PCR Reacción n en cadena de la polimerasa Martes 16 de mayo

Transcripción

1 IV CURSO AVANZADO WHO GSS 2006 Buenos Aires de mayo de 2006 PCR Reacción n en cadena de la polimerasa Martes 16 de mayo Bioq. Elizabeth Miliwebsky Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología INEI ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán

2 Estructura del ADN

3 Azúcar desoxirribosa Nucleótido OH Grupo fosfato O P O O Adenina H2C 4 H 5 H 1 H H Base Nitrogenada Timina Guanina Citosina 3 OH 2 H

4 Estructura del DNA

5 Fundamento PCR r replicación enzimática de una cuencia específica de ADN se tiene un producto fácilmente tectable luego ciclos repetitivos polimerización

6 Etapas de la reacción Fragmento Gen Gen Gen Gen ADN blanco DNA blanco Desnaturalización (95ºC) Desnaturalización Pegado del primer (55º-65ºC) Polimerasa d-ntp Mg ++ Polimerización Polimerasa + dntp +Mg (72ºC) Productos de Ciclos

7 Acumulación exponencial de la secuencia blanco en el orden de: 2 n (n = número de ciclos)

8 Concentración de ADN blanco Número de ciclos

9 Componentes de la reacción Primers -ATP -GTP + ADN -CTP blanco -TTP Polimerasa Mg++ Producto de amplificación

10 ADN Blanco ongitud del fragmento a amplificar: 100 a 2000 pb uestra conteniendo el ADN blanco no necesariamente ebe estar altamente purificada. mpurezas que pueden interferir e inhibir la mplificación: hemo, heparina, agentes quelantes, etergentes, metales pesados, etc.

11 PRIMERS ligonucleótidos cortos de simple cadena: Longitud l nucleótidos lta afinidad con la secuencia de reconocimiento del blanco: extremo 3 de mayor complementariedad bos primers deben tener un contenido de G+C similar ja concentración de estos nucleótidos en el extremo 3 s extremos 3 de ambos primers no deben ser plementarios entre sí leccionar primers sin estructura secundaria porque ría interferir en la reacción.

12 Programas para diseño de primers ergen searches strings of amino acid residues in order to reverse-translate onucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of eneracies. er (Stanford) Sun Sparcstations only er (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it) plify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and ulating experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can ain your copy of Amplify here erdesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide bes. See also the PrimerDesign Welcome Page. -Rare, a new software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini he primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh Windows environment. er Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO. DEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments cal mirror site at WIS). er3, an online service to pick PCR primers from nucleotide sequence. (Local ror site at WIS).

13 Magnesio s indispensable para la actividad de la enzima y cta el apareamiento de los primers Desoxiribonucleótidos (dntps) n requeridos en concentraciones óptimas para dar ecificidad y fidelidad a la reacción

14 Buffer de reacción l buffer recomendado es 10 a 50 mm Tris-HCl 8.3 a 8.9) l aumento de la concentración de Tris-HCl, o el ento del ph, puede aumentar la formación de ductos inespecíficos de PCR

15 DNA polimerasa q polimerasa (Thermus aquaticus) A polimerasa termoestable y termoactiva ne actividad polimerasa y exonucleasa 5-3 ctividad enzimática: Vida media 40 a 95ºc mperatura óptima de polimerización: 72ºC mp. > 96ºC inactivación de la enzima

16 DNA polimerasas termoestables fel : es más estable, actúa sobre DNA blanco rico en (Thermus thermophilus): tiene actividad de criptasa reversa t DNA polimerasa (Thermococcus litoralis): Tpo vida util 100ºC (Pirococcus furiosus):tiene un porcentaje bajo de oración errónea de nucleótidos

17 Procedimiento Preparación de la muestra de ADN Preparación de la mezcla de reacción Programa de amplificación Electroforesis de los productos de

18 Preparación de la muestra de ADN Bacteria Genoma bacteriano Aislamiento bacteriano.. Extracción del DNA Método físico -químico Hervir +detergente Espécimen clínico, alimento Tratamiento para eliminar inhibidores

19 reparación de la mezcla de reacción Par de primers específicos ADN templado Buffer p/ ADN Pol. MgCl ADN Polimerasa termoestable 6 dctp datp 1 dh 2 O estéril

20 reparación de la mezcla de reacción Reactivos Buffer dntp (d-atp, d-gtp, d-ctp, d-ttp) Cl2Mg Primers Taq polimerasa DNA Blanco Vol Total Rangos de Concentración recomendados * 1X µm mm µm 1-5 U µg ml s de concentración de los reactivos en la mezcla de reacción recomendados en la afía. La concentración de trabajo de cada reactivo se ajusta de acuerdo a la

21 Amplificación Variación de temperatura durante un ciclo de PCR Temper atura ºC Desn atu ra lización Extensión Pegado de primers 30

22 Desnaturalización a temperatura de desnaturalización recomendada para urar una completa separación de las cadenas es de 94-95ºC l tiempo va a depender de la secuencia y contenido de G+C ajas temperaturas ltas temperaturas desnaturalización incompleta inactivación de la enzima

23 Pegado de Primers o Annealing ende de la composición de bases, tamaño y ntración del primer peratura de pegado de primers o annealing (Ta): )+2(A+T) peratura generalmente usadas: 55 a 65ºC peratura de annealing astringentes aumentan la ificidad de la reacción as temperaturas amplificación de fragmentos

24 ra períodos largos de extensión es necesario porar gelatina o seroalbúmina bovina al buffer acción para estabilizar la enzima. Polimerización o Extensión se utiliza la Taq la temperatura de extensión a es 72ºC tiempo de extensión depende de la entración, del tamaño de la secuencia del ADN o.

25 CICLADOR TERMICO

26 Electroforesis de los productos de amplificación Cuba electroforética - Gel + Fuente BrEt + Luz UV _

27 Electroforesis de los productos de amplificación

28 Identificación del producto de amplificación Molécula BrEt BrEt Mol. de BrEt intercalada

29 Identificación del producto de amplificación

30 Factores que influyen en la sensibilidad de la técnica ajas concentraciones de reactivos Temp. de annealing Temp. de extensión Se obtiene bajo rendimiento A temp. altas no se pegan los primers Se debe seleccionar la óptima para la enzima utilizada Temp. de desnaturalización Impurezas del DNA posibles inhibidores Primers concentración, ilución y conservación nzima polimerasa Si se requieren temp. altas se debe seleccionar una enzima estable a esa temperatura y se recomienda la utilización de cosolventes Se requiere la purificación del DNA blanco Se deben preparar soluciones estables que no inhiban la reacción. Conservar a 20C. Fragmentos largos o complejos requieren de la estabilización de la enzima para que mantenga la actividad. Nucleótidos Evitar concentraciones altas que inhiben a la

31 n altas concentraciones de nucleótidos ctores que influyen en la especificidad de la técnica ltas concentraciones de reactivos aja temperatura de annealing Se producen productos inespecíficos aja temperatura de extensión

32 Estandarización justar temperatura de pegado de rimers justar la concentración de cada uno de os componentes de la reacción anteniendo constante la de los demás eactivos ener en cuenta que la reacción es muy ensible a la concentración de Cl 2 Mg y a

33 Estandarización Cl 2 Mg 1 mm 1,25 mm 1,5 mm

34 Estandarización ecificidad Prueba con cepas de referencia Prueba con cepas autóctonas de igual especie Prueba con cepas de otras especies

35 nconvenientes de la reacción Contaminación cruzada entre especímenes Contaminación de un cultivo a un espécimen Contaminación por el producto amplificado

36 Laboratorio de PCR reas de Trabajo Reactivos y preparación de la mezcla Espécimen, cultivo y extracción de DNA Amplificación Detección de productos de amplificación

37 Laboratorio para PCR Preparación de Reactivos Preparación de Muestras Area de Amplificación Análisis de Productos Antecámara Antecámara Antecámara Pasillo

38 Laboratorio de PCR rea de reactivos Preparación de una mezcla general Agregar la enzima en último lugar Tips con filtros y pipetas para reactivos Centrifugar previamente los reactivos Cerrar cada tubo después de su uso

39 Area de reactivos

40 Laboratorio de PCR Area de preparación de la muestra Extracción de DNA Utilizar pipetas para DNA Precaución de no producir aerosoles Ajustar las tapas de los tubos de PCR

41 Area de preparación de la muestra Extracción de DNA

42 Descontaminación Hipoclorito de sodio 10% Superficies inertes Luz UV nm 10 minutos

43 Tipos de PCR aplicadas al diagnóstico Multiplex- PCR Identificación de diferentes fragmentos en una misma reacción Nested-PCR Dos rounds de amplificación

44 ltiplex-pcr stx1 / stx2 / rfb O157 cias D. R.; Johnson, W. M.; Lior, H.; Tyler, S. D. and Rozee K. R.. Rapid and specific of verotoxin genes in Escherichia coli by the polimerase chain reaction. J. Clin. l.1990, 28:540-5.

45 ltiplex-pcr stx1 / stx2 / rfb O157 Primer Stx1a Stx1b Stx2a Stx2b O157F O157R Secuencia del primer (5-3 ) GAAGAGTCCGTGGGATTACG AGCGATGCAGCTATTAATAA TTAACCACACCCCACCGGGCAGT GCTCTGGATGCATCTCTGGT CGGACATCCATGTGATATGG TTGCCTATGTACAGCTAATCC Tamaño del fragmento de amplificación (pb) Cepas de referencia Control E. coli EDL933, O157:H7 Stx1/Stx2 E. coli ATCC sin factores de virulencia Positivo Negativo

46 ltiplex-pcr stx1 / stx2 / rfb O157 Reactivo Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) fer 10X 1X 5 zcla dntp 2,5 mm 0,1 mm 2 g 25 mm 1,5 mm 3 er stx1a 0,1 nmol/µl 2 pmol/µl 1 er stx1b 0,1 nmol/µl 2 pmol/µl 1 er stx2a 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2 er stx2b 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2 er O157F 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3 er O157R 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3 polimerasa 5 U/µl 0,02 U/µl 0,2 plado 2 ddd 34.8

47 ltiplex-pcr stx1 / stx2 / rfb O157 Programa de amplificación aso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo Va al paso Nº Nº veces 1 Desnaturalización 94 5 min 2 Desnaturalización seg 3 Pegado de primers ó Annealing seg 4 Extensión seg Extensión 72 2 min

48 ia PCR Enterohemolisina MER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5-3 ) ya1 GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG ya4 TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA TAMAÑO FRAGMENTO 1551

49 PCR Enterohemolisina Cepas de referencia Control E. coli E32511 Positivo E. coli ATCC sin factores de virulencia Negativo Reactivo Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) Buffer 10X 1X 5 Mezcla dntp 2,5 mm 0,1 mm 2 Cl 2 Mg 25 mm 1,5 mm 3 Primer hlya1 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2 Primer hlya4 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2 Taq polimerasa 5 U/µl 0,03 U/µl 0,2 Templado 2 H 2 O ddd 37,4

50 PCR Enterohemolisina Programa de amplificación Paso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo Va al paso Nº Nº veces 1 Desnaturalización 94 5 min 2 Desnaturalización seg 3 Pegado de primers ó annealing seg 4 Extensión seg Extensión 72 3min 6 Pausa 4

51 Factor eae ER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5-3 ) TAMAÑO FRAGMENTO pb 1 2 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG 864 ia

52 Factor eae Cepas de referencia Control E. coli 2348/69 (EPEC) E. coli E32511 (STEC) E. coli ATCC sin factores de virulencia Positivo Positivo Negativo Reactivo Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) Buffer 10X 1X 5 Mezcla dntp 2,5 mm 0,1 Mm 2 Cl 2 Mg 25 mm 1 mm 2 Primer SK1 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/ul 0,2 Primer SK2 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/ul 0,2 Taq polimerasa 5 U/ul 0,02 U/ul 0,2 Templado 2

53 PCR Factor eae Programa de amplificación Paso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo Va al paso Nº Nº veces 1 Desnaturalización 94 5 min 2 Desnaturalización seg 3 Pegado de primers ó annealing 54 1 min 4 Extensión 72 2 min Extensión 72 2 min

54 ia flic H7 ER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5-3 ) TAMAÑO FRAGMENTO Pb 7-F 7-R GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC 625

55 CR flic H7 Cepas de referencia E. coli EDL933, O157:H7 E. coli ATCC sin factores de virulencia Control Positivo Negativo Reactivo Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) Buffer 10X 1X 5 Mezcla dntp 2,5 mm 0,15 mm 3 Cl 2 Mg 25 mm 1,5 mm 3 Primer FLICH7-F 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3 Primer FLICH7-R 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3 Taq polimerasa 5 U/µl 0,02 U/µl 0,2 Templado 2

56 6 Pausa 4 PCR flic H7 Programa de amplificación Paso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo Va al paso Nº Nº veces 1 Desnaturalización 94 1 min 2 Desnaturalización seg 3 Pegado de primers ó annealing seg 4 Extensión seg Extensión 72 5 min

57 Muchas gracias!!!!!!!