DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VPPA MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) CONVENCIONAL REV OBJETO.

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1 Página 1 de 7 CONTENIDO CENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA) Laboratorio de Referencia de la UE de PPA (EURL-ASF) Centro de Investigación en Sanidad Animal CISA-INIA, Valdeolmos 28130, Madrid, Spain. Contacto Dr. Carmina Gallardo Virginia Pelayo 1. OBJETO. 2. ALCANCE. 3. REFERENCIAS DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE. 4. GENERALIDADES. 5. REALIZACIÓN MATERIALES Y REACTIVOS PREPARACIÓN. PROCEDIMENTO NORMALIZADO DE TRABAJO (PNT): DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) CONVENCIONAL 5.3. MÉTODOS ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS. 5.5 PUNTOS CRÍTICOS 5.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD.

2 Página 2 de 7 1. OBJETO. El objeto del presente procedimiento es describir el método a seguir para la detección específica de ADN del virus de la peste porcina africana (VPPA) en material clínico mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Técnica de referencia de la OIE (Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres: Peste Porcina Africana, OIE, capítulo 2.8.1) para la detección del genoma viral de la PPA. 2. ALCANCE. Este procedimiento es de aplicación al ácido nucleico extraído siguiendo el procedimiento descrito en el PNT/CISA/PPA/EXTRACCIÓN ADN/1 - Extracción del ADN del virus de la peste porcina africana para su detección mediante reacción en cadena de la polimerasa -PCR- - en los siguientes tipos de muestra de origen porcino y en homogeneizados de garrapatas del género Ornithodoros REFERENCIAS DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN. 1. AFRICAN SWINE FEVER. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). CHAPTER OIE, 2012 [ 2. Agüero M, Fernández J, Romero LJ, Zamora MJ, Sánchez C, Belák S, Arias M, Sánchez-Vizcaíno JM. A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever in clinical samples. Vet Res Sep-Oct;35(5): M. Agüero, J. Fernández, L. Romero, C. Sánchez, M. Arias, J.M. Sánchez-Vizcaíno Highly Sensitive PCR Assay for Routine Diagnosis of African swine fever virus in Clinical Samples. J. Clin. Microbiol., vol. 41, no. 9, p PPA REVISIONES: 1. Arias, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2012). African swine fever. In: Zimmerman, J., Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J, Stevenson, G.W. (Eds), Diseases of swine, 10th Edition. John Wiley and Sons, United States of America, pp Arias, M.; Sánchez, C.; González, M.A.; Carrasco, L. y Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2002). Peste porcina Africana In Curso digital de enfermedades infecciosas porcinas. On line, July, [ 3. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). RECOGNIZING AFRICAN SWINE FEVER. A FIELD MANUAL Edition. [ 4. Oura CA, Edwards L, Batten CA. Virological diagnosis of African swine fever- Comparative study of available tests. Virus Res Nov 3. doi:pii: S (12)00411-X /j.viruses [Epub ahead of print] 3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA PESTE PORCINA AFRICANA (PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1). EXTRACCIÓN DEL ADN DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA PARA SU DETECCIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) (PNT/CISA/PPA/DNA EXTRACCIÓN/1) 4. GENERALIDADES ABREVIATURAS. ADN: ácido desoxirribonucleico. E+: Control positivo de extracción. E-: Control negativo de extracción. R+: Control positivo de reacción. R-: Control negativo de reacción. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. PPA: Peste porcina africana. VPPA: Virus de la peste porcina africana.

3 Página 3 de PRINCIPIO. La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la detección específica del ADN del VPPA mediante la amplificación enzimática de un pequeño fragmento del genoma viral delimitado por una pareja de primers o cebadores específicos. Requiere de la extracción previa del ADN del VPPA desde el material de origen a analizar, que será el molde de la reacción enzimática. Finalmente, el producto amplificado será detectado mediante electroforesis en geles de agarosa, tinción con bromuro de etidio (intercalante de ADN de doble cadena) y posterior visualización por irradiación con luz UV. Mediante la técnica de PCR se pueden analizar distintos tipos de muestras, como sobrenadantes de cultivo celular, sangre recogida en EDTA, suero y homogeneizados de garrapatas tejidos. Es particularmente útil para la detección del ADN del VPPA en muestras de tejido porcino en mal estado de conservación que no son adecuadas para técnicas de aislamiento viral o detección de antígeno, o cuando el virus ha podido ser inactivado antes de la llegada de las muestras al laboratorio. El método descrito en este procedimiento emplea una pareja de primers diseñada en una región altamente conservada del genoma viral dentro de la proteína Vp72, que asegura la detección de aislados del VPPA de los 22 genotipos hasta el momento descritos. Los primers amplifican un fragmento de ADN de 257 pares de bases (pb), entre las posiciones de nucleótidos y de la cepa de referencia española BA71V (nº de acceso a GenBank ASU18466). La PCR es una técnica rápida, que puede completarse en pocas horas, y de elevada sensibilidad, permitiendo detectar la presencia de virus incluso antes de la aparición de los primeros signos clínicos en los animales infectados. Es altamente sensible, siendo su límite de detección inferior a una partícula viral infectiva. Es la técnica de elección en casos hiperagudos, agudos y subagudos de la PPA. Los cerdos recuperados de infecciones agudas o crónicas, generalmente exhiben una viremia durante varias semanas, haciendo de la PCR también una herramienta muy útil para la detección del VPPA en cerdos infectados con cepas de virulencia baja o moderada. 5. REALIZACIÓN MATERIALES Y REACTIVOS. MATERIAL Cámara fotográfica o videocámara con impresora. Congelador de <-10ºC. Congelador -70ºC. Cubeta para geles de agarosa horizontales y accesorios (bandejas, peines, conectores). Fuente de alimentación. Gradillas (racks) refrigerantes para tubos de mini centrífuga de 1,5 y tubos de reacciones de PCR 0,2 ml de 96 pocillos. Guantes de látex o de nitrilo. Micropipetas automáticas monocanal de 1-10 µl. Micropipetas automáticas monocanal de 2-20 µl. Micropipetas automáticas monocanal de µl. Micropipetas automáticas monocanal de µl. Nevera de 4±3ºC. Termociclador para PCR convencional. Transiluminador de luz ultravioleta. Puntas de micropipeta de rangos y µl, estériles. Puntas de micropipeta con filtros resistentes a aerosoles de rangos 1-10, 2-20, y µl, estériles. Tubos tipo eppendorf estériles, aptos para micro centrífuga, de volúmenes 0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml y 2 ml. REACTIVOS A) REACTIVOS NECESARIOS PARA LA AMPLIFICACIÓN: AmpliTaq Gold DNA polimerasa con buffer II y Cl 2 Mg [Ref.: N (Roche) o características similares]. Conservar <-10ºC.

4 Página 4 de 7 Primers del VPPA concentración 20 pmol/μl. Conservar <-10ºC en alícuotas. Fecha de caducidad: 1 año. o primer PPA-1 5 -AGTTATGGGAAACCCGACCC-3 (sentido); o primer PPA CCCTGAATCGGAGCATCCT-3 (antisentido). Deoxinucleótidos trifosfato (dntp) mezcla, conteniendo 10 mm de cada dntp [Ref (ROCHE) o de características similares]. Conservar a <-10ºC. H 2 O estéril libre de nucleasas, grado PCR. Controles de referencia: los siguientes controles deben incluirse en cada proceso de amplificación. o o o E+: Control positivo de extracción obtenido durante el proceso de extracción del ADN del VPPA. Conservar a <-10ºC. Fecha de caducidad: 6 meses. E-: Control negativo de extracción obtenido durante el proceso de extracción del ADN del VPPA. R+: Control positivo de reacción. ADN obtenido de muestra positiva de PPA. Se recomienda preparar un control positivo en el límite de detección de la técnica Conservar a <-10ºC. Conservar a <-10ºC. Fecha de caducidad: 6 meses. o R-: Control negativo de reacción: agua destilada incluida en el paso de la amplificación para descartar contaminaciones. B) REACTIVOS PARA EL PROCESO DE DETECCIÓN DEL ADN AMPLIFICADO: Agarosa MP 100 [Ref (Roche) o de características similares]. Conservar a Tª ambiente. Azul de bromofenol [Ref.: (Merck) o de características similares]. Conservar a Tª ambiente. Bromuro de etidio mg/ml [Ref.: E406 (Amresco) o de características similares]. Conservar a Tª ambiente. Glicerol 87% [Ref (MERCK) o de características similares]. Conservar a Tª ambiente. Marcador peso molecular VI de ADN [Ref.: (Roche) o de características similares]. Conservar a <-10ºC. TAE buffer 50x (Tris base, ácido acético y EDTA) [Ref.: A (AppliChem o de características similares]. Conservar a Tª ambiente. Xileno cianol [Ref.: X4126 (Sigma) o de características similares]. Conservar a Tª ambiente PREPARACIÓN PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS. Solución de agarosa 2% Disolver 2gr (±0,1gr) de agarosa MP en 100 ml de TAE 1x y calentar en microondas hasta que la agarosa esté totalmente disuelta. Tampón de carga 6x [azul de bromofenol 0.25%, xileno cianol 0.25%, glicerol 30%] Disolver 0,1gr (±0,01gr) de azul de bromofenol + 0,1 gr (± 0,01gr) xileno cianol en 17,24 ml de glicerol. Ajustar con agua destilada has un volumen final de 50ml. Conservar a <-10ºC en alícuotas. Fecha de caducidad: 1 año. Tampón de electroforesis 1x Diluir 40 ml de TAE (50x) en ml de agua destilada. Conservar a Tª ambiente. Fecha de caducidad: 2 meses. Marcador peso molecular VI de ADN 200 µl de Marcador VI µl de tampón de carga 6x µl de tampón de electroforesis 1x. Conservar a 4±3ºC. Fecha de caducidad: 6 meses MÉTODOS PROCESO DE AMPLIFICACIÓN (PCR): Preparación de la mezcla de reacción: En un tubo de micro-centrífuga de 1,5 ml estéril, se preparará la mezcla de PCR, según se describe a continuación, para el número total de muestras a analizar (incluyendo los controles positivos y negativos de extracción y reacción) más, al menos, una muestra adicional (para compensar posibles errores de pipeteo).

5 Página 5 de 7 REACTIVOS DE LA MEZCLA DE REACCIÓN 1x VOLUMEN (reaccción 25µl) CONCENTRACIÓN FINAL 1 H 2 O 17,375µl 2 PCR Buffer 10X 2,5µl 1X 3 Cl 2 Mg 25 mm 2µl 2 mm 4 dntps 10 mm 0,5µl 0,2 mm 5 Primer PPA-1 20 µm 0, 25µl 0,2 µm 6 Primer PPA-2 20 µm 0,25µl 0,2 µm 7 Taq Gold 5 U/µl 0,125µl 0,025 U/µl Volumen de la mezcla 23 µl Añadir 2µl del ADN extraído a cada tubo de PCR de 0,2 ml. Incluir los controles de reacción R+ y R-. Después de añadir la muestra, cerrar bien los tubos y dar un golpe de centrífuga para bajar la mezcla de PCR. Colocar los tubos en un termociclador automatizado provisto de tapa térmica y correr el programa de incubación detallado a continuación. CICLO DE PCR. DESCRIPCIÓN Temperatura Tiempo Nº ciclos Activación de la ADN polimerasa 95ºC 10 min 1x Desnaturalización ADN 95ºC 15 sec Anillamiento de los primers 62ºC 30 sec 40 x Elongación del ADN 72ºC 30 sec Paso extra de elongación 72ºC 7 min 1x Conservación a 4 C. Conservar los productos amplificados a 4ºC hasta proceder con la electroforesis. (máximo 18 horas) ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA: 1. Preparar una solución de agarosa al 2% en tampón de electroforesis (TAE 1x). Calentar la solución en microondas hasta que la agarosa esté completamente disuelta y añadir bromuro de etidio (BrEt) para obener una concentración final de 0,5 µg/ml. Agitar para homogeneizar. 2. Preparar la bandeja sellando los extremos y colocar los peines. Verter la agarosa disuelta sobre la bandeja. Esperar que gelifique (unos 20 minutos). 3. Poner la bandeja en la cubeta y añadir tampón de electroforesis hasta que cubra el gel. Quitar los peines con cuidado. 4. Preparar las muestras añadiendo 4 µl del tampón de carga 6x a cada tubo que contiene 25 µl del producto amplificado de PCR. 5. Cargar 10 µl de cada muestra en los pocillos del gel. 6. Añadir 6µl del Marcador de peso molecular en el primer pocillo de cada peine 7. Conectar a la fuente de alimentación (las muestras migran hacia el polo positivo). Aplicar voltios y dejar correr el gel aproximadamente entre minutos. NOTA: Con voltajes bajos, la velocidad de migración de los fragmentos de ADN es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, el intervalo efectivo de separación disminuye al incrementarse el voltaje, por lo que no debe de aplicarse más de 5 u 8 V/cm 2 del gel. Finalmente colocar el gel sobre un transiluminador de luz UV para visualizar las bandas de ADN ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS. Una vez completada la electroforesis, examinar inmediatamente el gel en el transiluminador de luz ultravioleta. En una muestra positiva, se observará una banda clara que migrará paralelamente al producto de PCR de los controles positivos (E+, R+). Calcular el tamaño de los productos de PCR de las muestras analizadas y del control positivo en referencia al marcador de peso molecular. El

6 Página 6 de 7 producto amplificado del R+ y E+ tiene un tamaño de 257 pares de bases (ver figura). En el control negativo no deben observarse bandas a la altura del control positivo. El procedimiento se considerará válido si los controles positivos de extracción y reacción (R+ y E+) dan una banda clara a la altura correspondiente al amplicón de VPPA y los controles negativos de extracción y reacción (E-, R-) no muestran ningún patrón de bandas. En caso contrario, el ensayo deberá ser realizado de nuevo PUNTOS CRÍTICOS Siendo una de las ventajas de la técnica de PCR su elevada sensibilidad, el punto crítico durante todo el proceso de análisis es el riesgo de contaminación de las muestras y, por tanto, los posibles falsos positivos que en este caso se obtendrían. La contaminación puede deberse al propio VPPA presente en las muestras que puedan ser positivas o en los controles positivos empleados en el proceso de extracción, o al ADN del VPPA resultante de la amplificación y manipulado durante el análisis de los amplicones de una PCR anterior mediante la electroforesis en gel de agarosa. Por ello, es imprescindible seguir y cumplir unas estrictas normas de trabajo para minimizar el riesgo de contaminación intrínseco a la técnica de PCR: Todos los pasos que implican el análisis de muestras por PCR se realizarán en espacios diferenciados, con equipamiento y material específicos para cada uno: preparación de muestras, extracción de ADN, montaje de mezcla de PCR, análisis por electroforesis de los productos de PCR. Trabajar siempre con guantes de látex o nitrilo limpios en el laboratorio de PCR. Cada vez que el técnico que esté realizando el análisis acceda a una zona de PCR diferente, deberá cambiarse los guantes desechando los que tenía puestos. El material será de uso exclusivo para el paso del procedimiento para el que esté destinado por su situación/identificación. Utilizar una punta de pipeta diferente cada vez que se pipetee en un tubo conteniendo alguna muestra o ADN. Nunca se abrirán los tubos con producto amplificado en otro laboratorio que no sea el destinado exclusivamente al análisis de los mismos mediante electroforesis MEDIDAS DE SEGURIDAD. Leer y seguir cuidadosamente el protocolo. Conservar los reactivos a la temperatura indicada antes y después de su utilización. No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes kits. Evitar cualquier contaminación de los reactivos. No utilizar los reactivos una vez superada la fecha de caducidad. No comer, beber ni fumar en el laboratorio. No pipetear los reactivos con la boca. Utilizar siempre guantes de látex o nitrilo. El bromuro de etidio es una sustancia cancerígena, principalmente cuando está en polvo. Asegurarse de pedirlo siempre en solución y con gotero. Manipularlo exclusivamente en el laboratorio destinado para ello, siguiendo las normas de seguridad establecidas por el Servicio de Seguridad Biológica (guantes, bata, manguitos, gafas de protección). En caso de contacto, lavar inmediatamente con agua abundante y avisar al Servicio de Seguridad Biológica del centro. Avisar al mismo servicio si ocurre un vertido de algún reactivo conteniendo bromuro de etidio.

7 CENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VPPA MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Página 7 de 7 Plantilla de resultados CISA/PPA/PCR/1 REGISTRO DE ENTRADA CISA: FECHA DE ANÁLISIS: TIPO DE MUESTRAS: TÉCNICO (S) EXTRACCIÓN: LOTE KIT DE EXTRACCIÓN: LOTE + E: TÉCNICO(S) PCR: LOTE R+: PROGRAMA REALIZADO: IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS EN EL GEL OBSERVACIONES:

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