PROBLEMAS MAS FRECUENTES DURANTE LA SECUENCIACIÓN NO SE PRODUCE REACCION O ESTA DECAE POCO DESPUÉS DE COMENZAR

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1 PROBLEMAS MAS FRECUENTES DURANTE LA SECUENCIACIÓN NO SE PRODUCE REACCION O ESTA DECAE POCO DESPUÉS DE COMENZAR Las causas pueden ser las siguientes: No hay ADN o se encuentra en muy baja concentración. No hay Primer o su concentración es inferior a la requerida. El primer no se une al ADN molde. El sitio de unión del primer en el vector de clonación, se ha perdido o dañado. Al clonar pueden crearse artefactos con una delección cerca del sitio de inserción, o delecciones que eliminan el sitio de apareamiento. Si se trata de productos de PCR, puede que los amplificados no sean el producto de la amplificación con los dos primers. En algunos casos, el amplificado se genera a partir de uno de los primers por lo que sólo obtendremos reacción de secuenciación con ese primer. LA SEÑAL TIENE UNA INTENSIDAD MUY BAJA La causas pueden ser las siguientes: La calidad y la cantidad del ADN empleado en la reacción de secuencia. Composición de bases del fragmento que se desea secuenciar. Primer empleado. CROMATOGRAMAS CON MUCHO RUIDO DE FONDO La causa puede ser alguna de las que se citan a continuación: Existe un sitio secundario de unión del primer en el ADN molde, que da lugar a picos extra. Restos de Primer después de la purificación, dan lugar a secuencias superpuestas e ilegibles.

2 La inespecificidad de la PCR da lugar a muestras con más de un amplificado. El fragmento de PCR no ha sido purificado y los primers que quedan en la muestra, interfieren generando productos de expresión a partir de más de un primer. CROMATOGRAMAS CON DOS SECUENCIAS SUPERPUESTAS La obtención de cromatogramas con dos secuencias superpuestas puede ser consecuencia de: El primer tiene varias dianas dentro del ADN molde. Hay más de un ADN molde distinto en la muestra. En el caso de un producto de PCR será necesario verificar que no existen amplificaciones secundarias inespecíficas. Mientras que, en el caso de moldes clonados la purificación debe de realizarse a partir de una única colonia. En el caso de trabajemos con un ADN subclonado, es posible que durante la subclonación se haya arrastrado un fragmento de polilinker, dando lugar a que la muestra tenga dos dianas para el primer universal que hemos empleado. El producto de PCR no está purificado, o la purificación no ha eliminado totalmente los restos de primer que no se ha gastado durante la amplificación. El producto de PCR está generado por un único primer (diana del primer presente en ambos extremos). LA REACCIÓN COMIENZA DE FORMA INTENSA PERO DECAE RAPIDAMENTE Esto puede ser causado, por la presencia de algún contaminante en la muestra, tal es el caso de EDTA. Por lo que no se recomienda resuspender el ADN en TE. Otra posible causa, es que no estén equilibradas las cantidades de ADN molde y primer. LA REACCIÓN FUNCIONA NORMALMENTE PERO DECAE SUBITAMENTE El ADN está cortado o digerido a ese nivel y la reacción finaliza.

3 La secuencia de ADN, produce determinados motivos que provocan este efecto en la reacción. La causa más frecuente, es la existencia de una estructura secundaria en el ADN molde, por ejemplo la presencia de repeticiones invertidas o palíndromes, que no pueden ser recuperadas por la polimerasa. Entre las posibles soluciones a este problema se encuentran: 2a- Secuenciar la cadena complementaria. 2b- Fragmentar el molde, subclonarlo y secuenciar los fragmentos. 2c- Utilizar el Kit BigDye Terminator dgtp de Applied Biosystems, que generalmente resuelve estas estructuras. LA RESOLUCIÓN DISMINUYE ANTES DE LO ESPERADO La causa puede ser que la muestra contenga demasiados contaminantes, debido a una mala extracción, purificación, amplificación, etc. LA PARTE INICIAL DE LA SECUENCIA PRESENTA GRANDES PICOS QUE ENMASCARAN LA SECUENCIA Las causas pueden ser dos: La cantidad de ADN y de oligo no era suficiente, y no se han consumido todos los dntps. Los primers empleados forman dímeros, comportándose como moldes sobre los que se producirá la reacción de secuencia. LA SECUENCIA INICIALMENTE SE LEE DE FORMA CORRECTA PERO EN CIERTOS PUNTOS PRESENTA MEZCLAS DE PICOS. El motivo, es que el molde empleado es la mezcla de más de un clon, por lo que la secuencia del vector se lee correctamente hasta el sitio de clonaje, pero luego queda reflejada en el cromatograma una mezcla de picos.

4 LA SECUENCIA SE LEE CORRECTAMENTE HASTA UNA ZONA DE Poli A O Poli T Este hecho, se debe, a que la polimerasa se desliza sobre el ADN molde, Patina. Esto puede suceder tanto en la reacción de secuenciación, como durante la amplificación. El problema es que estos productos de deslizamiento no son aparentes cuando se visualiza el fragmento en un gel de agarosa, pero si lo son cuando se secuencia el fragmento, observándose un patrón tipo olas ilegible después de la región homopolimérica. Para solucionar este problema, se puede optar por secuenciar la cadena complementaria, o por utilizar primers específicos también llamados primers anclados que se unan al homopolímero. LA SECUENCIA EMPEORA DESPUÉS DE UNA ZONA RICA EN GT, GA U HOMOPOLÍMEROS DE G Estas zonas ricas en GT, GA u homopolímeros de G son zonas difíciles de secuenciar debido a su composición nucleotídica. Una posible solución a este problema, es secuenciar la cadena complementaria. Aunque en algunos casos el resultado mejora si se repite la secuenciación con el Kit BigDye Terminator dgtp de Applied Biosystems. REGIONES RICAS EN GC El contenido de G y C varía entre un 25% y 75% en todos los organismos. Concretamente en el genoma de mamífero, las variaciones oscilan entre un 45% y un 50%. Existen zonas por tanto, especialmente ricas en G y C. Las zonas que presentan un porcentaje superior al 62 % resultan difíciles de secuenciar. Para mejorar los resultados en este caso se recomienda añadir a la reacción estándar un 5% de DMSO. Otras modificaciones posibles serían: Añadir a la reacción de PCR entre un 5% y un 10 % de formamida, o entre un 5% y un 10 % de glicerol. Aumentar la temperatura de desnaturalización a 98 ºC.

5 Aumentar el número de ciclo de PCR de 25 a 30 ciclos. Linearizar el ADN con un enzima de restricción ZONAS RICAS EN AT Su secuenciación, no resulta tan problemática como en el caso de secuencias ricas en GC. En el caso de que el primer presente zonas ricas en AT, lo más recomendable, es aumentar su longitud o trabajar con primers marcados, en vez de con terminadores marcados. REGIONES CON ESTRUCTURA SECUNDARIA Los moldes con estructuras secundarias, del tipo de, repeticiones invertidas o palíndromes pueden resultar problemáticos a la hora de la secuenciación. Observándose en el cromatográma, una reducción rápida de la intensidad de la señal, lo que nos indica que la enzima no ha sido capaz de continuar más allá de ese punto. Este tipo de problema aumenta cuando además en el ADN molde, hay zonas ricas en G y C. En cuyo caso, podrán aplicarse, algunas de las modificaciones descritas para las zonas ricas en GC. REGIONES DE LARGAS REPETICIONES Las repeticiones en el ADN, pueden oscilar desde 2 ó 3 bases hasta cientos de ellas, aunque en general las repeticiones cortas no suelen dar problemas. En el caso de repeticiones largar ricas en GCs se pueden aplicar algunas de las sugerencias ya indicadas en apartados anteriores. Otra posibilidad, es obtener delecciones seriadas de esa zona y secuenciarlas. ZONAS DE HOMOPOLÍMEROS LARGOS Cuando una base se repite más de 10 veces en un región de ADN, se pueden producir problemas a la hora de secuenciar esa región, y cuando las bases repetidas son G o C todavía se toleran menos repeticiones. Para las zonas ricas en polia o polit, se pueden utilizar las estrategias de primers anclados descritas ya en otro apartado.

6 Para los homopolímeros de polig o polic, se recomienda que el primer utilizado hibride a 20 o 30 bases del homopolímero, para forzar a la polimerasa a pasar sobre él. Otra posibilidad es realizar delecciones seriadas y secuenciarlas.

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