Técnicas de Biología Molecular. Dr. Luis Salazar N Depto. de Ciencias Básicas / UFRO

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1 Técnicas de Biología Molecular Dr. Luis Salazar N Depto. de Ciencias Básicas / UFRO 2004

2

3 Extracción de ácidos nucleicos o o DNA RNA

4 Tipos de Muestras Sangre total (EDTA) Saliva Líquido Amniótico Bulbo capilar Tejidos, huesos, dientes Forense Manchas de sangre, líquido seminal y otros materiales

5 Muestra de sangre en papel filtro

6 Extracción de DNA genómico lisis centrif. etanol etanol 70% elución sangre lisado sobrenadante DNA

7 Sala de Extracción de DNA

8 CABINA DE SEGURIDAD BIOLÓGICA

9 CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA

10 Evaluación del DNA extraído Espectrofotometría UV Concentración (A260 x factor) Pureza (relación A260/A280) Electroforesis en gel de agarosa Integridad Pureza (contaminación con RNA)

11

12 Electroforesis de DNA

13 Electroforesis de DNA

14 Electroforesis de DNA

15 Electroforesis de DNA NaCl 5 M Nal 6 M Gel de agarosa al 0,8% teñido con bromuro de etídio

16 Electroforesis de RNA 28 S 18 S Electroforesis en gel de agarosa desnaturante

17 Técnicas para análisis de DNA Southern blot PCR Clonación DNA chips

18 Southern blot Hae III Singer & Berg, 1991

19

20

21 Southern blot

22 Southern blot- Sondas unilocus

23 Caracterización molecular de resistencia a cloranfenicol en cepas de Shigella flexneri aisladas en niños chilenos con diarrea aguda Detección del gen cat mediante Southern en cepas de Shigella flexneri Rev. Méd. Chile 2002; 130 (3):

24 Southern blot Sondas multilocus Caso de criminalística Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)

25 Southern blot Desvantajas Gran cantidad de muestra Ensayo demorado Uso de sondas marcadas con radioisótopos

26 Polymerase Chain Reaction -PCR

27 Thomas D. Brock - Yellowstone National Park

28 PCR - Componentes DNA Mg 2+ Taq DNA Polimerasa dctp dgtp dttp datp Partidores (primers) Mezcla de Reacción

29 Termociclador

30

31 PCR - Desnaturación Target Sequence Target Sequence

32 5 5 3 PCR - Alineamiento Target Sequence 3 partidor 2 partidor 1 3 Target Sequence 5 5 3

33 Los iniciadores sirven para dos fines: a. Marcar los extremos del segmento diana, de manera que solamente este segmento será amplificado y no toda la hebra. b. iniciar el proceso de duplicación.

34 5 5 3 PCR - Extensión 3 partidor 1 Target Sequence Target Sequence partidor 2 Taq DNA Polimerasa

35 Final del primer ciclo Target Sequence Target Sequence

36 Ciclos de la PCR Denaturación Hibridación Final de ciclo Extensión

37 Amplificación Exponencial 1 ciclo = 2 Amplicon 2 ciclo = 4 Amplicon 3 ciclo = 8 Amplicon 4 ciclo = 16 Amplicon 5 ciclo = 32 Amplicon 6 ciclo = 64 Amplicon 7 ciclo = 128 Amplicon No. No. Ciclos copias

38 FACTORES QUE AFECTAN EL PCR Temperatura y tiempo de denaturación Temperatura de hibridación y diseño del iniciador Tamaño del iniciador Temperatura y tiempo de elongación Tampón Número de ciclos

39 OPTIMIZACIÓN DEL PCR Usar iniciadores distantes entre 150 y 250 pares de bases Usar cada iniciador de aproximadamente 20 bp. Cerca de la mitad de las bases en cada iniciador debería ser citocinas y guaninas. Para el control de la técnica es importante amplificar un gen control (ej. α-glucosidasa) en cada muestra, esto demuestra la calidad de la extracción. Idealmente el iniciador control debe amplificar un gen similar en tamaño al gen objetivo.

40 Optimización de la PCR Concentración de ADN Concentración de iniciadores Concentración de cloruro de magnesio Número de ciclos

41 Efecto de la temperatura de alineamiento en la especificidad de la PCR Rev. Chil. Infectol. 2002; v.19, n.1

42 Concentración de ADN RLDL 258 bp ng

43 Concentración de iniciadores RLDL nm

44 Concentración de MgCl 2 RLDL GAPDH mm mm

45 Número de Ciclos da PCR RLDL GAPDH Ciclos Ciclos

46 Amplificación del gen KasA de Mycobacterium tuberculosis de cepas resistentes a Isoniazida (INH) M M Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio

47 Caracterización molecular de resistencia a cloranfenicol en cepas de Shigella flexneri aisladas en niños chilenos con diarrea aguda 1003 bp Detección del gen cat mediante PCR en cepas de Shigella flexneri Rev. Méd. Chile 2002; 130 (3):

48 Amplificación por PCR del gen meca de cepas de S. Aureus resistentes a meticilina 161 bp Rev. Chil. Infectol. 2001; v.18, n.4

49 Inhibiciones en amplificación por PCR Rev. Chil. Infectol. 2002; v.19, n.1

50 Características de la PCR o Alta sensibilidad y especificidad o Menor cantidad de muestra o Reducción del tiempo de ensayo o Riesgos - contaminación

51 Normas Generales para reducir la contaminación Organización del laboratorio Técnicas de laboratorio adecuadas Uso de control de reactivos Número de muestras Bioseguridad

52 Importancia de las enzimas en biología molecular

53 Importancia de las enzimas en biología molecular Replicación y Transcripción polimerasas ligasas nucleasas quinasas fosfatasas transcriptasa reversa

54 Aplicaciones de las Enzimas de Restricción Tecnología de DNA recombinante clonación de genes Estudio de polimorfismos genéticos Polimorfismo de tamaño de fragmentos de restricción (RFLP) Pesquisa de mutaciones Investigación de enfermedades genéticas

55 Importancia de las enzimas en biología molecular Polimerasas catalizan la síntesis de polimero de ácido nucleico Son fundamentales para clonación y amplificación de genes. Taq DNA polimerasa.

56 Importancia de las enzimas en biología molecular Nucleasas hidrolizan la ligación fosfato-diéster de los polimeros de ácidos nucleicos Exonucleasas Endonucleasas - Enzimas de restrición

57 Enzimas de Restricción Reconocen secuencia de DNA específica Degrada DNA extraño mecanismo de protección para bacterias Especie - específica Extremidades generadas asimétricas - sticky end simétricas - blunt end G*AATTC CTTAA*C GT*AC CA*TG G AATTC CTTAA C GT AC CA TG

58

59

60 Endonucleasas de Restricción Bam HI Eco RI Hinc II Hind III Kpn I Pvu II Xba I G*GATCC G*AATTC GTY*RAC (Y = C/T, R = A/T) A*AGCTT GGTAC*C CAG*CTG T*CTAGA

61 Endonucleasas de Restricción DNA ER 1 ER 2 Separación electroforética en gel de agarosa Tamaño del fragmento dirección de la eletrocforesis Tamaño del fragmento Singer & Berg, 1991

62 Técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism) 5 Exon 25 Exon 26 Exon 27 3 PCR Restricción Enzimática XbaI Fragmento amplificado 710 bp 710 bp Genotipo X-X- 277 bp Genotipo X+X- 433 bp 710 bp 433 bp 277 bp Genotipo X+X+

63 Polimorfismo XbaI del gen de la apob -/- +/- +/- +/+ 710 bp 433 bp 277 bp Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etídio

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