetic in plants and the collection s data will be available by internet. The Rong-Cheng et al., 2001 protocol for DNA extraction from nine cultivars, eleven species and one hybrid was applied. DNA quality was esteemed by electrophoresis and absorbance relation at 260/280 nm and quantified by espectrophotometry at 260 nm. The samples were labelled and preserved at -30 ºC in TE buffer.a web application ASP.NET was designed using the program language C# (C SHARP) and VisualStudio.Net as platform. A preliminary DNA bank containing 21 samples was established. Key Words: DNA, bank, germoplasm, tobacco, data base 9

2 Vol.8, No.2, 2007 INTRODUCCIÓN La preservación de la información genética mediante la conservación del ADN es un procedimiento que ha ido tomando auge en los últimos años para complementar la información contenida en los bancos de germoplasma de numerosas especies vegetales. La conservación tradicional de plantas se lleva a cabo mediante el mantenimiento ex situ de colecciones vivientes en bancos de semillas y jardines botánicos, y la colección de especímenes en herbarios y museos. Estas colecciones han sido utilizadas como fuente de ADN para estudios moleculares, en el caso de la colección de semillas, estos bancos de germoplasma han sido considerados como «bancos de genes» o «librerías de genes» (Given 1994, Miglani 1998). Sin embargo, estos mismos términos han sido recientemente más utilizados para referirse a las colecciones de ADN genómico (Mattick et al., 1992, Adams 1997). Los protocolos de extracción de ADN de tejidos vegetales han sido optimizados para numerosas especies con el fin de obtener alto rendimiento y buena calidad del material genético, que permita emplearlo en técnicas basadas en PCR para diversos estudios genéticos. Contar con un banco de ADN permitirá disponer de este material en cantidades suficientes y con óptima calidad, lo cual constituirá un significativo ahorro de tiempo y esfuerzos en otras investigaciones que requieran de este material. Por otra parte, el intercambio de ADN es más seguro que el intercambio de semillas, pues de esta manera protegemos nuestras variedades comerciales, es más barato y se evita el riesgo de trasladar patógenos. El objetivo de este trabajo es iniciar el desarrollo de un banco de ADN que dé abasto de este material a las investigaciones que se realizan en el campo de la genética en nuestro Instituto y en otras entidades, así como promover el intercambio de información genética sin necesidad de manejar semillas, como una alternativa para proteger nuestras variedades y agilizar las investigaciones que requieran de este material. El establecimiento de un banco de ADN puede dar mayor funcionalidad a nuestro banco de germoplasma ya que, si se quieren realizar estudios que empleen ADN como material de partida, estaría adelantada su extracción con la calidad requerida. Existen numerosos bancos de ADN genómico de plantas en todo el mundo y se puede apreciar una tendencia a la conservación de ADN en los bancos de germoplasma por las facilidades que brinda. MATERIALES Y MÉTODOS Se plantó un semillero en bandeja con 9 variedades de tabaco, 11 especies del género Nicotiana y un híbrido interespecífico Nicotiana megalosiphon X VR-14. Se colectaron aproximadamente 5 g de hojas de las plántulas de 30 días postgerminación. Se extrajo ADN genómico según el procedimiento descrito por Rong- Cheng et al., 2001, que permite la extracción de ADN genómico de tejidos vegetales con alto rendimiento y suficiente calidad para emplearlo en técnicas de PCR. Las muestras de ADN se chequearon mediante electroforesis en gel de Agarosa 0.6 % con bromuro de etidio (0.5 μg/ml) a 120 V en buffer TAE 1X (40 mmol Tris-Acetato ph 8.0; 1 mmol de EDTA). Se cuantificó y chequeó la calidad de las muestras a partir de los valores de absorbancia a 260 nm empleando la relación [ADN μg/μl] = Densidad Óptica X 50 X Factor de Dilusión y se determinó la relación de absorbancia a 260/280 nm de cada muestra contra un blanco de TE 1X 10

3 (10 mmol Tris HCl ph 8.0; 1 mmol EDTA ph 8.0). La calidad de las muestras de ADN para PCR se comprobó mediante cuatro reacciones prueba. Se empleó ADN de N. megalosiphon, N. exigua, N. debneyi y H y como cebadores, los oligos degenerados FW: 8883 y RV: 8887, diseñados y sintetizados en el CIGB para la amplificación de genes de resistencia. Las condiciones de la reacción fueron: para 50 μl de reacción se utilizaron 20 picomoles de cada oligonucleótido, 1 ng de ADN genómico, mezcla de dntp a 200 μmol, 5 μl de tampón de PCR 1X (promega) y 1.25 U de la enzima Taq DNA polimerasa (promega). Las reacciones se llevaron a cabo en un bloque térmico inteligente Minicycler TM (MJ Research, Inc., EE.UU) de la siguiente forma: 95 ºC 2 min, 30 ciclos (95 ºC 1 min, 52 ºC 30 s, 72 ºC 2 min) y 72 ºC 5 min. Los productos de PCR fueron chequeados mediante electroforesis en gel de agarosa 0.8 tablas de datos se almacenaron en ficheros XmL, para lograr un acceso más eficiente a datos y una mayor portabilidad de la aplicación. El lenguaje de programación empleado fue C# (C SHARP) y la plataforma de desarrollo VisualStudio.net. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Mediante electroforesis en gel de agarosa 0.8 % se pudo comprobar la integridad del ADN genómico en todas las muestras, en todos los casos una banda única de alto peso molecular indica la calidad de las muestras (Figura 1). Se obtuvo un rendimiento de más de 170 μg por cada 200 mg de hojas. Los valores de la relación de absorbancia a 260/280 nm oscilan entre 2.3 y 4.1 por encima de 2.0 reportado por Rong Cheng et al., 2001 (Tabla 1). Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 0.6 % de las muestras de ADN. Carril 1: PPM (1 kb DNA Ladder), 2: N. glutinosa, 3: N. tomentosiforme, 4: N. debneyii, 5: N. exigua, 6: N. excelxior, 7: N. repanda, 8: N. megalosiphon, 9: N. plumbaginifolia, 10: N. % en buffer TAE 1X (40 mmol Tris-Acetato ph 8.0, 1mmol EDTA) y se tomó como control negativo una reacción bajo las mismas condiciones pero sin ADN molde. Se diseñó una aplicación web ASP.NET que proporciona un buscador dinámico de datos según tres posibles criterios del usuario. Las Los datos de la tabla 1 se almacenaron en ficheros XmL, para un mejor acceso a los datos y una mayor portabilidad de la aplicación. Se puede acceder a ellos mediante la página web genética/ 11

4 Vol.8, No.2, 2007 Tabla 1. Colección preliminar de muestras de ADN del banco de ADN del IIT. Mediante 4 reacciones pruebas se comprobó que el ADN extraído por este procedimiento tiene calidad para emplearlo en técnicas basadas en PCR. En todos los casos se obtuvieron productos con una talla cercana a la del gen N de resistencia en N. tabacum (Figura 2). Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 0.8 % de los productos de PCR con cebadores FW: 8883 y RV: Carril 1: PPM (1 kb DNA Ladder) 2: N. megalosiphon, 3: N. exigua, 4: N. debneyii, 5: Criollo 99, 6: Control negativo. 12

5 CONCLUSIONES Se pudo establecer un banco preliminar de ADN que contiene 21 muestras de especies, variedades e híbridos del género Nicotiana. Se creó una aplicación web para permitir el acceso a los datos de la colección del banco de ADN con criterio de búsqueda y vínculo al administrador de la colección. BIBLIOGRAFÍA Adams R.P.: Conservation of DNA: DNA banking. In Callow J. A., Ford-Lloyd B.V, Newbury H. J., editors. Biotechnology and Plant Genetic Resources Conservation and Use. CABI Publishing, Wallingfordk, UK. pp Given D. R.: Principles and Practices of Plant Conservation. Chapman and Hall, London, UK, Mattick, J. S., E. M. Ablett and D. L. Edmonson: The Gene Library: Preservation and Analysis of genetic diversity in Australasia. In Adams, R. P., Adams J. E., editors. Conservation of Plant Genes: DNA Banking and In Vitro Biotechnology. Academic Press, San Diego, USA. pp:15-35, Miglani G. S. Dictionary of Plant Genetics and Molecular Biology. The Haworth press, Binghamton, NY, USA Rong-Cheng L., D. Zai-Song, L. Lliang-Bi and K. Ting-Yun: A Rapid and Efficient DNA Minipreparation Suitable for Screening Tansgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter 19: 379a-379e,

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