TÉCNICAS MOLECULARES EN LA DETECCIÓN DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS

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1 TÉCNICAS MOLECULARES EN LA DETECCIÓN DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS EN LOS ALIMENTOS. Aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa Marta Terrón Cuadrado Junio 2008 Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 1

2 ÍNDICE 1. Introducción 3 2. Legislación comunitaria relativa a los organismos genéticamente modificados 5 3. Detección de organismos genéticamente modificados 9 4. Descripción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Empleo de la PCR en la detección de organismos genéticamente modificados Ejemplos prácticos Consideraciones éticas sobre los organismos genéticamente modificados Bibliografía 31 Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 2

3 1. INTRODUCCIÓN Las variedades vegetales cultivadas en la actualidad son el producto de la domesticación intensiva realizada a lo largo de los siglos a partir del estado silvestre original, mediante los procesos de selección y reproducción controlada para conseguir mayor productividad, mayor resistencia a plagas o una calidad mejor o diferente respecto a las líneas ancestrales anteriores. Tales cambios, que se llevan produciendo desde la primera domesticación de las plantas para su explotación por el ser humano, implican el intercambio o recombinación de caracteres deseados, genes, mediante el cruce continuo a lo largo del tiempo dentro de una especie o entre grupos de especies con estrecha relación y compatibles sexualmente. En las últimas décadas se han desarrollado estrategias que permiten realizar cruces no sólo entre plantas que son compatibles en la naturaleza, sino también entre plantas cuyos cruces se consideran estériles naturalmente. Ejemplos de estas técnicas son la recuperación de embriones, el cultivo de embriones in vitro o in vivo, los cultivos de óvulos y ovarios, la polinización in vitro y la fertilización in vitro. Asimismo, es posible obtener cambios mutacionales mediante irridación de semillas. Sin embargo, los procedimientos tradicionales de cruzamiento y selección presentan una serie de inconvenientes. Entre ellos destaca el deseo de introducir determinados caracteres aislados, más que transferir genomas completos. Por otra parte, la selección y reproducción de variedades genéticamente estables es un proceso lento. Estas desventajas pueden ser obviadas mediante las técnicas derivadas de la moderna Biotecnología. De esta forma, se ha introducido el término organismos genéticamente modificados (OGM) para describir aquellos organismos cuyo material genético se ha modificado de una forma que no tiene lugar en la naturaleza en condiciones de hibridación o recombinación natural. El OGM en sí debe ser una unidad biológica capaz de multiplicarse o transmitir material genético. Aplicado a los vegetales, el término se refiere a plantas en cuyo genoma (hospedador) se han introducido de forma estable uno ovarios genes procedentes de otras especies, mediante técnicas de transferencia genética y cuando en la mayoría de los casos se ha comprobado que tales genes introducidos hacen que se obtenga un producto génico (una proteína). El proceso por el que se introducen Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 3

4 genes en especies no emparentadas, consiguiendo su expresión, se denomina transformación genética. El análisis de las notificaciones experimentales en la Unión Europea (UE) pone de manifiesto que los caracteres estudiados con mayor frecuencia son la tolerancia a los herbicidas, la resistencia a insectos derivada de la bacteria Bacillus thuringiensis, la restauración de la fertilidad o esterilidad masculina, la resistencia a virus y a hongos, y la alteración de la biosíntesis del almidón. La primera tecnología desarrollada en la década de los años 80 para la transformación de vegetales utilizaba una especie bacteriana, Agrobacterium tumefaciens, con el fin de introducir el gen de interés en el organismo hospedador. A. tumefaciens es una bacteria patógena de vegetales. En la naturaleza esta especie tiene la capacidad de transferir un fragmento determinado de su DNA, el DNA T de su plásmido Ti (inductor de tumores) desde su citoplasma al interior de las células infectadas, donde se integra después de forma estable en el genoma del hospedador y se transcribe, provocando la enfermedad de la agalla de la corona. Se ha aprovechado el sistema de Agrobacterium para desarrollar un método de transferencia genética a células vegetales. El plásmido Ti ha demostrado ser un magnífico vector natural para la transformación de plantas, capaz de transferir su DNA T desde la bacteria a la célula vegetal. Sin embargo, presenta el inconveniente de infectar de forma natural sólo a plantas dicotiledóneas, por lo que muchos vegetales de importancia económica, como los cereales, que son monocotiledóneas, no pueden ser transformados por este sistema. Para estos casos se han desarrollados otros métodos como la transferencia mediante polietilenglicol, la microinyección, los protoplastos, la electroporación de células intactas y la biolística. En todos los casos, las células transformadas se utilizan para regenerar plantas completas, que han incorporado el nuevo gen o genes de interés. Dichas plantas son objeto de estudio, se reproducen de forma intensiva y, finalmente, proporcionan semillas para una nueva generación de líneas modificadas genéticamente. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 4

5 2. LEGISLACIÓN COMUNITARIA RELATIVA A LOS ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS El uso de OGM (su liberación al medio ambiente, cultivo, importación y, en particular, su utilización como alimento o ingrediente alimentario) está sujeto en la UE a una normativa específica. Los primeros instrumentos jurídicos de los que se dotó la Comunidad, las Directivas 90/220/CEE y 90/219/CEE, tenían el propósito de proteger la salud humana y animal y el medio ambiente. En la actualidad, el principal instrumento jurídico comunitario, considerado el marco jurídico horizontal que rige el sector de la Biotecnología en la UE, es la Directiva 2001/18/CE del Parlamento y del Consejo, de 12 de marzo de 2001, sobre la liberación intencional en el medio ambiente de organismos genéticamente modificados. Esta Directiva derogada a la anterior, Directiva 90/220/CEE, y refuerza las normas anteriores sobre la liberación de OGM en el medio ambiente, estableciendo principios de evaluación del riesgo ambiental, obligaciones de seguimiento (ambiental) tras la comercialización, información al público, etiquetado y trazabilidad en todas las fases de comercialización, y la creación de un registro, entre otras medidas. Tras la comercialización de un OGM como producto o componente de un producto, el notificador debe velar por que el seguimiento tras la comercialización y la presentación de informes se lleven a cabo con arreglo a las condiciones especificadas en la autorización Junto con las Directivas mencionadas anteriormente, a lo largo de los años se ha ido elaborando y aplicando una serie de instrumentos jurídicos verticales, en los que se trata más específicamente la aprobación y la seguridad en el uso de los OGM destinados al consumo humano y animal. La comercialización dentro de la Comunidad de nuevos alimentos e ingredientes alimentarios era objeto, hasta hace poco tiempo, de un acto legislativo vertical, el Reglamento (CE) nº 258/97 aplicable, entre otros, a: alimentos e ingredientes alimentarios que contengan OGM con arreglo a la Directiva 90/220/CEE, o que consistan en dichos organismos; alimentos e ingredientes alimentarios producidos a partir de OGM, pero que no los contengan; Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 5

6 Respecto al etiquetado de los alimentos genéticamente modificados (GM) su regulación es objeto de varios instrumentos jurídicos. Los requisitos de etiquetado se mencionan por primera vez en el Reglamento (CE) nº 258/97 sobre nuevos alimentos. El objetivo era que el consumidor final estuviera informado de cualquier cambio de las características o propiedades alimentarias, tales como la composición, el valor nutritivo o los efectos nutritivos, o el uso previsto del alimento, responsable de que un nuevo alimento o ingrediente alimentario dejara de ser equivalente a un alimento o ingrediente alimentario existente. Antes de la entrada en vigor del Reglamento (CE) nº 258/97 ya se habían comercializado en la UE dos OGM, la soja Roundup Ready y el maíz Maximizer, por lo que mediante el Reglamento (CE) nº 1139/98 se establecieron a posteriori requisitos de etiquetado específicos para dichas variedades. En concreto, este Reglamento establecía un modelo de etiquetado basado en el principio de que un alimento o ingrediente GM deja de considerarse equivalente a uno existente no GM si puede detectarse la presencia de DNA o de proteína derivados de la modificación genética. El Reglamento (CE) nº 1139/98 fue modificado posteriormente por el Reglamento (CE) nº 49/2000, llamado de umbrales, que intentaba resolver el problema planteado por la contaminación inadvertida e introducía el concepto de umbral. Se establecía en este Reglamento que no se aplicarían a los alimentos los requisitos específicos adicionales de etiquetado si la presencia de material obtenido de OGM no superaba el 1%. Asimismo, con el fin de establecer que la presencia de dicho material era accidental, los operadores debían aportar pruebas de que se habían tomado las medidas oportunas para no utilizar OGM. Se hizo entonces necesario actualizar la legislación comunitaria existente hasta el momento ante la opinión crítica de diferentes asociaciones de usuarios y las dificultades de interpretación y aplicación de los instrumentos promulgados. En octubre de 2003 se publican dos Reglamentos que proporcionan una guía más completa e informativa sobre los alimentos GM: el Reglamento (CE) nº 1829/2003 sobre alimentos y piensos modificados genéticamente Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 6

7 y el Reglamento (CE) nº 1830/2003 relativo a la trazabilidad y etiquetado de organismos genéticamente modificados y a la trazabilidad de los alimentos y piensos producidos a partir se éstos. La nueva normativa establece como umbral mínimo para el etiquetado el 0,9% respecto a la presencia accidental de OGM autorizados. Además, se ha establecido un umbral del 0,5% respecto a la presencia accidental de OGM no autorizados, con carácter transitorio, siempre que hayan sido objeto de un dictamen favorable del Comité o Comités Científicos pertinentes. La UE reconoce así el derecho de los consumidores a la información y al etiquetado como instrumento para elegir con conocimiento de causa. Desde 1997 es obligatorio el etiquetado para indicar la presencia de OGM como tales o formando parte de un producto. Sin embargo, el Reglamento (CE) nº 1830/2003 refuerza las normas vigentes sobre el etiquetado de los alimentos GM: extiende el etiquetado obligatorio a todos los alimentos y piensos, independientemente de la detectabilidad, y define la trazabilidad como la capacidad de seguir la traza de los OGM y los productos producidos a partir de OGM en todas de su comercialización a lo largo de las cadenas de producción y distribución. Surge, por tanto, la necesidad de disponer de métodos para detectar la eventual presencia de un OGM en una matriz alimentaria, para identificar el OGM en concreto y para medir su cantidad en diferentes ingredientes de alimentos y piensos. Para ello, pueden utilizarse métodos cualitativos de detección, en un cribado inicial de los productos alimentarios, para investigar la presencia de compuestos específicos (DNA o proteínas) de OGM: en productos muestreados en las estanterías de los supermercados, en las existencias almacenadas o en otros puntos previos de la cadena de distribución. Si esos análisis cualitativos proporcionan una indicación de la presencia de OGM, con un ensayo cuantitativo posterior puede obtenerse una respuesta definitiva sobre el requisito de etiquetado. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 7

8 En el marco legislativo vigente se introdujo un componente fundamental, el Laboratorio Comunitario de Referencia. Esta labor ha recaído en el Centro Común de Investigaciones (CCI) asistido por la Red Europea de Laboratorios OGM. La misión del Laboratorio Comunitario de Referencia es evaluar y validar los métodos analíticos para garantizar que se ajustan al objetivo de cumplir la normativa. Asimismo, asesorará sobre aspectos científicos y técnicos en caso de litigio. Para cumplir con la legislación que exige métodos de análisis seguros, precisos y robustos, es necesaria una actividad de investigación que contribuya a la armonización y normalización del enfoque y del conjunto de procedimientos analíticos y sus características en todos los laboratorios comunitarios. La armonización y normalización de los procedimientos y sus características dentro de los laboratorios europeos de control lleva tiempo siendo señalada por el CCI como elemento fundamental para el éxito de cualquier instrumento legislativo de control. La Red Europea de Laboratorios OGM fue constituida en diciembre de La gestión y las actividades de secretaría son coordinadas por la Comisión Europea a través de la DG Centro Común de Investigaciones. La Red cuenta actualmente con 71 componentes tras las últimas adhesiones de los países del Este y Centro de Europa. El objetivo de la Red Europea de Laboratorios OGM es crear una plataforma única de expertos activos en el muestreo, detección, identificación y cuantificación de OGM en semillas, granos, alimentos, piensos y muestras ambientales, para plantear y tratar temas técnicos tales como: desarrollo de métodos de análisis cuali y cuantitativo transferencia de tecnología, formación y creación de capacidad validación y estudio de aptitud de métodos adecuados para el cribado de diversas matrices en cuanto a la presencia de OGM o para la estimación de las cantidades de OGM presentes. materiales de referencia (corresponde este aspecto al Instituto de Materiales de Referencia del CCI) Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 8

9 estrategias y métodos de muestreo de los diferentes productos GM (semillas, granos, materias primas, productos para el consumidor final o colectividades) bases de datos y bioinformática, y requisitos para la identificación inequívoca de OGM y creación de bases que contengan dichos datos moleculares. 3. DETECCIÓN DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS La base de todas las técnicas de detección de OGM consiste en la explotación de la diferencia entre la variedad no modificada y la planta transgénica. Esto puede realizarse detectando el DNA transgénico insertado o detectando la nueva proteína expresada, o en el caso de que la proteína actúe como enzima, utilizando el análisis químico para detectar el producto de la acción enzimática. Existen, por tanto, dos planteamientos técnicos empleados para detectar modificaciones genéticas en plantas: 1. El ensayo de inmunoabsorción enzimática o ELISA, que permite estudiar la presencia de proteínas específicas gracias a la especificidad de la unión antígenoanticuerpo. 2. La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, que se basa en la detección de secuencias nuevas de DNA en el genoma de la planta. Estos métodos permiten conocer la ausencia o presencia del OGM en la muestra estudiada y, a veces, pueden también dar una indicación cuantitativa o porcentaje. El primer método validado a nivel comunitario fue uno de cribado que aplica la tecnología de la PCR y es capaz de detectar la mayoría de los OGM cuya comercialización está autorizada actualmente. Este método fue desarrollado por Pietsch y col. en 1997 basándose en la detección de las secuencias reguladoras que flanquean al gen introducido: el promotor 35S y el terminador nos. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 9

10 De igual forma, se han desarrollado y validado métodos relativos a las proteínas nuevas presentes en el OGM como el específico para la detección de soja Roundup Ready utilizando la técnica de ELISA. Cada vez se utilizan con más frecuencia los métodos analíticos basados en la tecnología de la PCR para la detección de secuencias asociadas con los OGM, permitiendo la segregación y trazabilidad a lo largo de la cadena de alimentaria de las plantas GM. El requisito previo indispensable para la detección de OGM es el conocimiento del tipo de modificación genética, incluida la secuencia del gen introducido y los elementos reguladores (promotor y terminador) que lo flanquean. Para el análisis es necesario disponer de una cantidad mínima de material de muestra con DNA intacto. Se han diseñado distintas estrategias para el empleo de la PCR en la detección de los OGM autorizados. La especificidad de la PCR depende de la selección exacta de los cebadores. Éstos pueden dirigirse a diferentes elementos utilizados en el proceso de transformación. De esta forma, pueden desarrollarse sistemas de detección de PCR de banda ancha, denominados generalmente métodos de cribado, diseñando cebadores específicos de las secuencias más comunes utilizadas en la transformación. Se trata normalmente de las secuencias reguladoras (promotor y terminador). Por otra parte, los vegetales MG pueden clasificarse en categorías de acuerdo con el gen introducido. Por lo tanto, una forma más de dirigir la especificidad de la reacción es elegir cebadores de las secuencias de DNA localizadas en distintos elementos genéticos, por ejemplo, promotor-gen estructural, gen estructural-terminador. Finalmente, siempre que se disponga de información específica y completa sobre la secuencia, con el objetivo de obtener métodos realmente específicos de una planta MG, pueden desarrollarse sistemas con especificidad de línea (específicos de una transformación) seleccionando una combinación única de secuencias presente tan solo en esa línea transformada concreta. Esto se consigue diseñando cebadores con hibridación en la región del DNA en la que se incluye el empalme del sitio de integración. El empalme entre el DNA insertado y el DNA hospedador ofrece una secuencia nucleotídica única que constituye una diana ideal para un ensayo muy específico por PCR. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 10

11 Además, la necesidad de cuantificar el OGM presente en una muestra hizo que se desarrollaran protocolos basados en la PCR que permitieran no sólo una respuesta cualitativa (presencia/ ausencia), sino también una indicación más o menos precisa, según el método elegido, de la cantidad relativa del OGM en la muestra. 4. DESCRIPCIÓN DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction o PCR) es una técnica que ha revolucionado el trabajo en Biología Molecular. Fue desarrollada a mediados de los años ochenta por Kary Mullis, quien obtuvo por ello el Premio Nobel. Junto con los métodos de secuenciación rápida de los ácidos nucleicos, ha impulsado enormemente el avance de la investigación y las aplicaciones de la moderna Biotecnología. Precisamente, una de las mayores dificultades con que se enfrentaba el estudio de los genes radicaba en la necesidad de poder disponer de dichos genes. Los genes son fragmentos de DNA localizados en la gran cantidad de información que supone el genoma de un individuo. Gran parte del esfuerzo experimental se dirigía, entonces, a la obtención de secuencias aisladas del gen de interés. Las técnicas de clonaje de DNA lograban este objetivo mediante métodos largos y complejos. La técnica de la PCR ha cambiado radicalmente el panorama al permitir la producción de una cantidad elevada de copias de una determinada secuencia, lo que se denomina amplificación, convirtiéndose en una herramienta básica no sólo en laboratorios de investigación básica, sino en el diagnóstico clínico, en Medicina Forense, etc. La técnica de la PCR permite la amplificación selectiva de una región del DNA. Con este fin se requiere conocer previamente la secuencia de las dos regiones cortas que flanqueen a la que se pretende amplificar, que son utilizadas como cebadores o primers en la fase de elongación catalizada por la polimerasa. Previamente estos cebadores han de unirse al DNA molde desnaturalizado. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 11

12 3 CEBADOR SECUENCIA DIANA SECUENCIA DIANA CEBADOR 2 3 FRAGMENTO DIANA: región de la molécula de DNA que será amplificada (la posición donde hibridan los cebadores define la longitud del fragmento que se amplifica) La reacción de amplificación se basa en la repetición de un ciclo constituido por tres etapas: 1. Desnaturalización del DNA molde para dar dos hebras sencillas mediante la elevación de la temperatura; de esta forma se permitirá la subsiguiente unión de los fragmentos cebadores. 2. Hibridación de los cebadores: al disminuir la temperatura se induce la unión de los cebadores a las zonas complementarias del DNA desnaturalizado. Esto es posible ya que los cebadores son oligonucleótidos monocatenarios de secuencia idéntica a una región de cada una de las dos hebras, localizadas en las posiciones extremas de la región que se quiere amplificar. Tras la unión de los cebadores a la secuencia complementaria, se forma una estructura monocatenaria cebada, sustrato de las polimerasas. 3. Elongación: manteniendo una temperatura adecuada y en presencia de los cuatro dntps, la enzima polimerasa elonga el sustrato cebado. Durante los primeros ciclos se sintetizan largas moléculas, sin embargo, en repeticiones posteriores, la elongación empezará a encontrarse limitada por la longitud del molde que, a su vez, aparecerá fijada por el segundo cebador. A medida que se repite el ciclo, la mezcla de productos Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 12

13 se enriquece progresivamente en la especie molecular que incorpora en sus extremos a ambos fragmentos cebadores. gen deseado 3º ciclo 2º ciclo 1º ciclo 35º ciclo DNA plantilla 2 36 = millones de ejemplares 2 2 = 4 ejemplares 2 3 = 8 ejemplares 16 ejemplares Amplificación exponencial del DNA mediante PCR El producto mayoritario en la amplificación es el fragmento de DNA cuyos extremos se corresponden a los terminales 5 de los cebadores utilizados y cuya longitud está definida por la posición de éstos en la secuencia del DNA original. Durante la reacción se producen otras moléculas más largas cuya concentración en la mezcla o bien no aumenta o lo hace de forma lineal. Únicamente la concentración del segmento limitado por los dos cebadores aumenta de forma exponencial, por lo que, tras varios ciclos de amplificación, este producto es mayoritario en la población de moléculas en la mezcla. Así, se obtendría una amplificación de veces tras 30 ciclos de PCR; en la práctica se consiguen fácilmente factores de más de Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 13

14 La reacción tiene lugar in vitro, en un medio adecuado y en presencia de los componentes necesarios, cebadores, enzima y sustratos. El parámetro esencial a controlar es la temperatura, que ha de ser muy elevada en la primera etapa, con el objetivo de lograr la desnaturalización del DNA; disminuir en la segunda, para permitir la hibridación de los cebadores; y la más adecuada en la tercera etapa para la actividad de la enzima polimerasa sin que se afecte la integridad del molde cebado. Fase 1 desnaturalización del DNA 100 T (ºC) 70 Un ciclo Fase 3 extensión del cebador minutos Fase 2 hibridación del cebador Perfil de ciclos de temperatura de la PCR En la versión original esta técnica empleaba la actividad polimerasa del fragmento Klenow de la DNA-polimerasa I de E. coli. Esta enzima se inactivaba en la primera etapa del ciclo al aumentar la temperatura para lograr la desnaturalización del DNA molde, siendo necesario adicionar enzima activa en cada ciclo. El proceso resultaba lento y tedioso, funcionando bastante bien con fragmentos cortos de DNA (menores de 200 pb) y con resultados malos con fragmentos mayores. En la etapa de elongación no se podía aumentar demasiado la temperatura de forma que se la polimerasa mantuviera una Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 14

15 actividad suficiente, lo cual producía uniones no específicas de los cebadores a secuencias sólo parcialmente complementarias, formándose una mezcla de estructuras cebadas en diferentes lugares que daba lugar a un producto muy heterogéneo. Estos problemas han sido solucionados con la incorporación al procedimiento de otras actividades polimerásicas termoestables, como la aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus (DNA-polimeras Taq). Esta enzima mantiene su actividad durante un tiempo prolongado a temperaturas tan elevadas como 95ºC, no resultando inactivada en la etapa inicial de desnaturalización y evitándose, por tanto, la necesidad de adicionar nueva enzima en cada ciclo de amplificación. Asimismo, dado que la etapa de elongación puede realizarse a alta temperatura la probabilidad de una unión no específica de los cebadores se reduce, mejorando sustancialmente el rendimiento y la especificad de la reacción de amplificación y el producto amplificado. 5. EMPLEO DE LA PCR EN LA DETECCIÓN DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS Se pueden señalar como características del análisis por PCR: Elevada sensibilidad para detectar la presencia de cantidades ínfimas del gen o secuencia diana de interés dentro del material genético presente en la muestra. Breve período de tiempo para elaborar los reactivos en comparación con los ensayos inmunológicos, la síntesis de cebadores frente a la producción de anticuerpos. Los reactivos necesarios están mayoritariamente disponibles comercialmente. El análisis de las muestras es muy rápido. Permite discriminar entre diferentes tipos de modificación genética. En comparación con el empleo de anticuerpos específicos frente a la proteína de interés mediante la técnica ELISA, que permite detectar o cuantificar dicha proteína en una muestra, que puede contener otras muchas proteínas diferentes: Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 15

16 Menor sensibilidad que la PCR, lo cual implica que aparezcan menos falsos positivos debidos a pequeños niveles de contaminación. Elevados costes iniciales para el desarrollo del ensayo y la obtención de anticuerpos y patrones de proteínas. Reducidos costes por muestra, una vez elaborados los reactivos. No permite discriminar entre diferentes modos y modelos de expresión de diferentes productos transgénicos que expresen proteínas similares. Mayor tiempo de preparación de los reactivos y del método. Es un método práctico y útil cuando se produce una proteína detectable. Sin embargo, puede suceder que los productos modificados genéticamente se formen únicamente durante ciertas fases del desarrollo o en determinadas partes del vegetal, por lo que resultaría poco probable que tales productos fuesen detectados sin problemas por la técnica ELISA. Además, las transformaciones industriales desnaturalizan fácilmente las proteínas, lo que dificulta igualmente la detección por este método en el caso de alimentos transformados. Ambos métodos no son excluyentes, sino que deben considerarse complementarios. En la siguiente tabla se resumen sus características más relevantes: Método Objeto Duración Facilidad de empleo Resultados ELISA proteínas 2-8 h Media; exige conocimiento de prácticas de laboratorio; los ensayos son específicos de especie y variedad PCR DNA 1-3 días Escasa; requiere formación y material especializados Confirma una modificación genética específica y permite cuantificación Muy sensible, tiende a dar falsos positivos; confirma la presencia de DNA GM y permite cuantificación Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 16

17 Para su empleo por las autoridades de control la validación de los métodos es crucial. El Centro Común de Investigación de la Comisión Europea fue el primero en validar métodos por ELISA y PCR para materias primas constituidas por soja Roundup Ready y un método por PCR para maíz Maximizer (Bt-176) en alimentos transformados. Posteriormente, se han desarrollado y validado otro métodos de análisis cuali y cuantitativo. La preparación de las muestras es un punto crítico para la detección y cuantificación, tanto si se aplica el método basado en el DNA como en el de proteínas. El tamaño de muestra y el procedimiento de muestreo influyen enormemente en las conclusiones que pueden obtenerse de los ensayos. Dada la potencia de esta técnica, puede suceder que cantidades traza de DNA contaminante sirvan como molde, lo que provocaría la amplificación de un ácido nucleico distinto del DNA diana dando lugar a falsos positivos. Por tanto, resulta fundamental realizar la amplificación por PCR en un entorno libre de DNA. Para reducir el riesgo de contaminación es conveniente trabajar en zonas físicamente separadas y que cuenten con su propio material, aunque el requisito previo imprescindible para reducir al mínimo la tasa de falsos resultados positivos es el seguimiento estricto de las normas de descontaminación (descontaminación de ácidos nucleicos, prevención de la formación de aerosoles, etc.). La contaminación durante una PCR puede proceder de diferentes fuentes: Mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con preparados anteriores de DNA, o con fragmentos de restricción purificados Contaminación cruzada entre muestras Productos de amplificaciones anteriores por PCR En cuanto a la preparación de la muestra para PCR (mezcla maestra): Los reactivos fundamentales para la PCR son: agua, el tampón de reacción, la DNA polimerasa termoestable, los cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos (dntp), el DNA molde (diana) e iones Mg 2+. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 17

18 El paso previo para realizar cualquier análisis de modificación genética es la extracción y purificación del DNA de la muestra. Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es necesario provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. Entre los procedimientos de lisis más frecuentes se encuentran: Rotura mecánica: trituración, lisis hipotónica, etc. Tratamiento químico: detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc. Digestión enzimática: proteinasa K, etc. Posteriormente, se produce a la purificación de los ácidos nucleicos a partir de los extractos celulares mediante la combinación de dos o más técnicas de las siguientes: Extracción/ precipitación Cromatografía Centrifugación Separación por afinidad En general, todos los reactivos, excepto el DNA molde, se mezclan en un solo tubo, con un volumen suficiente según el número de ciclos que se vayan a realizar, constituyendo la mezcla maestra. Ésta se reparte a continuación en alícuotas en varios tubos y se añade el DNA molde. El uso de la solución maestra reduce el riesgo de contaminación y mejora el rendimiento de la PCR, ya que: garantiza una calidad uniforme de la solución original respecto a todos los reactivos para una serie de análisis disminuye el riesgo de contaminación de la solución original y de las resultantes pueden pipetearse volúmenes mayores hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo. El éxito en la amplificación de la región de interés depende de la cantidad y de la calidad de DNA molde. La cantidad de DNA molde necesaria depende de la complejidad de la muestra de DNA. Teniendo en cuenta que el tamaño del genoma nuclear varía según los organismos, la concentración de DNA debe mantenerse constante (generalmente Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 18

19 10ng/µL). En la siguiente tabla se muestra el tamaño del genoma de varias especies vegetales transformadas habitualmente junto con el número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de DNA: Muestra Tamaño del genoma Ejemplares de genoma en 1µg de DNA Ejemplares de genoma en 1ng de DNA arroz 4x10 8 pb 2,31x maíz 5x10 9 pb 1,85x soja 1,55x10 9 pb 5,89x tabaco 3,8x10 9 pb 2,43x Así, por ejemplo, en un plásmido de 4kb con un inserto de 1kb, la diana de interés es el 25% del DNA aportado. Mientras que un gen de 1kb en el genoma del maíz (5x10 9 pb) representa aproximadamente el 0,00002% del DNA aportado. Por tanto, hace falta alrededor de un millón de veces más del DNA del genoma del maíz para mantener el mismo número de ejemplares de la diana por reacción. Para optimizar los resultados deben utilizarse >104 ejemplares de la secuencia diana como DNA molde inicial para obtener una señal al cabo de ciclos. Aunque en la práctica es posible amplificar menos de 10 ejemplares de una secuencia diana, en este caso podría ser necesario un número mayor de ciclos de PCR para detectar una señal por electroforesis en gel. Los protocolos habituales consideran un número de ciclos entre 30 y 40. El aumento del número de ciclos tiene el inconveniente de incrementar, a su vez, la amplificación inespecífica. La contaminación de la muestras puede dar lugar falsos resultados positivos y, además, otra posible contaminación, la degradación de productos por reacciones de descontaminación, produciría falsos negativos. Esta forma de contaminación fue observada en primer lugar por Niederhauser y cols en 1994 y provoca la inhibición de la PCR. Por este motivo, para obtener resultados fiables, en el procedimiento de detección por PCR se deben utilizar controles tanto positivos como negativos. En la tabla siguiente Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 19

20 se muestran algunos de los controles más utilizados para garantizar el resultado de los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos: Control Contaminación de los reactivos con el DNA diana Especificidad de la reacción Desarrollo y sensibilidad de la reacción Integridad de la mezcla de PCR Método Control negativo de la PCR sin DNA molde (solo mezcla maestra) Controles para detectar productos secundarios e inespecíficos Controles negativos y positivos para verificar que se cumplen las condiciones y rendimientos buscados PCR con control positivo de DNA Controles positivos Mediante los controles positivos se comprueba la eficacia de la extracción y amplificación de DNA. Lo ideal es dar límites de detección en equivalente genómicos, lo que permitiría la producción de controles de sensibilidad definidos, con pequeños números de ejemplares. En principio debe disponerse de un preparado de referencia que contenga una concentración conocida del DNA diana estudiado. Controles negativos Puede producirse contaminación (arrastre de productos amplificados o ácidos nucleicos) durante el aislamiento y la purificación del DNA diana, así como durante la preparación de la mezcla de reacción para la amplificación. Por tanto, es imprescindible introducir un control negativo con la mezcla de reacción para la amplificación. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 20

21 6. EJEMPLOS PRÁCTICOS EJEMPLO: PCR PARA LA DETECCIÓN DEL GEN DE LA LECTINA En la identificación del DNA de soja se utilizan los cebadores GMO3 y GMO4 que amplifican un fragmento del gen de la lectina específico de la soja. El objetivo que se persigue es confirmar la presencia y la calidad del DNA extraído de las muestras que contienen soja, calidad en cuanto a la capacidad de amplificación por la técnica. Los cebadores GMO3 y GMO4 se utilizan en una PCR anidada. El producto es un amplicón de 118pb. Las características de los cebadores GMO3 y GMO4 se recogen en las siguientes tablas: GM03 Secuencia GCCCTCTACTCCACCCCCATCC Longitud 22 Peso molecular (g/mol) 6471,6 Punto de fusión* (G/C) 65,1 GM04 Secuencia GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG Longitud 23 Peso molecular (g/mol) 6981,1 Punto de fusión* (G/C) 59,6 Suponiendo que la [Na + ] sea de 50mM Los controles que se emplearán son: Control positivo: DNA puro, aislado de la soja convencional Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 21

22 Control negativo: DNA puro aislado de otras especies y libre del gen de la lectina Control sin plantilla: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua en vez de DNA. Tras la amplificación de la secuencia diana, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8µL de la reacción de PCR con 2µL de tampón de carga, tras lo cual se cargan las muestras en el gel de agarosa (1,5%). Se realiza una migración a 100V durante 1 hora. Se someten a electroforesis marcadores de tamaño (15µL de una escalera de 100pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el DNA del gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. El sistema se comprueba utilizando la pareja de cebadores GMO3-GMO4 para detectar el gen de la lectina sin modificar; la calidad de amplificación del DNA extraído se ve confirmada por una banda de 118pb, específica del gen lectina. El control positivo amplificará una banda de 118pb. Los controles negativos y sin plantilla no deben mostrar una banda visible. Si los controles positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras seleccionadas no es válido. Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra no presenta una banda a 118pb, significa que la muestra no contiene DNA de soja amplificable. EJEMPLO: PCR PARA LA DETECCIÓN DEL GEN DE LA ZEÍNA Los cebadores ZEIN3 y ZEIN4 específicos del gen de la zeína del maíz se emplean para confirmar la presencia y calidad del DNA extraído de muestras que contienen maíz. Las características de los cebadores ZEIN3 y ZEIN4 se recogen en las siguientes tablas: Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 22

23 ZEIN3 Secuencia AGTGCGACCCATATTCCAG Longitud 19 Peso molecular (g/mol) 5772,3 Punto de fusión* (G/C) 55,2 ZEIN4 Secuencia GACATTGTGGCATCATCATTT Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6410,9 Punto de fusión* (G/C) 51,7 Suponiendo que la [Na + ] sea de 50mM Se empleará: Control positivo: DNA puro, aislado de maíz convencional Control negativo: DNA puro, aislado de otras especies y libre del gen de la zeína. Control sin plantilla: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua en vez de DNA. Al igual que en el ejemplo anterior, tras la amplificación del DNA, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se procede de la misma forma y en la interpretación de los resultados, la calidad de la amplificación del DNA extraído se comprueba utilizando la pareja de cebadores ZEIN3-ZEIN4 para detectar el gen de la zeína del maíz sin modificar. Si el DNA extraído tiene suficiente calidad de amplificación, se observará en el gel una banda específica del gen de la zeína de 277pb. El control positivo también debería mostrar una banda amplificada de 277pb. Los controles negativo y sin DNA molde no deben arrojar ninguna banda visible. Mientras que si los controles positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras seleccionadas no es válido. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 23

24 Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra no presenta una banda a 277pb, significa que la muestra no contiene DNA de maíz amplificable. EJEMPLO: MÉTODO DE CRIBADO, DETECCIÓN DEL PROMOTOR CaMV 35S Y DEL TERMINADOR nos La detección del promotor 35S y del terminador nos por PCR constituyen el llamado método de cribado para la identificación de alimentos derivados de plantas MG. Esto es así debido a que el uso de dichos elementos reguladores como secuencias diana permite la detección de la mayoría de los productos alimenticios MG, ya que, hasta ahora están presentes en casi todos los vegetales MG autorizados en la Unión Europea. PCR PARA LA DETECCIÓN DEL PROMOTOR CaMV 35S El promotor 35S (derivado del virus del mosaico de la coliflor) regula la expresión de los genes de numerosas plantas transgénicas, como en el caso de la soja Roundup Ready y la línea de maíz Bt-176. Su detección específica se realiza mediante los cebadores p35scf3 y p35s-cr4. El amplicón previsto en la PCR es un fragmento de 123pb. Las características de los cebadores p35s-cf3 y p35s-cr4 se recogen en las siguientes tablas: p35s-cf3 Secuencia CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6414,5 Punto de fusión* (G/C) 57,4 Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 24

25 p35s-cr4 Secuencia TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7544,2 Punto de fusión* (G/C) 56,3 Suponiendo que la [Na + ] sea de 50Mm Los controles que se emplearán son: Control positivo: DNA de material de referencia (maíz del que un 0,5% es GM) Control negativo: DNA de material de referencia (maíz del que un 0% es GM) Control sin DNA molde: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua en lugar de DNA. Tras la amplificación se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Para la detección del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se utiliza el par de cebadores p35s-cf3/p35s-cr4, que rinde un fragmento de 123pb. Si la calidad de la PCR es correcta, el control positivo amplificará una banda de 123pb. Los controles negativo y sin plantilla no deben mostrar ninguna banda. Si los controles positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis de las muestras seleccionadas no es válido. Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra presenta una banda de 123pb, significa que la muestra contiene DNA modificado. PCR PARA LA DETECCIÓN DEL TERMINADOR nos Los cebadores HA-nos 118-f y HA-nos 118r se emplean en la detección del terminador nos (derivado de Agrobacterium tumefaciens), que está presente en la soja Roundup Ready y en otras líneas de plantas transgénicas como la línea de maíz Bt-11. La amplificación del terminador nos dará lugar a un fragmento de DNA de 118pb. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 25

26 Las características de los cebadores HA-nos 118-f y HA-nos 118r son las siguientes: HA-nos 118-f Secuencia GCATGACGTTATTTATGAGATGGG Longitud 24 Peso molecular (g/mol) 7462,8 Punto de fusión* (G/C) 56,2 HA-nos 118-r Secuencia GACACCGCGCGCGATAATTTATCC Longitud 24 Peso molecular (g/mol) 7296,9 Punto de fusión* (G/C) 61,2 Suponiendo que la [Na + ] sea de 50Mm Se emplearán: Control positivo: DNA de material de referencia (soja de la que un 0,5% es GM, soja Roundup Ready) Control negativo: DNA de material de referencia (soja de la que un 0% es GM) Control sin DNA molde: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua en lugar de DNA. Se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. El control positivo amplificará una banda de 118pb. Los controles negativo y sin molde no deben mostrar ninguna banda visible. Si estos dos últimos controles no dan los resultados esperados, el análisis mediante PCR no es válido. Si los controles muestran los resultados esperados y la muestra presenta una banda de 118pb, significa que dicha muestra contiene DNA modificado. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 26

27 EJEMPLO: PCR ESPECÍFICA PARA LA DETECCIÓN DE OGM Los cebadores de amplificación utilizados para la identificación de la soja Roundup Ready, el maíz Bt-176 y el maíz MON810 han sido elegidos por su capacidad para detectar, de manera específica, la estructura génica insertada en los genomas de dichas variedades. Las parejas de cebadores GMO9/GMO5 y GMO8/GMO7 fueron diseñadas para la detección específica del transgén de la soja Roundup Ready por PCR anidada. Los cebadores externos GMO9 y GMO5 son complementarios de la secuencia de DNA correspondiente al gen CP4 EPSPS y al promotor CaMV 35S. La amplificación del DNA con estos cebadores da lugar a un amplicón de 447pb. Los cebadores internos, GMO8 y GMO7, son complementarios del gen epsps de la petunia y del promotor CaMV 35S. La amplificación del DNA, en este caso, rinde un fragmento de 169pb. Las parejas de cebadores CRYIA1/CRYIA2 y CRYIA3/CRYIA4 se desarrollaron para la detección específica del gen cryia(b) sintético mediante PCR anidada presente en el maíz Bt-176. Los dos cebadores externos (CRYIA1/CRYIA2) delimitan un fragmento de 420pb, mientras que el par CRYIA3/CRYIA4 produce un fragmento de 189pb. Las parejas de cebadores GM1/GM2 y GM3/GM4 se diseñaron para la detección específica del casete del promotor E35S/ exón-intrón 1 de hsp70 mediante PCR anidada. Esta construcción génica es específica del maíz MON810. Los cebadores externos, GM1 y GM2, hibridan con la secuencia del promotor E35S y con la región del intrón 1 de hsp70, respectivamente. Los cebadores internos son complementarios, por su parte, de la secuencia de DNA del promotor E35S y de la región del exón 1 de hsp70, respectivamente. Los cebadores externos producen un fragmento de 401pb y los externos de 149pb. Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 27

28 7. CONSIDERACIONES ÉTICAS SOBRE LOS ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS En la actualidad se comercializan en todo el mundo casi un centenar de cultivos y alimentos a base de OGM, sobre todo en países como Argentina, Australia, Canadá y Estados Unidos. Desde el año 1995 en el que comenzó la plantación de cultivos de los OGM comercializados, se ha ido produciendo un incremento año tras año de la superficie cultivada con estas variedades. Los datos referidos al año 2003 indican que la superficie de cultivos transgénicos en el mundo se incrementó casi un 15% respecto al año anterior, cifrándose en torno a los 67.7 millones de hectáreas. Estos cultivos estaban presentes en 18 países, de lo que destacan Estados Unidos, Argentina, Canadá, Brasil, China y Sudáfrica (63, 21, 6, 4, 4 y 1% respectivamente del total). Se calcula que casi 7 millones de agricultores, el 85% de ellos en países del Tercer Mundo, cultivaron OGM. En el debate planteado sobre los vegetales transgénicos surge la pregunta de si son realmente necesarios en la agricultura y la alimentación. La necesidad de cultivar y consumir OGM está relacionada con los posibles riesgos o beneficios económicos ligados a su comercialización. Con frecuencia se afirma que los OGM son un negocio de las compañías multinacionales que monopolizan el mercado y esclavizan al agricultor con unas semillas más caras que deben necesariamente comprar campaña tras campaña. En la base de estas afirmaciones existe un fondo de realidad. Es cierto que la mayoría de los OGM producidos hasta el momento han sido desarrollados por multinacionales de la agroalimentación. Ejemplos de esta situación son el maíz Bt y la soja resistente al herbicida glifosato que se cultivan sobre todo en Estados Unidos y Argentina. Si los agricultores no compraran esas semillas muy probablemente comprarían otras convencionales a las mismas compañías multinacionales, ya que el mercado se encuentra cada vez más monopolizado. La respuesta a por qué los agricultores compran una semilla más cara es obvia, obtienen mayores beneficios por el incremento en la productividad. Existen, por supuesto, diferencias notables entre los países desarrollados y los del Tercer Mundo. Entre los primeros, Australia, Canadá y Estados Unidos han realizado una apuesta decidida por los OGM. En la Unión Europea, por el contrario existe una importante oposición al uso de los OGM en la agricultura y la alimentación según se Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 28

29 refleja en las encuestas realizadas. La situación en los países del Tercer Mundo es muy distinta. Sus problemas agroalimentarios son otros, una baja productividad por falta de plaguicidas y herbicidas, ataques post-cosecha y acusado déficit nutricional en aquellas zonas donde la base de la dieta es un único cultivo. Aún siendo importantes, estos problemas son menores en comparación con la falta de alimentos. El hambre es el gran problema de la alimentación de la población humana y, con frecuencia, se ha indicado que los OGM pueden ser la solución. Su solución precisa en primer lugar medidas sociales y políticas adecuadas. El hambre se da preferentemente en zonas del planeta muy concretas donde los niveles de organización social y política no son precisamente los deseables y donde la justicia social y la participación ciudadana están en niveles mínimos. Por tanto, sin la puesta en marcha de medidas estructurales adecuadas que cambien la situación de poco sirven los OGM. Si algún día llegan a darse esos cambios, los OGM podrán ser una herramienta más de gran valor. Mientras tanto no parece que haya duda de que los OGM puedan solventar los problemas de productividad y déficit nutricional. En este sentido ya existen ejemplos. Es necesaria una mayor implicación de los países desarrollados en la formación de científicos de países del Tercer Mundo en estos temas y que se involucren en la financiación de proyectos que impliquen soluciones a sus propios problemas. Países como India, Kenia o la República Popular China han hecho ya fuertes inversiones en Biotecnología alimentaria y los primeros OGM desarrollados comienzan a evaluarse o ya se están cultivando y comercializando. El debate sobre los riesgos económicos de los OGM no es sencillo, no ha sido estudiado con el rigor que merece y está muy ligado a presiones de tipo social y político. Sobre él pueden influir diversas variables como son, entre otras, la posición de la sociedad frente a estos desarrollos, la existencia de un tejido científico público y privado adecuado, o la competencia de otros países. A todo ello hay que sumar el problema de las patentes en biotecnología y su uso y abuso por parte de algunas compañías del sector agroalimentario. En cuanto a los aspectos puramente éticos del uso de los OGM en la agricultura y la alimentación, existe un amplio consenso en la comunidad científica en considerar que la aplicación de la Bbiotecnología puede ser muy beneficiosa tanto para los seres humanos como para el medio ambiente. Sin embargo, existe la conciencia de que con ella pueden plantearse grandes riesgos si la actividad biotecnológica no se atiene a principios y Curso de Experto Universitario en Biotecnología aplicada a los alimentos 29

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