ACTIVIDAD PRACTICA No. 8 BIOLOGIA CELULAR EXTRACCIÓN DE ADN

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1 Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado Decanato de Ciencias de la Salud ACTIVIDAD PRACTICA No. 8 BIOLOGIA CELULAR EXTRACCIÓN DE ADN Octubre 2009

2 INTRODUCCION La molécula de ADN (que es la que se va a extraer en ésta actividad práctica) está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de ADN, se mantienen unidas entre sí porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan apareadas. La unión de las bases se realiza mediante puentes de hidrógeno, y este apareamiento está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). La estructura de un determinado ADN está definida por la "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de nucleótidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es, por tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje genético. La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A- T; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automáticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria. Partiendo del hecho de que para el estudio de las otras biomoléculas: lípidos, proteínas, enzimas, carbohidratos y vitaminas, no sólo existen diversos procedimientos prácticos para complementar la parte teórica, sino que además, son moléculas que por su importancia en la alimentación y en la salud humana, son más conocidas y reconocidas por los alumnos (y en general por todas las personas), no así, para el caso del ADN, pues éste ni forma parte directa de nuestra dieta, ni lo podemos consumir en su esencia como consumimos vitaminas a partir de frutas y vegetales, y aún más, su grado de abstracción nos resulta aún mayor. Además, por todas las implicaciones y aplicaciones que del estudio y manipulación de la molécula de ADN se derivan, se considera el descubrimiento de la misma como la segunda gran revolución científica (la primera fue para el campo de la física, con la bomba atómica).

3 Algunas aplicaciones de las técnicas de extracción de ADN En los últimos años los constantes avances científicos y técnicos han tenido un profundo impacto en el ámbito de la prueba. La dactiloscopia, la balística, la documentoscopia, etc., son ejemplos de esta proyección de los conocimientos científicos en el campo policial y judicial. Los avances han sido particularmente espectaculares en el ámbito de la Biología Molecular. En concreto, lo que se denomina Genética Forense, consistente en el análisis genético de la diversidad humana, ha marcado un antes y un después en la resolución de ciertos problemas judiciales. Precisamente por ello, para reflexionar sobre los malentendidos y los problemas que plantea la prueba científica puede ser útil tomar como referencia una de las pruebas científicas que más fiabilidad y prestigio han alcanzado: LA PRUEBA DE POLIMORFISMOS ADN. La purificación del DNA es importante porque permite: 1. Identificar mutaciones. 2. Ver características propias de los tipos de DNA (Polimorfismo). 3. Para clonar (Genes específicos, fragmentos de cromosomas o individuos). 4. Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno. 5. Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patogénicos. 6. Identificar resistencia microbiana. 7. Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos, imunológicos. 8. Medicina forense para la identificación de personas. 9. Para hacer tests de paternidad. El rendimiento de la prueba de ADN radica en que los miles de pares de bases que se reparten de forma secuencial y determinada para cada persona permiten seleccionar a un único individuo entre todos los de su especie si se conoce esa secuencia. No en vano para referirse a este factor individualizador se habla hoy de huella genética, pues constituye un criterio absolutamente fiable de identificación de los individuos. La importancia de la prueba de ADN en el ámbito forense reside en su potencial aplicabilidad para resolver muchos casos que serían difíciles de aclarar por los procedimientos de investigación convencionales y en la elevadísima fiabilidad de sus resultados. El potencial de la huella genética es de tal magnitud que su uso en los tribunales se ha convertido ya en moneda corriente. Son muchas las posibles aplicaciones forenses de la prueba, aunque los tipos de pericias más comunes son la investigación biológica de la paternidad, la resolución de problemas de identificación y la investigación de indicios en criminalística biológica, es decir, el análisis de muestras biológicas de interés criminal, como manchas de sangre, saliva, esperma o pelos.

4 Es Importante Diferenciar dos Conceptos Extracción: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra: Lisis de las células que contienen a los AN Inactivación de nucleasas Clarificación: separación de los AN de los restos celulares Purificación: Separación de AN: De proteínas solubles De otros AN no deseados De Lípidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgánicos

5 Purificación de ADN plasmídico Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular capaces de replicarse de forma autónoma, independientemente del cromosoma. Son muy comunes en bacterias y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las células bacterianas en un número elevado (hasta 100 copias por célula). Los plásmidos son una herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se pueden usar como vectores para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés y de así amplificarlo de forma natural dentro de la bacteria en la que el plásmido se replica (es lo que se llama clonar un fragmento de DNA). Existen muchos plásmidos disponibles para usar con este fin y la mayoría contienen al menos los siguientes elementos: Un origen de replicación autónomo para E. coli (ej. ColE1) que permite la replicación autónoma en esta bacteria. Un gen que confiere a la bacteria portadora del plásmido resistencia a algún antibiótico, generalmente ampicilina. - Un sitio de clonación múltiple en el que se encuentra dianas únicas para varias enzimas de restricción y que permite la introducción del ADN a clonar.

6 Un método que permite visualizar el ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan los fragmentos de ADN en función de su tamaño (fig 1). Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes al verse menos frenadas por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de que fluoresce cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN. La obtención de altas cantidades de ADN plasmídico puro es fundamental a la hora de analizarlo o utilizarlo como vector en aplicaciones posteriores. El avance de la ingeniería genética y de las técnicas de ADN recombinante ha supuesto un aumento del número y variedad de técnicas de purificación de ADN. En comparación con métodos tradicionales (que utilizan fenol u otros reactivos tóxicos), los nuevos métodos utilizan reactivos no peligrosos, mientras que mantienen un alto rendimiento y pureza del producto final. Figura 1: Separación de ADN en un gel de agarosa

7 Procedimiento Básico de aislamiento Los pasos básicos de aislamiento de ADN son la interrupción de la estructura celular para crear un lisado, la separación del ADN soluble de desechos celulares y otros materiales insolubles y la purificación del ADN de interés de las proteínas solubles y otros ácidos nucléicos. Históricamente, esto se hizo mediante la extracción orgánica (por ejemplo, el fenol y cloroformo), seguida por la precipitación de etanol. Para facilidad de uso, en la actualidad se ofrece una gama de productos de purificación ADN convenientemente envasados que permiten aislar el ADN en poco tiempo usando métodos mucho más seguros. La interrupción del cultivo celular se realiza por medio de sales chaotropic, detergentes o desnaturalización alcalina, y el lisado resultante se elimina por centrifugación, filtración o de compensación magnética. El ADN es purificado de la porción soluble del lisado. Cuando se usan las matrices de sílice, el ADN es eluido en un tampón acuoso como agua libre de nucleasa. El ADN purificado de alta calidad está listo para usar en una amplia variedad de aplicaciones exigentes, tales como PCR, transcripción in vitro / sistemas de traducción, transfección y reacciones de secuenciación. El EDTA es un quelante que se une al magnesio presente en el ADN purificado y puede ayudar a inhibir la actividad nucleasa de posibles contaminante. Bases para la purificación de sílice En la actualidad la mayoría de los sistemas para la purificación de ADN genómico, plásmido se basa en la purificación utilizando columnas de sílice (fig 2). Independientemente del método utilizado para crear un lisado, el ADN de interés puede ser aislado en virtud de su capacidad de unirse a la sílice en presencia de altas concentraciones de sales. Estas sales luego se retiran con una base de alcohol para lavar y el ADN eluido en una solución de bajo resistencia iónica como el agua. La unión del ADN a la sílice puede ser impulsada por la deshidratación y la formación de enlaces de

8 hidrógeno, que compiten contra la repulsión electrostática débil. Por lo tanto, una alta concentración de sal ayudará a la adsorción de ADN en la unidad de sílice, y una baja concentración permite eluir el ADN. Figura 2: Unión del ADN a una columna de sílica Purificación de DNA plasmídico La principal consideración para la purificación del plásmido es la separación de ADN del plásmido a partir del ADN y el ARN cromosómico celular de la bacteria huésped. Varios métodos han sido desarrollados para generar un lisado que no sólo elimine las proteínas y los lípidos, sino que también elimine eficazmente la contaminación de ADN cromosómico del ADN plásmido, dejándolo libre en la solución. Los métodos para la preparación de lisados enriquecidos en ADN plasmidico incluyen SDS-desnaturalización alcalina, sal-sds precipitación. El método de desnaturalización alcalina, que se utiliza en todos los sistemas de aislamiento de plásmidos, es un procedimiento popular para purificar el ADN de plásmido, debido a su versatilidad y su coherencia global. Esta técnica aprovecha las diferencias en las características de desnaturalización y renaturalización del

9 ADN plasmídico circular y los fragmentos de ADN cromosómico cromosómico. La separación de material soluble e insoluble se realiza mediante un método de compensación (por ejemplo, filtración o centrifugación). El ADN plásmido soluble está listo para ser nuevamente purificada. Hay varios métodos disponibles para purificar el ADN de plásmido de lisado. Estos incluyen: vinculación del plásmido a la sílice en presencia de altas concentraciones de sales chaotropic. precipitación diferencial de ADN plásmido con soluciones de etanol. Cromatografía de intercambio iónico en DEAE-membranas de celulosa modificada. precipitación con polietilenglicol. extracción orgánica con fenol. Los plásmidos de ADN purificado se usan en muchas aplicaciones, desde la preparación de los vectores de clonación para la generación de plantillas para la transcripción o la transcripción, así como en reacciones de traducción. La base de sílice minimiza la cantidad de sales y otras impurezas durante el aislamiento, que puedan afectar negativamente los procedimientos posteriores y el bajo rendimiento de los productos de interés. Aplicaciones tales como la clonación, el etiquetado y la secuenciación del ADN requieren con frecuencia la purificación de los fragmentos de ADN de geles de agarosa o reacciones de amplificación. La automatización es cada vez más útil para mejorar la productividad de la investigación, diagnóstico y las pruebas aplicadas. Tradicionalmente, la automatización se refiere a la utilización de equipos grandes, especializados y costosos que requieren una amplia formación para operar y mantener. Métodos de determinación del rendimiento y la pureza del ADN El rendimiento de ADN se puede calcular mediante cuatro métodos diferentes: absorbancia (densidad óptica), electroforesis en gel de agarosa, el ADN fluorescente tintes vinculante y la luciferasa pyrophosphorylation acoplado sistema

10 de cuantificación. Cada técnica se describe e incluye información sobre los accesorios necesarios (por ejemplo, equipos). Si bien todos los métodos son útiles, cada uno tiene advertencias a considerar al elegir un sistema de cuantificación. La técnica más común para determinar el rendimiento y la pureza del ADN es también el método más fácil-absorbancia. Todo lo que se necesita para la medición es un espectrofotómetro equipado con una lámpara UV, UV-cubetas transparentes (según el instrumento) y una solución de ADN purificado. Las lecturas de absorbancia se realizan a 260nm (A 260) donde el ADN absorbe la luz con más fuerza, y el número generado permite estimar la concentración de la solución. Para garantizar que los números sean útiles, el A 260 lectura debe estar entre Sin embargo, el ADN no es la única molécula que puede absorber la luz UV a 260nm. Puesto que el ARN también tiene una gran absorbencia a 260nm, y los aminoácidos aromáticos presentes en la proteína absorben a 280nm, tanto los contaminantes, si están presentes en la solución de ADN, contribuirá a la medición total, a 260nm. Además, la presencia de guanidina conducirá a mayor absorbancia 260nm. Esto significa que si el número A 260 se utiliza para el cálculo del rendimiento, la cantidad de ADN puede ser sobreestimada. Para evaluar la pureza del ADN por espectrofotometría, mida la absorbancia desde 230 nm hasta 320 nm a fin de determinar otros posibles contaminantes presentes en la solución de ADN. El método más común para calcular la pureza del ADN es mediante la determinación de la absorbancia a 260 nm dividida entre la lectura de 280 nm. El ADN de buena calidad estará en el rango de Una lectura de 1.6 no significa que el ADN no es apto para ser utilizado en cualquier aplicación, lecturas inferiores a 1.6 indican que una mayor cantidad de contaminantes están presentes. Sin embargo el mejor test de la calidad del ADN es su funcionalidad en la aplicación de interés.

11 EXTRACCIÓN DE ADN MATERIALES: * 2 tubos de ensayo grandes * 1 vaso de precipitado pequeño * 1 baño de María * 1 embudo * 2 láminas de papel filtro * 1 agitador de vidrio * 1 gradilla * 1 pipeta Pasteur con émbolo o un gotero * 1 licuadora SOLUCIONES A UTILIZAR * Material biológico fresco: hígado * Acido tricloroacético al 15% * Solución salina con NaCl al 10% * Alcohol absoluto o isopropilico frío PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: * Macerar el hígado con un poco de agua destilada. * Colocar una pequeña muestra (10 ml) en un vaso de precipitado y agregarle 10 ml de solución ácida (fijador). Mezclar con el agitador. * Filtrar la muestra a través de un papel filtro. Desechar el filtrado (sobrenadante). * Recuperar la muestra (coágulo seco) del papel, pasándola nuevamente al vaso. * Agregar 10 ml de solución salina (NaCl), mezclar. Poner en baño María durante 3 minutos sin agitación. * Filtrar decantando la fase líquida. Desechar el coágulo y recuperar el filtrado en el otro tubo de ensayo.

12 * A la muestra CALIENTE, agregar paulatina y lentamente de 1 a 2 ml de alcohol absoluto o isopropilico frío. * Observar las hebras de ADN y la interfase que se forma entre el alcohol agregado y la muestra. ACTIVIDADES 1. Para qué se realiza el macerado de la muestra biológica? 2. Cuál es la función del Acido tricloroacético? 3. Cuál es la función de las sales? 4. Cuál es la función del alcohol frío en la muestra caliente?

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