Información de la OMS para diagnóstico de laboratorio del nuevo virus de la Influenza A (H1N1) en seres humanos

Transcripción

1 Información de la OMS para diagnóstico de laboratorio del nuevo virus de la Influenza A (H1N1) en seres humanos SeenfatizalarecomendaciónquetodaslasmuestrasdeinfluenzatipoAnosubtificables seanenviadasdeinmediatoparaeldiagnósticoylacaracterizaciónadicionalaunode loscincocentroscolaboradoresdelaomsparalagripe. 21demayodel2009 Estedocumentopresentainformaciónsobrelosmediosdediagnósticodisponiblesala fechaindicadaparaelvirusdelainfluenzatipoahumana(h1n1)a/california/4/2009y virussimilares.lainformaciónsobreeldiagnósticoseactualizarácuándoéstase encuentredisponible. Muestras Lasmuestrasmásapropiadassegúnlorecomendadoporlasinvestigacionesdela influenzaestacionalsonaquellasdeltractorespiratoriosuperior.lasmuestrasdeben tomarsedelosorificiosnasalesprofundos(hisoponasal),nasofaringe(hisopo nasofaríngeo),aspiradonasofaríngeo,gargantaoaspiradobronquial.todavíanose sabequémuestraclínicaproporcionaelmejorrendimientoeneldiagnóstico.la(s) persona(s)quetome(n)lamuestradebe(n)cumplirconlasprecaucionesapropiadasde tomademuestrasyaquepuede(n)exponerseasecrecionesrespiratoriasdelos pacientes.hastaahora,noexisteningunainformaciónsobreelvalordediagnósticode lasmuestrasnorespiratorias,porejemplo,muestrasdeheces.muestrasdesuero agudoyconvalecientedebenusarseparaladeteccióndelostítulosascendentesde anticuerpo. Pruebas de laboratorio Diagnostico molecular Losmediosdediagnosticomolecularsonactualmenteelmétodopreferidoparala influenzaa(h1n1)linajeporcino(swl)virus(a/california/4/2009yvirussimilares). Elusodeensayoscondiferentesgenesblancosesmásapropiadoparalaidentificación deestevirus.lossiguientesgenesblancossonimportantes:genmatrizdelainfluenza detipoa;elgendelahemaglutininaespecíficodelvirusdelainfluenzaa(h1n1)swlyel gendelahemaglutininaespecíficodelainfluenzaestacionalah1/h3yotrossubtipos.

2 Lossiguientesprotocolosestánactualmentedisponibles: PCRconvencionalespecíficoparainfluenzatipoAyRT PCRentiemporeal(véase anexos1y2); RT PCRentiemporealdelosCDC(rRT PCR)paraladetecciónycaracterizacióndela influenzatipoa(h1n1)(versión2009) 1 ElanálisissecuencialdelproductodelPCRdelgenmatrizdelainfluenzatipoAusando loscebadoresdelosprotocolosdelaoms(véaseanexo1)diferenciaráentregenesm delinajeporcinoyvirush1n1estacionales.sinembargo,unanálisisadicionaldebeser realizadoparaconfirmarelorigendelvirus. Enestemomento,laspruebasdeRT PCRconvencionalestánsiendoevaluadas.Una actualizaciónsepublicarácuandoestedisponible. Aislamiento y tipificación del virus mediante la inhibición de hemaglutinina o la inmunofluorescencia: Sepuedenutilizarlosprotocolosvigentesparaelaislamientodevirusdelainfluenza estacionalusandocélulasdemdckeinoculación devirusenhuevosembrionados, aunquesusensibilidadestáaúnpendientededeterminarse(véasesecciónde bioseguridadabajo). Loseritrocitosdepavos,pollos,conejillosdeindiasyhumanosseaglutinaránconel virusdelainfluenzaa(h1n1)swl.losanticuerpospoliclonalesespecíficosparael subtipoh1delosvirusdelainfluenzaestacionaldelkitdelaomsnoreaccionaráncon lapruebadeinhibicióndehemaglutinación(hai)delvirusactualdelainfluenzaa (H1N1).LosresultadosobtenidosutilizandolosanticuerposmonoclonalesH1delkitde laomsnodebetomarsecomocomprobaciónconcluyenteyserecomiendarealizaruna verificaciónadicional. Pruebas de inmunofluorescencia rápida: Lasensibilidadyespecificidaddelaspruebasdeinmunofluorescenciarápidaenellugar deatención,diseñadasparaladeteccióndirectadelosvirusdelainfluenzatipoason actualmentedesconocidas.unaactualizaciónsepublicarácuándoexistaevidencia disponible.deberecalcarsequeestaspruebasnodiferenciaránlainfluenzaestacional deladelvirusdeinfluenzadetipoa(h1n1)swl. 1

3 Serología SeesperaquelaspruebasdeHAIylasreaccionesdemicro neutralizaciónempleandoel virusdelainfluenzaa(h1n1)swlpuedandetectarrespuestasdeanticuerposdespués delainfección. Interpretación de los resultados de laboratorio PCR:Unamuestraseconsiderapositivasilosresultadosdelaspruebasusando dosdiferentesblancosdepcr(porejemplo,iniciadoresespecíficosparagenmy genporcinodehemaglutininah1)sonpositivosperoelpcrparavirushumano H1+H3esnegativo.SielPCRentiemporeal(RT PCR)parahemaglutinina múltiple(ha)(esdecir,h1,h3yh1delinajeporcino)daresultadospositivosen lamismamuestra,laposibilidaddecontaminacióndepcrdebeser primeramenteexcluidaalrepetirelprocedimientodepcrusandoarnnuevo extraídodelamuestraoriginaloarnextraídodeotramuestra.siserepitenlos resultadospositivosparalosblancosmúltiplesdeha,existeentoncesla posibilidaddecoinfección,quedebeconfirmarsemediantesecuenciacióno cultivoviral.elanexo3muestraundiagramadeflujoparafacilitarla interpretacióndelosresultadosdepcr. RT PCR en tiempo real de los CDC:Losresultadosdebeninterpretarsesegúnlo descritoenelmanualdepruebasdeh1n1entiemporealdeloscdc. 1 Un resultado de PCR negativo no permite descartar que la persona pueda estar infectada por el virus de la influenza A (H1N1):Losresultadosdeben interpretarseconjuntamenteconlainformaciónclínicayepidemiológica disponible.lasmuestrasdelospacientescuyosresultadosdepcrson negativosperoparaquieneshayunaaltasospechadeinfecciónconh1n1deben investigarsemásafondoyseranalizadasporotrosmétodoscomoelcultivoo serologíaviral,paradescartarinfecciónporinfluenzaa(h1n1)swl(véase diagramadeflujoenanexo3). Serología:Unincrementocuádrupleenlosanticuerposneutralizantes específicosdelvirusdelainfluenzaa(h1n1)indicainfecciónrecienteconel virus. Secuenciación:enestaetapa,lasecuenciacióndealmenosunodelosblancos esesencialparalaconfirmaciónporpcrconvencional. Aislamiento del virus:laidentificaciónytipificacióndelcultivodevirusde influenzapuedelevarseacaboporpcr,porlatécnicadelanticuerpo fluorescenteindirecto(ifa),lapruebausandoanticuerposmonoclonales

4 específicosdenp,oelanálisisdehayelanálisisantigénico(subtipificación)por HAIusandoantisuerosdereferenciaseleccionados. Referencia para la confirmación y caracterización adicionales: Aloslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddediagnósticodelvirusdelainfluenza Aselesrecomiendaenviarlasmuestrasrepresentativasdeloscasossospechososde influenzaa(h1n1),deacuerdoaladefinicióndecasodelaoms 2,aunodelosCentros ColaboradoresdelaOMSparainfluenza(WHOCCs). LasmuestrasconresultadosdelaboratoriopositivasparainfluenzaAperono subtipificables(esdecir,negativasparainfluenzaa(h1)ya(h3));seconsiderancomono confirmadasdeacuerdoaloscriteriosdelaoms)debenremitirseaunodeloswhoccs paralaconfirmación. Loslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddeaislamientodelvirus(oqueno tenganelnivelnecesariodemedidasdebioseguridad)debenremitirlasmuestrasa cualquieradeloswhoccs. EnadiciónalosreglamentospertinentesdeIATA,sedebenseguirlasnormasordinarias dealmacenamiento,envasadoyenvíodemuestrasdeinfluenza. Bioseguridad Eltrabajodelaboratorioconmuestrasclínicasdepacientesconsideradoscomocasos sospechososdeinfecciónporvirusdeinfluenzaa(h1n1)swlsedebenrealizar aplicandolasnormasyprocedimientosdeniveldebioseguridad2utilizandoelequipo deprotecciónpersonalapropiado(ppe).todamanipulacióndemuestrasdebehacerse dentrodeunacabinadebioseguridadcertificada(bsc).vermanualdebioseguridaden ellaboratoriodelaoms,3.ªed. 3 Actualmente,elaislamientoviralrequieremayoresmedidasdebioseguridad.Paralas recomendacionesespecíficasver:gestióndelosriesgosbiológicosenloslaboratorios dondesemanipulanmuestrashumanasquecontienenopuedencontenerelvirusdela gripea(h1n1)queestácausandolasactualesepidemiasinternacionales

5 Prueba de los algoritmos ElmétodogeneraldeladeteccióndevirusdelainfluenzaporPCR RTdebeconsiderarse enelcontextodelasituaciónnacional,porejemplo,cuántasmuestraspueden procesarse(producto),elblancoutilizadoparalasecuenciadelgenporpcr RT,ysise utilizalacomprobaciónconcurrenteosecuencialdem,npygenesdehaporpcr RT. Buenas prácticas de laboratorio Losprotocolosestándarparatodoslosprocedimientosdebenexistiryserrevisados regularmente.esfundamentalasegurarsequelosreactivosrecomendadosseuseny manejenadecuadamenteyaquelasreaccionessoncomplejasyproblemasinclusosólo conunreactivopuedentenerefectossignificativossobrelosresultadosobtenidos. Validación Todoslosprotocolosdebenservalidadosencadaunodeloslaboratoriosparaevaluar quesuespecificidadysensibilidadalusarlosmismoscontrolesencadarondasean adecuadas. Aseguramiento de la calidad Losprotocolosdeaseguramientodelacalidadybuenasprácticasdelaboratoriodeben existir.laparticipaciónenlosejerciciosdeevaluacióndeloscentrosnacionalesde Influenza(Proyectodeevaluaciónexternadelacalidad)esaltamenterecomendada paraconfirmarqueloslaboratoriosestánalcanzandounniveladecuadodesensibilidad yespecificidadensuspruebas. Capacitación del personal Lafamiliaridaddelpersonalconlosprotocolosyexperienciaenlainterpretación correctadelosresultadossonpiedrasangularesparalaejecuciónexitosadelaspruebas diagnósticas. Instalaciones y áreas de manejo Debenexistirinstalacionesadecuadasparaelmanejodemuestrasyreactivos (incluyendocadenasdefrío)conunaseparaciónapropiadaparalasdiferentesetapasde RT PCRafindeprevenirlacontaminacióncruzada.Lasinstalacionesyelequipodeben cumplirconelniveldebioseguridadapropiado.elrt PCRdeberealizarseenunespacio separadodelusadoparalastécnicasdeaislamientodevirus.

6 Equipo Elequipodeequipodebeusarseymantenersedeacuerdoalasrecomendacionesdel fabricante. Anexo 1: Análisis de RT PCR convencional del gen matriz de los virus de Influenza de tipo A Protocolo Convencional de RT PCR 5 Acontinuaciónsepresentanlosprotocolosycebadores(oprimers)dePCR convencionalyelectroforesisengeldeproductosparadetectarvirusdeinfluenzatipoa enmuestrasdesereshumanos.estosprotocoloshandemostradoserampliamente efectivosparalaidentificacióndelvirusdeinfluenzadetipoacuandoselesutilizacon losreactivosycebadoresindicados.serecomiendaqueloslaboratoriosquetengan dudassobrelaidentificacióndelosvirusactualmentecirculantescontactaraunodelos LaboratoriosdeReferenciaH5delaOMS 6 oaunodewhoccsparalainfluenza 7 afin derecibirayudaparalaidentificacióndeloscebadoresóptimosparasuuso Materiales requeridos QIAamp ViralRNAMiniKit(QIAGEN,Cat#52904.Otroskitsdeextracciónpueden serusadosdespuésdehabersidosujetosaunaevaluaciónapropiada). OneStepRT PCRKit(QIAGEN,,Cat#210212) InhibidordeRNase20U/μl(AppliedBiosystems,Cat#N ) Aguadestilada(libredeRNase) Ethanol(96 100%) Microcentrífuga(ajustablehasta13000rpm) Pipetasajustables(10,20,200,and100μl) Puntasparapipetaestériles(libresdeRNase)conbarreradeaerosol Vortex Tubosparamicrocentrífuga(0.2,1.5ml) Termociclador(equipodePCR) Conjuntodecebadores Controlpositivo(estepuedesolicitarsealWHOCCenlosCDCdeAtlanta,EEUU) 5 Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China (WHO H5 Reference Laboratory)

7 Cebadores Gen:M VirusInfluenzaA Secuenciasdecebadores M30F2/08: 5` ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG 3` M264R3/08: 5` TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG 3` Tamañoesperadodelproducto244bp(referencia:NIID 8 ) Procedimiento 1. ExtraerARNviraldelamuestraclínicaconelMiniKitQIAampViralRNAokitde extracciónequivalente,deacuerdoalasinstruccionesdelfabricante. 2. RealiceelRT PCRdeunaetapa. Sacarlosreactivosdesualmacén,déjelosdescongelaratemperatura ambiente.unavezdescongelados,manténgalosenhielo. Prepararlamezclamaestra(operadaenhielo) Agregarlosiguienteauntuboparacentrífugaymezclarlobien agitándoloparaarribayparabajo10veces,(nota:afindeevitar diferenciaslocalizadasenlaconcentracióndesales,esmuyimportante mezclarlassolucionesantesdesuuso). Reacción sin solución Q Aguadestilada(sinRNasa)9.5μl Amortiguador5xQIAGENRT PCR5.0μl MezcladedNTP1.0μl Cebadorsentido(+)(10μM)1.5μl Cebadorantisentido( )(10μM)1.5μl Mezclaenzimática1.0μl InhibidordelaRNasa(20U/μl)0.5μl Volumentotal20.0μl/prueba Distribuir20μldelamezclamaestraencadatubodereaccióndePCR.Añadir5μlde RNAdelamuestraalamezclamaestra.Paralasreaccionesdecontrol,usar5 μlde aguadestiladalibredernaseparacontrolnegativoy5μldelosrnaviralesadecuados paracontrolpositivo.programareltermocicladordeacuerdoalascondicionesde termociclado.iniciarelprogramadert PCRmientraslostubosdePCRseencuentren aúnenelhielo.esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzadolos50 C.Luego colocarlostubosdepcreneltermociclador. 8 Primers designed by Laboratory at National Institute of Infectious Diseases (NIID), Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza)

8 Condiciones de ciclado de la temperatura para PCR Transcripcióninversa30min,50 C ActivacióndelaPCRinicial15min,95 C Cicladoentresetapas Desnaturalización30seg,94 C Templado30seg,50 C Extensión1min,72 C Númerodeciclos45 Extensiónfinal10min,72 C Mantener4 C 3. Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT PCR Prepararelgeldeagarosa,cargarlosproductosdePCRyelmarcadordepeso molecular,ejecutardeacuerdoconlosprotocolosestándar.visualizarlapresenciadel marcadorconluzultravioleta. Materiales requeridos Bandejaparageldeagarosaycámaradeelectroforesis Suministroeléctricoyelectrodos CajadeluzUV(302nm) CámaraypelículaPolaroidocomputadoraconectadaalacámara Pipetasajustables Geldeagarosaal2%en1 TAE Amortiguador1 TAE Bromurodeetidio(10mg/ml) 6xSoluciónamortiguadoraconcargadegel(GLB) Procedimiento A)Fundirungeldeagarosa: I. Colocarunabandejaparafundicióndelgeldentrodeunabaseparafundiciónde gel.inserteunpeineynivelelabase. II. Prepararagarosaal2%pesando4gdepolvodeagarosaydisuélvalaen200ml1 amortiguadortae.disuelvaelagarcalentándoloenhornodemicroondas. III. Enfriarelagarderretidohastaaproximadamente60 C,yluegoagregue10μlde bromurodeetidio. IV. Verterlaagarosaderretidaenunabandejaparafundicióndegel. V. Dejarqueelgelsesolidifiqueatemperaturaambiente. VI. Retirarelpeinedelmarco.

9 VII. Colocarlabandejadentrodelacámaradeelectroforesisconlasfosasdelladode loscátodos. VIII. Llenarlacámaraamortiguadoracon1 TAEaunnivelquepuedacubrirlaparte superiordelgel. B)Cargadelasmuestras: I. Agregar5μldeGLBdePCR. II. Cargarelmarcadordepesomolecularenlafosadelgeldeagarosa. III. Pipetear15μldelproductodePCR/GLBenelgel. IV. Cerrarlatapadelacámarayconecteloselectrodos.Correrelgela100Vdurante 30 35min. V. VisualizarlapresenciadebandasdemarcadoresyproductosdePCRconluzUV. VI. Documentarlaimagendelgelconunafotografía. Interpretación de los resultados EltamañodelosproductosdePCRobtenidosdebecompararseconeltamañoesperado delosproductos.silapruebaseejecutasinuncontrolpositivo,losproductosdebenser confirmadosmediantesecuenciaciónycomparaciónconlassecuenciasdisponibles. Anexo 2: Análisis de RT PCR en tiempo real de la matriz de los virus de Influenza de tipo A LaRTPCRentiemporealpresentadiferentesdesafíosencomparaciónconlaRT PCR convencional.ademásdelasconsideracionessobrert PCRdescritasenelAnexo1,las consideracionesespecíficasparart PCRentiemporealincluyen: Garantizarqueseusenymanipulencorrectamentelosequipos,elsoftwareylos reactivosparafluorescenciaadecuados. Garantizarlacapacitaciónadecuadadelpersonalparalainterpretacióndelos resultados(esesenciallaexperienciaparareconocerlosverdaderospositivos, interpretacióndeloscontroles/valorctyfluorescenciaaberrante,etc.). Parahacerdeterminacionescuantitativas,esesenciallavalidaciónenellaboratorio ylaoptimizacióndelasreacciones. Haypocaprobabilidaddecontaminacióncuandosedescartanlasreacciones despuésderealizarlaspruebas.sinembargo,muchoslaboratorioshacenanálisis postreacciónadicionales(porej.,polimorfismodelongituddefragmentosde restricciónusandogeles,secuenciación)quepuedenreintroducirlacontaminación.

10 Protocolo de RT PCR en tiempo real 9 ExtraerelARNviraldelespécimenclínicosegúnsedescribeenelAnexo1:Análisisde RT PCRconvencional Materiales requeridos TranscripciónInversa AmortiguadorI10XPCRcon15mMMgCl(AppliedBiosystems) Hexámeroaleatorio50μM(AppliedBiosystems) TranscriptasaInversadeMuLV50U/μl(AppliedBiosystems) InhibidordelaRNasa20U/μl(AppliedBiosystems) PCRentiemporeal KitLightCycler FastStart DNAMasterHybProbes(Roche) Cebadoresymezcladesondas:Agregarigualvolumendelossiguientescomponentes paraprepararloscebadoresylamezcladesondasparah5ygenm Cebadoresysondas VirusdeinfluenzatipoA Secuenciadecebadores FLUAM 1F:5' AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA 3'(10μmol/l) FLUAM 2F:5' CATTGGGATCTTGCACTTGATATT 3'(10μmol/l) FLUAM 1R:5' CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC 3'(10μmol/l) FLUAM 2R:5' AAACCGTATTTAAGGCGACGATAA 3'(10μmol/l) FLUA 1P:5' (FAM) TTTGTGTTCACGCTCACCGT (TAMRA) 3'(5μmol/l) FLUA 2P:5' (FAM) TGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCA (TAMRA) 3'(5μmol/l) Elcebadoractivoylamezcladesondassepreparamezclandolos6reactivosen volúmenesiguales. 9 Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China, WHO H5 Reference Laboratory

11 Procedimiento 1.RealizarRTutilizandolosreactivosquesemuestranenlasiguientetablaylas instrucciones1 3alcalcedelatabla. Reactivo Volumen(μl)porreacción Amortiguador10xPCRIcon15mmol/lMgCl 2 2 Extra25mmol/lMgCl mmol/ldNTPs 8 Hemámeroaleatorio50μM 1 InhibidordelaARNasa20U/μl 1 TranscriptasaInversa50U/μl 1 ARNextraído 4.2 I. AgitarenVortexycentrifugareltuboconlamezclabrevemente(aprox.3seg.) II. Mantenereltuboatemperaturaambientedurante10minutosyluegoincubara 42 Cporlomenosdurante15minutos III. Incubareltuboa95 Cdurante5minutosyluegoenfriarenhielo. 2.RealizarPCRentiemporeal I. Prepararlamezcladereacción HotStart pipeteandosuavemente60μlde SondasdeHibridaciónparaMezcladeReacciónLC FastStart (frascoampolla 1b)enelLC EnzimaFastStart (frascoampolla1a). II. Paracadamuestradepruebaycontrolespositivosynegativos,prepararla mezcladelreactivoconcebadoresymezcladesondasdeacuerdoconlo siguiente Mezclamaestra: Reactivo Volumen(μl) H 2 OgradoPCR 7.6 MgCl 2 (25mmol/l) 2.4 Cebadoresymezclaparasondas 3 Mezclaparareacción HotStart 2 Volumentotal 15 Cadareacción: Mezclamaestra 15 ADNc: 5

12 CondicionesdecicladodelatemperaturadePCR Temperatura( C) Tiempo No.deciclos (minuto:segundo) 95 10: : :15 } : :30 1 Protocolo de RT PCR en tiempo real 10 ExtraerelARNviraldelespécimenclínicocomosedescribeenAnálisisdeRT PCR convencional Materiales requeridos QIAGEN QuantiTect,EquipodeSondaparaRT PCR(#204443): o 2xQuantiTect,MezclaMaestradeSondadeRT PCR o QuantiTect,MezclaRT o AguasinRNasa InhibidordelaARNasa Cebadores SondaTaqMan MGB Equipo:SistemadeDeteccióndePCRentiemporealChromo 4 (BioRad); LingtCycler2(Roche)oLingtCycler480(Roche) PCRentiemporeal LaPCRentiemporealserealizamedianteRT PCRdeunsolopasousandounasonda TaqMan Cebadoresysondas: Gen:TipoA(M) Secuenciasdecebadores MP 39 67For 5' CCMAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATC 3'(10μmol/l) MP Rev 5' TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA 3'(10μmol/l) 10 Protocol provided by National Institute of Infectious Diseases (NIID), Center for Influenza Virus Research, Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza).

13 Secuenciadesondas MP 96 75ProbeAs 5'(FAM) ATYTCGGCTTTGAGGGGGCCTG (MGB) 3'(5pmol/μl) MezcladeReacción Reactivo Volumen(μl) MezclaMaestraparaSondadeRT PCR2xQuantiTect 12.5 CebadorDirecto(10μM) 1.5 CebadorInverso(10μM) 1.5 SondaTaqMan MGB(5pmol/μl) 0.5 MezclaQuantiTect 0.25 AguasinRNasa 3.75 Total 20 Procedimiento 1) Distribuir20μldelamezcladereacciónencadaplacadereacciónparaRT PCR. 2) Agregar5μlARNdemuestraalamezcladereacción.Parareaccionesde control,usar5μldeaguadestiladaparacontrolnegativo,y5μldearnvirales positivosadecuadosparacontrolpositivo. 3) Programareltermocicladordeacuerdoconelprogramaquesedescribea continuación. 4) IniciarelprogramadeRT PCRentiemporealmientrasquelasplacasde reacciónparart PCRtodavíaestánenhielo. 5) Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzado50C.Luego,colocarlas placasdereacciónparart PCReneltermociclador. CondicionesdecicladodetemperaturadeRT PCR:SistemadedeteccióndePCR Chromo 4 Real time(biorad) Temperatura( C) Tiempo No.deciclos (minuto:segundo) 50 30: : :15 } :00

14 CondicionesdecicladodetemperaturadeRT PCR:LingtCycler2(Roche)oLingtCycler 480(Roche) Temperatura( C) Tiempo No.deciclos (minuto:segundo) 50 30: : :15 (ramprate1.2 o C/seg) } :00 (ramprate1.2 o C/seg) Recopilacióndedatos Anexo 3: Algoritmo de prueba por PCR e interpretación de resultados