Aproximación práctica al estudio del KRAS y otros biomarcadores. Javier Hernández Losa. 23-Mayo-2013

Transcripción

1 Aproximación práctica al estudio del KRAS y otros biomarcadores Javier Hernández Losa. 23-Mayo-2013

2 Fase Pre-analítica: Selección del material Evaluación, gestión y rentabiliad de la muestra S % % celularidad tumoral

3 Fase Pre-analítica: Selección del material Macrodisección A B Bloque NO tumoral Bloque TUMORAL C D

4 Fase Pre-analítica: Selección del material A B C A) Realizar 2-5 cortes a 5-10 µm en un microtomo, utilizándose cuchillas desechables para cada caso con el fin de evitar contaminaciones cruzadas B) Cada corte es recogido con ayuda de una aguja estéril e introducido en un tubo eppendorf estéril previamente rotulado Imagen cedida por el Dr. F. Lopez-Rios

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6 Que tipo de extracción de DNA uso? Kits disponibles de extracción de DNA

7 Técnica de Bolas Magneticas Técnica de columnas caotropicas Menor cantidad ADN Mayor calidad? No desparafinacion Mayor cantidad ADN Menor calidad? Necesidad desparafinacion

8 Que significa Calidad del ADN?

9 Que significa Calidad del ADN?

10 Determinaciones genericas de un ensayo de 180pb 50ng 0.39ng Caso 1 HPAC ng Bola Magnética Ct=30,19 Columna Ct =33.46

11 Determinaciones genericas de un ensayo de 180pb Caso 2 Caso 3 Bola Magnética Ct=30,2 Bola Magnética Ct=30 Columna Ct =36.2 Columna Ct =36.2 Caso 4 Caso 5 Bola Magnética Ct=29,2 Columna Ct =33,6 Bola Magnética Ct=30,19 Columna Ct =30.60

12 Comparativa de diferentes métodos de extracción de ADN Nº Copias (180 pb)

13 Determinaciones específicas de KRAS por Therascreen DNA_2241 DNA_2338 DNA_2443 Bola Magnètica G12V Ct=28 G12S Ct=30.6 G12S Ct=27.26 Columna G12V Ct=29 G12S Ct=33 G12S Ct=33.04

14 Determinaciones específicas de KRAS por Therascreen DNA_2236 DNA_2571 Bola Magnètica G12D Ct=30.4 G12V Ct=27 Columna G12D Ct=34.7 G12V Ct=29

15 Que metodología uso? Que necesito ver? Curso On-line Biomarcadores. Modulo 4

16 Resumen de Técnicas mas empleadas Curso On-line Biomarcadores. Modulo 4

17 Resumen de Técnicas mas empleadas en formato KIT Comercial RGQ PCR Kit Pyro Kit Strip Assay Amoy Dx Entrogen Genomica Cobas Tecnología Scorpions ARMS Pirosecuen. Hibridación Tiras DxARMS TaqMan Hibridación Array TaqHRM Sensibilidad % 3 5 1? Detección Codon/Mut BRAF BRAF BRAF No distingue

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19 therascreen PCR: tecnología ARMS-Scorpions Primers ARMS Primer ARMS Los primers ARMS hibridan en la posición mutada, y permiten a la Taq DNA polimerasa iniciar la reacción de PCR El primer ARMS se extiende en el DNA mutado Primer ARMS Los primers ARMS no hibridan con el DNA nativo El primer ARMS no se extiende en el DNA nativo

20 therascreen PCR: tecnología ARMS-Scorpions Primers ARMS Primer ARMS A G G C T C A G T C G Primer ARMS El primer ARMS se extiende en el DNA mutado

21 therascreen PCR: tecnología ARMS-Scorpions Primers ARMS A G G C X T C A C T C G El primer ARMS no se extiende en el DNA nativo

22 Visualización de KRAS en Rotor Gene Q

23 Visualización de KRAS en Rotor Gene Q Mayo determinaciones de KRAS 6 Resultados No valorable

24 Controles de Calidad Externos

25 Informes Ronda 5 SEAP (2012) Mediana = 99 Nº Laboratorios= 56 (43)

26 Resultados globales de las determinaciones Ronda 5 Control Calidad SEAP (2012)

27 Controles de Calidad Externos 105 Laboratorios participantes de 26 paises

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29 Año 2012

30 Nº Laboratorios= paises

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32 Normativa de calidad en el laboratorio

33 Normativa de calidad en el laboratorio

34 Normativa de calidad en el laboratorio Total ISO9001 ISO % Laboratorios. Ronda 5 Control Calidad SEAP (2012)

35 Conclusiones 1. Tener en cuenta las limitaciones y posteriores aplicaciones de las metodologías de extracción de ácidos nucleicos 2. Elegir un método de determinación que cumpla criterios de calidad (CE_IVD) 3. Participar en las rondas de control de calidad externas 4. Implementar normativas de calidad a los procedimientos que se realizan en los laboratorios de Patología Molecular

36 Muchas gracias por la atención