Miguel Dita (1) Einar Martínez de la Parte (2) Monica Blanco (3)
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- Mercedes Macías Franco
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1 Generalidades de la PCR: MÉTODO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE Foc RT4 Miguel Dita (1) Einar Martínez de la Parte (2) Monica Blanco (3) 1) Bioversity International, Costa Rica 2) INISAV Cuba. 3) Universidad de Costa Rica Quevedo, Ecaudor, Diciembre 2013
2 Esquema de trabajo para el empleo de los Marcadores Moleculares AISLAMIENTO DE PROTEINAS O ADN REACCIONES ENZIMATICAS MUESTRAS ELECTROFORESIS + - PREPARACION DEL GEL
3 Esquema de trabajo para el empleo de los Marcadores Moleculares AISLAMIENTO DE PROTEINAS O ADN REACCIONES ENZIMATICAS MUESTRAS ELECTROFORESIS + - PREPARACION DEL GEL
4 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., Arnheim, N Primer-directed enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, Mullis, K.B. and Faloona, F Specific sinthesis of DNA in vitro via polymerase catalysed chain reaction. Methods Enzymol. 55: Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA Incluida en el título o resumen de más de publicaciones científicas
5 TERMOCICLADOR La PCR se realiza en un Thermo Cycler o Termociclador. Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.
6 Reactivos necesarios para PCR: ü Amortiguador (Buffer 10x): 50mM KCl, 10mM Tris HCl (ph 8.3) y 1.5 mm MgCl2. ü MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa. ü dntp s (Deoxyribonucleotidos trifosfatados): datp, dgtp, dctp, dttp. ü Cebadores o primers : Son secuencias cortas de nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. ü DNA molde: El DNA puede emplearse a diferentes concentraciones, el mínimo va de ng. y el máximo entre ng. ü Taq Polimerasa: DNA polimerasa de Thermus aquaticus
7 Pasos o etapas de PCR: ADN TAQ Primer s datp dgtp dctp dttp
8 Esquema de trabajo para el empleo de los Marcadores Moleculares AISLAMIENTO DE PROTEINAS O ADN REACCIONES ENZIMATICAS MUESTRAS ELECTROFORESIS + - PREPARACION DEL GEL
9 Métodos de separación/detección Agarosa / Bromuro de etidio Poliacrilamida / Nitrato de plata
10 MARCADORES MOLECULARES vs MARCADORES MORFOLÓGICOS Marcadores morfológicos " Influencia del ambiente " Bajo número " Entrenamiento y subje@vidad Marcadores moleculares " Sin influencia ambiental " Can@dad ilimitada " Sencillos, rápidos y obje@vos
11 MARCADORES MOLECULARES " Marcadores bioquímicos-isoenzimas Formas moleculares múltiples de enzimas, que tienen orígenes genéticos similares y que poseen actividades catalíticas muy semejantes, no exactamente superpuestas. " Marcadores basados en el polimorfismo del ADN 1. Detectados por Hibridación-(RFLP) 2. Detectados por amplificación-basados en PCR (DAF, RAPD, AFLP, SCAR, CAPS)
12 MARCADORES DETECTADOS POR AMPLIFICACIÓN " DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING (DAF) " RANDOM AMPLIFIED POLIMORPHIC DNA (RAPD) Polimorfismo del ADN Amplificado al Azar. " SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGIONS (SCAR). Regiones Amplificadas de Secuencia Caracterizada " AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP). Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos Amplificados. " CLEAVED AMPLIFIED POLYMORPHIC SEQUENCE (CAPS). Secuencias Polimórficas Amplificadas y Cortadas, PCR-RFLP.
13 APLICACIONES DE LOS MARCADORES MOLECULARES Estudios de diversidad genética Estudios taxonómicos (relaciones filogenéticas) Establecimiento de genealogías Determinación de pureza híbrida Elaboración de mapas genéticos Etiquetado de genes Identificación de material microbiológico Diagnóstico
14 MARCADORES MOLECULARES Las regiones o genes más comúnmente empleados en estudios de variabilidad genética o en el diseño de cebadores para la identificación de especies fúngicas son: Los genes del ADN ribosomal nuclear (ADNr) y sus regiones espaciadoras ITS e IGS. Los genes del ADN mitocondrial (ADNmt) El gen de la ß-tubulina, El gen del factor de elongación 1 alfa (EF-1α o TEF). Otros marcadores (secuencias ERIC y elementos de transposición).
15 GENES DEL ADN RIBOSOMAL NUCLEAR(ADNr) 18s 5.8s 28s 5s ITS 1 ITS 2 IGS 1 IGS 2 UNIDAD REPETITIVA DEL ADNr " Regiones que codifican para los genes 18S, 5.8S y 28S del ARNr " Espaciadores internos transcritos (Internal Transcribed Spacer; ITS1 e ITS2) que se encuentran entre estos genes " Espaciadores intergénicos (Intergenic spacer; IGS1 e IGS2)
16 GEN TEF EF-1α " Codifica una parte esencial de maquinaria de traslación proteica, " Tiene una gran utilidad filogenética ya que es : (i) altamente informativo a nivel de especie dentro del género Fusarium (ii) se han desarrollado cebadores o primers universales que funcionan a través del género
17 GENES MITOCONDRIALES Codifican para: " Proteínas mitocondriales " ARNt " Las subunidades del ARNr (LSU y SSU ARNr) Las razones para amplio uso en estos estudios reside en características intrínsecas de esta molécula tales como: " Reducido tamaño " Alta tasa evolutiva, " Falta de bases metiladas, " Alto contenido de residuos adenina-timina (AT) " Molécula haploide donde la mayoría de los alelos poseen la misma función e inclusive poseen regiones universalmente conservadas
18 EMPLEO DE MARCADORES MOLECULARES EN EL DIAGNÓSTICO DE FUSARIUM ü Fusarium spp.- FUSARIUM-ID (Geiser et al., 2004) Amplificación y Secuenciación de TEF o IGS ü Fusarium oxysporum- Edel et al. (2000) POF2 y POF3 (dominios variables del ext. 5 del gen 28s del ARNr) ü Fusarium oxysporum f. sp. cubense Foc-1 y Foc-2(fragmentos RAPD)- Lin et al.(2008) ü Fusarium oxysporum f. sp. cubense RT 4 FocTR4-F y FocTR4-R(secuencias TEF e IGS por SNPs)- Dita et al. (2010)
19 FUSARIUM-ID v. 1.0-Esquema de trabajo
20 FUSARIUM-ID v
21 Resultado de la comparación de secuencias mediante la herramienta de búsqueda BLAST del servidor FUSARIUM-ID.
22 IDENTIFICACION POR PCR DE Foc RT4 Aislamiento de la cepa Haces vasculares del pseudotallo de plantas enfermas Cultivo monospórico Extracción de ADN Amplificación (PCR) con el empleo de los cebadores FocTR4-F/ FocTR4-R Electroforesis en gel de agarosa y visualización del producto amplificado
23 IDENTIFICACION POR PCR DE Foc RT4 Primers: FocTR4-F: 5 - CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG 3 FocTR4-R: 5 - CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA 3 68C FocTR4-R: GCCAGGACTGCCTCGTGA 3 60C Temperatura de anillamiento: 60 C Amplicón: 463 pb ciclos 4
24 Diagnóstico molecular para TR4 (GVC01213) Lin et al. (2008)- Foc- 1/ Foc- 2 M VCG bp Primers - FocTR4- F/ FocTR4- F (Dita et al. 2010) Foc1/Foc2: Positivo aislados de Honduras, Brasil, Costa Rica, Australia, Indonesia, Taiwan M
25 IDENTIFICACION POR PCR DE Foc Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación de 20 VCG de Foc mediante el empleo de Foc-1/ Foc-2 (Lin et al., 2008) panel superior y de FocTR4- F/FocTR4-R panel inferior (Dita et al., 2010): Línea 1-VCG 0120; Línea 2- VCG 0121, Línea 3 VCG 0122, Línea 4 -VCG 0123, Línea 5-VCG 0124, Línea 6-VCG 0125, Línea 7- VCG 0126, Línea 8-VCG 0128, Línea 9 -VCG 0129, Línea 10- VCG 01210, Línea 11- VCG 01211, Línea 12 -VCG 01212, Línea 13 - VCG 01213, Línea 14- VCG 01214, Línea 15 -VCG 01215, Línea 16 -VCG 01218, Línea 17- VCG 01221, Línea 18- VCG 01222, Línea 19- VCG 01223, Línea 20- VCG M: marcador de peso molecular
26 IDENTIFICACION POR PCR DE Foc Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación de la reacción PCR duplex com plantas sanas e inoculadas con Foc RT4: Línea 1, Musa balbisiana cv. Buthohan (BB); 2, Musa acuminata cv. Pisang Mas (AA); 3, Grand Naine; 4, Silk (AAB); 5, Prata Ana (AAB); 6, rizomas de plantas Gran enano no inoculadas; 7 9, rizomas de plantas Gran enano inoculadas con aislados de Foc TR4; 10-11, pseudotallos infectados de plantas Gran enano inoculadas con Foc TR4; 12, control positivo control usando ADN de cultivo puro de cepa VCG
27 Gracias Preguntas?
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