INSEMINACIÓN ARTIFICIAL INTRODUCCIÓN

Transcripción

1 INSEMINACIÓN ARTIFICIAL INTRODUCCIÓN La Inseminación Artificial (IA) consiste en depositar el semen por vía instrumental en el útero de una hembra antes de que ocurra la ovulación. El semen, recogido mediante el uso de una vagina artificial o por electroeyaculador, es diluido, congelado o no, y depositado en el cuerpo del útero por vía vagino-cervical. De esta forma, el producto de una sola eyaculación puede servir para la inseminación de un número elevado de hembras permitiendo multiplicar considerablemente la capacidad reproductora de los machos y constituyendo un poderoso medio de mejora genética y de selección. Representa también un medio eficaz de lucha contra las enfermedades venéreas. 1

2 OBJETIVOS 1. Comprender la importancia de la temperatura durante el manejo del semen congelado para evitar producir daños en las células espermáticas por crecimiento de los cristales intracelulares 2. Relacionar los conocimientos de transporte espermático y sitio de deposición del semen para comprender su influencia en la eficiencia de la técnica. 3. Discutir la importancia de cada etapa del descongelado, siembra del semen y del re entrenamiento de los inseminadores para mejorar los índices de preñez. 4. Comprender la necesidad de que se realice una identificación correcta de la hembra bovina en celo para su inseminación. 5. Analizar los distintos factores que llevan a error en su diagnóstico, incluyendo los aspectos que tienen que ver con el conocimiento de los signos primarios y secundarios del celo. 6. Revisar los distintos métodos y/o dispositivos disponibles en la actualidad como elementos de ayuda en la detección correcta del celo y del momento adecuado de inseminación. 2

3 CONTENIDOS 1. TÉCNICA DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL 1.1. Almacenamiento del semen Descongelamiento del semen Procedimiento de Inseminación Sitio de deposición del semen Evaluación de semen Congelado. 2. NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA EL MANEJO DE LA DETECCIÓN DE CELO Estro y Ciclo Estral Qué ocasiona el celo y los signos de celo? Características del celo Bovino Qué afecta la expresión del celo? Cuándo las vacas comienzan a ciclar y a mostrar signos de celo después del parto? 2.2. Momento de la IA 2.3. Detección de celo Diferentes aspectos de la detección del celo Cómo debe detectarse celo? 2.4. Utilización de Dispositivos que ayudan en la detección del celo Formas No Automáticas de detectar el estro y periestro Métodos automáticos y telemétricos para detectar el momento de inseminación. 3

4 BIBLIOGRAFÍA BÁSICA UTILIZADA Barth AD, Oko RJ. Abnormal Morphology of Bovine Spermatozoa. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, Bailey T, Nebel R and Walker W. New technology for managing heat detection. Britt JH, Scott RG, Armstrong JD, Whitacre MD. Determinants of estrus behavior in lactating Holstein Cows. J. Dairy SC, 1986; 69:2195. Hawk HW. Transport and Fate of Spermatozoa After Insemination of Cattle. J. of Dairy Sci 1987; Kastelic JP. Conceptos actuales en la detección de celos en bovinos. Resumes Cuarto Simposio Internacional de Reproducción Animal, Huerta Grande, Córdoba, Argentina 2001; Lefebvre ER. Manejo de semen y Termos. Técnicas de descongelación y siembra de semen a campo. CABBIA 1988; 14: Lehrer AR, Lewis GS and Aizinbud E. Estrus detection in cattle: recent developments. Symposium 9, Cattle fertility problems, An Reprod Sci 1992; 28:355. Saacke RG, Nadir S, Dalton J, Nebel RL and Bame J. Involvement of the bull and inseminate in fertility and embryo quality. American Embryo Transfer Association. Proc 13th Annual Convention. 1994; Senger PL. The estrus detection problem: New concepts, technologies and possibilities. J Dairy Sci 1994; 77:2745. Saacke RG, Dalton JC, Nadir S, Nebel RL, Bame JH. Relationship of seminal traits and insemination time to fertilization rate and embryo quality. Anim Reprod Sci 60-61; 2000:

5 1. TÉCNICA DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Se tienen noticias de que la Inseminación Artificial fue utilizada por los árabes en el siglo XIV, pero los primeros datos de utilización de la técnica aparecen en El fisiólogo italiano Lázaro Spallanzani, inyectó en la vagina de una perra en celo esperma recogido directamente del macho y esta parió tres cachorros. Datos de la aplicación de la inseminación artificial en grandes animales aparecen en 1890 cuando Repiquet en Francia y Hoffman en Alemania, la aplican con éxito en la yegua. Los datos de aplicación en la ganadería comienzan con la escuela rusa. Elie Ivanov comienza aplicándola en la yegua y obtiene en 1912, 31 concepciones de 39 yeguas inseminadas y continúa aplicándola en ganado vacuno y ovino. Con sus colaboradores, Ivanov pone a punto la vagina artificial y publica estudios de fisiología del esperma. Pero el gran impulso de la IA se inicia después de la segunda guerra mundial, cuando el método es adoptado y aplicado en todo el mundo y se comienzan con la prácticas de congelado del semen. La Inseminación Artificial es la técnica más importante creada para el mejoramiento genético de animales. Unos pocos machos altamente seleccionados producen suficientes espermatozoides para inseminar miles de hembras al año, mientras que cada hembra seleccionada puede producir relativamente poca progenie, incluso mediante transferencia de embriones. La gran mejora genética lograda por IA en ganado lechero se debe al uso de toros de calidad probada. Los toros jóvenes son seleccionados cuidadosamente durante la prueba de progenie y a los sobresalientes se les colecta semen para inseminar los rodeos. Es importante realizar una preparación, colecta y procesamiento adecuado del semen para preservar la máxima cantidad de espermatozoides viables de cada toro. El desarrollo de la IA en ganado de carne ha sido más lento debido a problemas de detección del estro y de manejo de grandes rodeos. Pero las nuevas técnicas de sincronización del celo y la ovulación están ayudando a la difusión de la técnica en estos rodeos. La técnica de IA consiste en introducir una mano en el recto de la hembra para poder fijar el cuello uterino y con la otra mano manipular un pistolette o una pipeta introducida en la vagina para pasar a través del canal cervical y depositar el semen en el cuerpo del útero. Frecuentemente la baja fertilidad observada en trabajos de IA con semen congelado se debe al mal manejo del semen por parte del inseminador, así como la siembra fuera del lugar adecuado. Se debe tener cuidado cuando se maneja el semen congelado, pequeños aumentos de temperatura producirán graves daños a los espermatozoides por recristalización del líquido intracelular y las lesiones por la reiteración de estos aumentos de temperatura serán acumulativas. Por otro lado, debemos recordar que el 96 % de los espermatozoides depositados en el cuerpo del útero estará en la vagina pocas horas después de la siembra, por lo que pequeñas variaciones en el lugar de deposición pueden afectar en gran medida los porcentajes 5

6 de preñez. En este punto describiremos estos factores y daremos algunos consejos prácticos para realizar la técnica en forma satisfactoria Almacenamiento del semen. Como es de amplio conocimiento en biología, el factor clave para la preservación de las gametas por largo tiempo es la baja temperatura. En el caso del semen, la temperatura de almacenamiento debe mantenerse todo el tiempo por debajo de -130 C para conservar el máximo de fertilidad. Sin embargo durante la transferencia del semen entre termos y la manipulación de los canastillos, se expone el semen a temperaturas mayores. Además, en el campo suelen ocurrir gravísimas variaciones en la temperatura de almacenaje debido a bajo nivel del Nitrógeno en el termo por descuido del personal responsable y por exposiciones inadecuadas del semen en la boca del termo deteriorando la calidad seminal con el consiguiente efecto inmediato y acumulativo. En la Figura 1 se encuentran indicadas las relaciones de temperaturas existentes en la boca del termo de N 2 líquido. La temperatura del semen aumenta rápidamente cuando se expone a temperatura ambiente y el porcentaje de ese calentamiento tiene que ver con la relación volúmensuperficie de la dosis por lo que las pajuelas serán muy vulnerables a estos cambios de temperatura. En la Figura 2 podemos ver los resultados de un experimento en el que se expuso distintos tipos de pajuelas a temperaturas ambiente simulando las temperaturas de exposición durante la manipulación del semen en la boca del termo. Figura 1. Rango de temperaturas en la boca de un termo (Adaptado de Lafebvre, 1988) 6

7 Figura 2. Temperatura del semen dentro de pajuelas sostenidas por fórceps, o de ámpulas sostenidas a los canastillos metálicos durante la exposición a temperatura ambiente (20± 0.6 C) Cada curva representa la media de cinco réplicas (Adaptado de Berndtson, 1976;1). El almacenamiento de las pajuelas en gobelets de plástico reduce el rango de cambio de temperaturas. Otro detalle importante para minimizar estos cambios es mantener los gobelets con nitrógeno liquido (N 2 ) durante la manipulación. La Figura 3 muestra que la exposición por medio minuto en esta condición no afectará al semen, sin embargo se debe tener claro que si la temperatura del semen supera los -130 C éste comenzará a sufrir daño debido al crecimiento de los cristales formados durante la congelación. Este fenómeno es conocido como recristalización y produce daño irreversible en los espermatozoides. Una recomendación práctica que surge de estos datos es que siempre se debe manipular el semen dentro del termo lo más rápido posible protegiéndolo del viento y del sol. Algunas veces debemos realizar varias inseminaciones por lo que se levanta el canastillo repetidamente. Durante este procedimiento el semen se expone varias veces a temperatura ambiente durante cortos períodos. Pickett et al., realizo un experimento durante el cual midió la temperatura del semen durante la manipulación del canastillo y observo que aunque el semen esté en contacto con N tiempo suficiente como para que vuelva a enfriarse (-196 C), en cada nueva exposición del semen a temperatura ambiente éste alcanza temperaturas mayores (Figura 3). Además si el nivel de N es bajo, el tiempo requerido para alcanzar nuevamente los C será más de 10 minutos. 7

8 Bajo nivel de N2 Temperatura Termo lleno Minutos Figura 3. Influencia del nivel de N en la temperatura del semen dentro de pajuelas francesas de 0.5 ml, durante exposiciones repetidas en el cuello del termo (5 pajuelas/gobelets) (Adaptado de Pickett, 1976; 11) 1.2. Descongelamiento del semen. Las mayores diferencias de los inseminadores en el manejo del semen se producen durante la descongelación. Se recomienda protocolos muy variados: agua a 35 a 37 C, agua a 5 C, ambos con tiempos variables de exposición, colocarlo en el bolsillo para que llegue a temperatura corporal (se ha demostrado que nunca llega a temperatura corporal), colocarlo en la vaginal de la vaca, etc. Sin embargo muchos de ellos son inadecuados y no resultan en una fertilidad aceptable. Para la selección del método de descongelado más práctico hay que primeramente tener en cuenta la fertilidad resultante para continuar con otros aspectos como facilidad de uso, tiempo y equipo requerido y la habilidad necesaria por parte del inseminador para repetir con precisión rutinaria el procedimiento. En un experimento realizado por Barth et al., se evaluaron distintos métodos de descongelación de semen para encontrar un método simple y óptimo de descongelado. Para esto se utilizó semen congelado con distintos medios y en ampollas de 1 ml o pajuelas de 0,5 ml. Los resultados mostraron que el baño a 35 C fue el mejor método para ambos tipos de envases. También comparó distintos tiempos de exposición a esta temperatura. En un principio se habían realizado distintos experimentos comparando temperatura y tiempo de descongelado pero se comprobó que el semen después de exponerlo durante 12 segundos a 37 C solamente alcanzaba 0 C por lo que sufría shock térmico y consecuentemente pérdidas de motilidad, de actividad metabólica, capacidad fertilizante y lesión de la membrana plasmática. Barth en su experimento concluyó que luego de 30 segundos de exposición a 35 C el semen llegaba a 30 C y no sufría shock térmico. 8

9 En otro experimento realizado por Senger et al., se descongelaron pajuelas de 0,5 ml a dos temperaturas (5 y 35 C) para luego exponerlos a diferentes temperaturas (imitando distintas posibilidades de temperatura ambiente) entre los que tenemos 1 C, 20 C y 37 C. Como se puede ver en la Tabla 1 los mejores resultados, expresados en motilidad espermática e integridad del acrosoma fue con 35 C y luego mantenidos entre 37 C y 20 C. Por lo tanto si no hay una temperatura ambiente muy baja, no hay peligro de que ocurra un efecto adverso, siempre y cuando se realice la IA rápidamente. Tabla 1. Efecto del shock térmico post-descongelamiento sobre la motilidad y la integridad acrosómica (Paj 0,5, 5 y 35 C) (16). Temperatura ( C) Descongelamiento Temperatura ( C) post descongelamiento Porcentaje medio luego de 8 horas de incubación a 37 C Motilidad Acrosomas íntegros b 38 a b 39 a ab 31 b c 47 c a 30 b c 49 c En base a estos resultados podemos concluir que para pajuelas es recomendable utilizar agua a C durante 30 segundos y para pastillas aumentar el tiempo a 1 minuto. Además se recomienda mantener el semen en el mismo baño a 35 C hasta el momento de la inseminación que debe realizarse dentro de los 15 minutos de descongelado. A partir de este momento la integridad del acrosoma y la motilidad comenzarán a disminuir. Un factor a tener en cuenta cuando se trabaja a campo con muy bajas temperaturas es la posibilidad de producir shock térmico por la diferencia de temperatura de descongelado y la temperatura ambiente. El semen debe protegerse desde el descongelado y durante el traslado desde el lugar de descongelamiento hasta la vaca. Aunque el semen sea de morfología normal, el porcentaje de preñez puede ser afectado por el número de espermatozoides por dosis de semen. Los primeros estudios realizados sobre la relación de concentración de células en la dosis y porcentajes de no retorno al estro sugirieron que aumentando la concentración, aumentaba el porcentaje de no retorno. Sullivan (21) mostró que los toros responden en forma diferente al cambio en la concentración. En un experimento, se dividieron los toros en grupos por nivel de fertilidad de acuerdo al porcentaje de no retorno (bajo: 72,6%; medio: 75,4% y alto: 77,9%). Cuando aumentó progresivamente la concentración de células mótiles en las ampollas de 5 a 10 millones hubo un beneficio en los grupos de menor fertilidad, pero no se pudo explicar la disminución del porcentaje de no retorno del grupo de mayor fertilidad (Figura 4). 9

10 Porcentaje de no-retorno días Espermatozoides con motilidad progresiva (x10 6 /ml) Toro de fertilidad baja Toro de fertilidad media Toro de fertilidad alta Promedio Figura 4: Relación entre el porcentaje de no retorno y la concentración de células mótiles en toros Holstein de distinta fertilidad (Adaptado de Sullivan, 1970; 21 ). De estos resultados podemos concluir que la dosis de semen para la mayoría de los toros debe contener al menos 10 millones de células mótiles después del descongelado y que los toros con fertilidad menor al nivel medio tendrán un beneficio si se aumenta la concentración a 15 millones o más de células mótiles por dosis. Otra recomendación importante al descongelar una pajuela de semen es secar bien el envase. Una pequeña gota de agua puede producir shock osmótico a los espermatozoides dañándoles irreversiblemente. Es muy raro encontrar una pajuela rota, pero si esto sucediera, el contenido debe ser descartado Procedimiento de Inseminación. Una vez que se ha identificado la hembra en celo se debe constatar que esté debidamente señalada (caravana-tatuaje) y perfectamente inmovilizada. Se debe lavar bien la zona del recto y vulva con agua, luego secar con toallas de papel para evitar contaminación y contacto de la punta del pistolette o pipeta con agua. Ésta se debe introducir abriendo los labios de la vulva con un ángulo de 45º y la punta del pistolette hacia el techo de la vagina hasta que haga tope (20 a 25 cm.). Luego se introduce la mano enguantada y lubricada por el recto para no producir daños (utilizar lubricante no irritante), se toma el cuello uterino llevándolo hacia adelante para evitar la formación de pliegues en la vagina que puedan dificultar la franca llegada del pistolette al canal cervical. Una vez que la punta del pistolette se encuentra tocando el cervix se debe tratar de introducirlo en la luz del canal cervical y luego realizando movimientos del cuello uterino se irá pasando a través del cervix hasta llegar al cuerpo del útero donde se debe realizar la siembra. Para comprobar que la punta del pistolette pasó el cuello uterino debemos tocar la misma con el dedo índice de la mano que tenemos sujetando el cervix por delante de éste y casi llegando a la bifurcación de los 10

11 cuernos uterinos. Si tenemos dudas de la ubicación es mejor sembrar dentro de uno de los cuernos que sembrar en zona no definida. Algunas veces el inseminador tiene que manejar un grupo de animales que fue sincronizado, por lo que tiene que inseminar todos al mismo tiempo. En estos casos es muy importante, antes de comenzar a trabajar, identificar el semen a utilizar en cada hembra, y tener preparado el material necesario. Es muy importante ser organizado y mantener la higiene para cumplir con todas las normas de manipulación del semen en el paso del termo a la vaca, evitando el shock térmico y la contaminación seminal. En los casos en que se inseminan muchos animales al mismo tiempo es necesario un ayudante que vaya descongelando, lo que permite mayor precisión y seguridad en cada paso Sitio de deposición del semen. El proceso de transporte espermático en el tracto femenino tiene una fase rápida y otra fase prolongada del transporte. En la primera, los mecanismos fisiológicos del tracto femenino transportan los espermios hasta el oviducto sin la participación activa de éstos. Durante la fase prolongada los espermatozoides pueden permanecer hasta 18 h en la región caudal del istmo del oviducto para luego avanzar hasta el sitio de fertilización cerca de la unión del istmo con la ámpula. También se mencionó que sólo una pequeña porción del esperma depositado en vacas llega al sitio de fertilización ya que la mayor parte de ellos es fagocitada o eliminada al exterior junto con el mucus cervical (Figura 5) Figura 5. Esquema que resume el trabajo de muchos laboratorios que muestran las principales barreras al transporte del semen en el tracto femenino. (Adaptado de Saake, 1982; 13) Se han realizado varios trabajos que muestran la distribución del semen luego de la deposición en el cuerpo del útero. En la Tabla 2 se muestran los resultados de un experimento realizado por Suga y Higaki (17) en el que se depositó 300 millones de espermatozoides en el cuerpo del útero de vacas lecheras. Luego se recogió el tracto reproductivo completo en el matadero para verificar la distribución los espermatozoides. Los resultados mostraron que entre 30 y 60 minutos después de la IA la mayoría de los espermatozoides fueron recuperados de la vagina y cervix y que sólo unos cuantos cientos fueron recuperados del útero. 11

12 Tabla 2. Recuperación de espermatozoides desde el tracto reproductivo de vacas lecheras después de inseminación en el cuerpo del útero. (Adaptado de Suga y Higaki, 1971; 17). Tiempo desde IA N de espermatozoides recuperados 2 Vagina Cervix Útero Oviductos (h:min) 1 (10 6 ) (10 3 ) (10 3 ) 0:03-0: ,000 30,000 0:30-0: :00-2: :00-3: :00-5: Tres vacas en cada momento después de la inseminación. 2 Inseminación por vaca: aproximadamente 300 millones de espermatozoides. Otros estudios también demostraron el movimiento retrógrado de los espermatozoides. Los resultados de Larsson y Larsson (6) mostraron que dos horas después de la deposición del semen en el cuerpo del útero, pudieron recuperar el 14,6 % del total del semen y que el 98,5 % de ese semen recuperado estaba en la vagina y cervix. A 12 h pos IA recuperaron el 0,6 % de lo inseminado y de esto, el 73,7 % estaba en vagina y cervix. Dobrowolski y Hafez (3) realizaron otro experimento con vacas Hereford en el cual depositaron millones de espermatozoides y realizaron necropsia de las vacas 1, 8 o 24 h pos IA. Del total de espermatozoides depositados en el cuerpo del útero, sólo el 13,4 % se recuperó 1 hora más tarde, el 3.8 % a 8 h y el 0,9 % a las 24 h en el útero. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Espermatozoides recuperados desde el tracto reproductivo de vaquillonas Hereford (Dobrowolski, 1990; 3) Número de espermatozoides recuperados 2 Tiempo totales % Vagina Cervix Útero Unión útero Oviductos desde IA tubárica (h) 1 (10 6 ) (%) (10 6 ) (10 6 ) (10 6 ) (10 3 ) (10 3 ) Cinco vacas en cada intervalo de tiempo 2 Inseminado por vaca: 2 billones de espermatozoides Si tenemos en cuenta que una dosis de semen para IA tiene entre 10 y 30 millones de espermatozoides, luego de 24 horas de la inseminación se encontrará en el útero entre y espermatozoides. Además del movimiento retrógrado normal de los espermatozoides, debemos sumarle la pérdida producida por la manipulación y deposición. Una estimación de estas pérdidas están indicadas en la Tabla 4. 12

13 Tabla 4. Espermatozoides recuperados y perdidos de vacas dentro de 12 horas de inseminadas en el cuerpo del útero. (Adaptado de Mitchel 1985, 9) Espermatozoides recuperados Total mucus descargado mucus aspirado orina equipamiento tracto reproductivo Número, % Aparentemente los espermatozoides transportados a los oviductos rápidamente después de la IA, no están involucrados en la fertilización. Se realizó un experimento en el cual se sirvió un grupo de vacas temprano en el celo y se ligó el oviducto en diferentes momentos post servicio. Cuando se ligó el oviducto 6 h después del servicio, sólo 1 de 11 ovocitos recuperados resultó fertilizado; cuando se ligó a las 8 o 10 h post servicio, la fertilización llegó al 40 % y cuando se ligó a las 12 h post servicio el porcentaje de fertilización fue del 70 %. Los resultados, indicados en la Tabla 5, mostraron que los espermatozoides que entran al oviducto rápido después del servicio no permanecen en el mismo, o si está presente en el momento de la ovulación, no son capaces de fertilizar el ovocito. Tabla 5. Porcentaje de fertilización después de ligar y seccionar el istmo de vaquillonas después del servicio (Adaptado de Wilmut, 1984, 19) Intervalo del servicio a Ovocitos la ligadura Recuperados Fertilizados (h) (N) (N) (%) Estos resultados demuestran que los espermatozoides capaces de fertilizar alcanzan el oviducto cerca de 8 h después del servicio y es almacenado en el istmo del oviducto por 18 h o más hasta el momento de la ovulación. Considerando el gran porcentaje de pérdida de espermatozoides a través del cervix se postuló que si la deposición del semen se hacía más profundo en el tracto reproductivo, esto podría mejorar la fertilidad. Distintos experimentos dieron resultados contradictorios. Senger (15) reportó un incremento de la fertilidad cuando realizó inseminación en ambos cuernos. También Zavos (20) reportó mejor fertilidad. Sin embargo, Marshall (8) mostró un leve efecto negativo (54 vs 50 %). Un aporte valioso fue el trabajo de Larsson (5) que demostró la migración transuterina después de la IA en vaquillonas recuperando espermatozoides en el cuerno uterino opuesto al que había realizado la siembra siendo capaces de fertilizar ovocitos de ambos ovarios. En este experimento se re-entrenaron inseminadores para 13

14 depositar el semen a uno u otro cuerno uterino. La primera observación fue que muchos inseminadores que decían depositar el semen en el cuerpo del útero, lo hacían en realidad en el cervix y luego de ser entrenados para depositar el semen en el cuerno uterino aumentaron los índices de preñez. Por lo tanto la conclusión más importante de este trabajo fue que los inseminadores mejoraron su porcentaje de preñez cuando fueron re-entrenados y depositaron el semen en el útero en lugar del cervix. De los experimentos anteriores no se obtuvieron conclusiones concretas. Peters (10) y Swain (18) demostraron a través de técnicas radiográficas que cuando se piensa que se deposita el semen en el cuerpo del útero, en realidad entre un 23 % y 25 % de las veces, la siembra se realiza en el último tramo del cervix. (Tabla 6). Tabla 6. Ubicación de la punta de la pipeta en distintas zonas del tracto reproductivo de la vaca. (Adaptado de Senger, 1991, 14) Lugar anatómico ubicación de la punta de la pipeta de 40 inseminadores (%) n= 586 a ubicación de la punta de la pipeta de 70 inseminadores (%) n= 376 b Cervix Cuerpo del útero Cuerno izquierdo Cuerno derecho a Peters et al., 1984 b Swain et al., 1986 Gallager y Senger (Figura 6 y 7; 4) demostraron a través de recolección de material vaginal que no existen diferencias en la eliminación de espermatozoides cuando la siembra se realiza en cuernos o en el cuerpo del útero. Pero sí que hay diferencias significativas cuando se toman los mismos tipos de muestras comparando siembra en los cuernos con siembra en el cervix. Esta mayor pérdida de espermatozoides sería la causa de una menor fertilidad. Esto indica que es muy importante adiestrar o re-adiestrar a los inseminadores y/o veterinarios para que estén seguros de que están sembrando en el cuerpo del útero y no el último tramo del cervix. 14

15 % acumulado de espermatozoides recuperados Cuernos Cuerpo del útero Horas después de la IA Figura 6. Porcentajes de espermatozoides recuperados con muestras de mucus vaginal después de inseminación en los cuernos o cuerpo del útero. Las barras representan medias s.e.m. para 9 muestras por tratamiento. (Adaptado de Gallager y Senger, 1989; 4) % acumulado de espermatozoides recuperados Cercix Horas después de la IA Figura 7. Porcentajes de espermatozoides recuperados con muestras de mucus vaginal después de inseminación en los cuernos o parte media del cervix. Las barras representan medias s.e.m. para 9 muestras por tratamiento. (Adaptado de Gallager y Senger, 1989; 4) 15

16 Por lo tanto podemos concluir con estos trabajos que existe un beneficio asociado con la deposición en los cuernos a través de la eliminación de los errores de deposición en el cervix. Teniendo plena seguridad de haber pasado con la punta de la pipeta la totalidad del cervix el lugar de siembra es el correcto. Otro detalle a tener en cuenta durante la IA es el momento de deposición del semen. Macmillan y Watson (7) inseminaron un grupo de vacas durante el comienzo, la mitad, el final y después del estro con semen de toros con porcentajes de fertilidad debajo del promedio, dentro del promedio, o sobre el promedio (Tabla 7). Tabla 7. Porcentaje de no retorno de IA en distintos momento del estro con toros con tres niveles de fertilidad. (Adaptado de Macmillan y Watson, 1975; 7) % de no retorno 1 Momento del estro a la IA Toro de alta fertilidad Toros de fertilidad media Toro de baja fertilidad comienzo mitad final después % de no retorno a los 49 días de 6012 inseminaciones. Estos resultados sugieren que la fertilidad de semen de toros con baja fertilidad puede ser mejorada retrasando el momento de la IA hasta después del final del estro, pero siempre varias horas antes de la ovulación. En otro experimento se evaluó el efecto del momento de la IA sobre el porcentaje de fertilidad y calidad de los embriones de vacas holando superovuladas. Las vacas fueron constantemente monitoreadas utilizando HeatWatch para determinar el comienzo del estro que fue definido por la primera monta mayor de 2 segundos. El momento de la ovulación de vacas holando monitoreadas por este sistema fue determinada a 27,6 ± 5,4 h después de la primera monta (Walker et al., 1996). Las vacas fueron inseminadas a las 0 h (comienzo del estro), 12 h o 24 h después de la primera monta. Los embriones fueron colectados 6 días después de la IA. El porcentaje de preñez y calidad de los embriones se muestran en la Figura 8. Los resultados muestran que el porcentaje de fertilización fue mayor cuando la IA se realizó 24 h después del comienzo del estro. Sin embargo, cuando se examinó la calidad de los embriones, las vacas inseminadas al comienzo del estro tuvieron una mejor calidad de embriones (mayor cantidad de embriones excelentes o buenos) y las vacas inseminadas más tarde (24 h) tuvieron menor calidad de embriones: menor cantidad de embriones de buena calidad y mayor cantidad de embriones degenerados. 16

17 Embriones fertilizados (%) h 12 h 24 h Embriones excelentes/buenos (%) h 12 h 24 h Embriones regulares/malos (%) h 12 h 24 h Inseminación (horas desde comienzo del estro) Embriones degenerados (%) h 12 h 24 h Inseminación (horas desde comienzo del estro) Figura 8. Efecto del momento de la IA sobre la fertilización y calidad de los embriones colectados 6 días después de la IA (n=117; Dalton et al., 1998) Porcentaje de Preñez (%) Bajo % fertilización Alta calidad Inadecuada sobrevida del espermatozoide? Optimo momento Ovocito envegecido? Menos selección espermática? 0 h 12 h 24 Momento de la IA (horas desde comienzo del estro) Alto % preñez Baja calidad Figura 9. Porcentaje de preñez calculado desde los datos presentados en la Figura 8 basado en la clasificación de los embriones. El momento óptimo de la IA se determinó en base a que la IA tempranas fueron inadecuadas debido a la gran cantidad de ovocitos infertilizados, y las IA tardías se caracterizaron por la cantidad de embriones de baja calidad (22). 17

18 1.5. Evaluación de Semen Congelado El semen al ser congelado sufre una serie de procesos que pueden alterar la calidad del semen original. Muchas veces semen de alta calidad al momento de la congelación ha resultado en semen de mediana y baja calidad al ser descongelado. De aquí, la importancia de evaluar el semen luego de la congelación. Efecto del Congelado y el Descongelado sobre las Células Espermáticas Sin tener en cuenta la complejidad de los procesos biológicos que ocurren dentro de la célula, la congelación es un proceso parecido a una deshidratación de la célula. La cristalización del agua comienza con la formación de núcleos. Un núcleo es la agregación de moléculas que han perdido energía debido a la baja temperatura y que adquieren una forma particular a la cual se adhieren nuevas formaciones de cristalización. La formación de núcleos de agua pura ocurre entre los -3 y -45 ºC. Cualquier partícula extraña dentro del agua puede actuar como un núcleo y así resultar en la cristalización. Una vez que la cristalización ha sido completada otro fenómeno similar puede ocurrir, la recristalización. La recristalización es el crecimiento de grandes cristales de hielo a expensas de los pequeños cristales. Este proceso ocurre cuando el descongelado es lento. Aunque el punto de congelación celular es por debajo de los -10 ºC, las células permanecen sin congelarse hasta los - 15 ºC. Durante la congelación las células comienzan a equilibrarse con el medio debido a la pérdida de agua intracelular. Esta deshidratación resulta en una disminución de la presión intracelular y un incremento en la concentración del soluto. Por lo tanto, la congelación lenta le permitirá a la célula el continuo equilibrio con el exterior. Es por eso que a los -10 o -15 ºC la cantidad de agua intracelular es muy pequeña. Una congelación muy rápida no permitiría ese intercambio y por consiguiente a la temperatura de -10 la célula poseerá mucha agua intracelular. De todas maneras durante la congelación las células pierden agua y hay un aumento de la concentración de los solutos intra y extra celulares. Existen dos eventos de los cuales depende la sobrevida de los espermatozoides a la congelación. - Las células congeladas a temperaturas por debajo de la velocidad crítica son destruidas por una prolongada exposición al soluto, también llamado crioprotector. A medida que se va congelando el agua de la solución crioprotectora, el medio se vuelve hiperosmótico con respecto a las células y produce su muerte. - Las células congeladas a velocidades por encima del valor crítico tienen un insuficiente período de tiempo para el intercambio osmótico por lo cual no pueden expulsar la totalidad del agua intracelular y se forman cristales de hielo dentro de la célula que producen su muerte. Los mecanismos por los cuales se causa daño celular durante la congelación son resumidos como sigue: 18

19 - Ruptura mecánica de los elementos celulares por la formación de cristales. - Desnaturalización por la alta concentración de electrolitos. - Cambios en el ph. - Deshidratación excesiva que precipita las proteínas de la solución. - Deshidratación que lleva a las proteínas al contacto y la producción de uniones anormales - Efecto sobre la remoción de agua estructuralmente importante de la célula. La primera congelación exitosa de semen fue reportada en los experimentos de Polge y col en 1949 y de Smith y Polge en Se utilizó en estos trabajos el glicerol adicionado al diluyente del semen que actúa reduciendo la concentración de electrolitos en el agua residual no congelada dentro y alrededor de la célula. También posee un efecto protector de la superficie celular. El punto crítico durante la congelación y la descongelación son las temperaturas de -10 a -50 ºC. Por lo tanto es importante atravesar esta zona rápidamente. Se ha comprobado que la descongelación rápida posee mejores resultados que la lenta. Los resultados de los experimentos de inseminación son siempre el mejor reflejo de la calidad seminal. El evaluador debe tener un cuidado extremo y trabajar en forma ordenada con cada muestra para no tener evaluaciones erróneas. Ocasionalmente ha pasado que toros de alta performance, campeones en exposiciones y del más alto pedigree produce semen insatisfactorio. Muchas pruebas han sido diseñadas con el objeto de evaluar la calidad seminal. Algunas de ellas en base a la motilidad y a la morfología. Otras suman a estos parámetros la integridad del acrosoma, concentración, microbiología, propiedades químicas, bioquímicas, y la viabilidad in vitro o in vivo. Evaluación de la Motilidad Espermática luego del Descongelado Se utilizan las pruebas de evaluación de motilidad y morfología para predecir la calidad del semen antes de su uso a campo. Esta se puede hacer por visión directa con la ayuda de un microscopio o por medio de fotomicrografía y de contadores electrónicos computarizados. La observación directa es el método más viejo y el más utilizado dada la facilidad en el diagnóstico y lo económico de cada determinación. Este método permite la evaluación de una gran cantidad de muestras por día a un bajo costo pero posee la desventaja que es una medida subjetiva y altamente influenciada por el evaluador. 19

20 La motilidad puede ser evaluada siguiendo la siguiente escala: 0: sin movimiento 1: leve movimiento de cola sin desplazamiento progresivo 2: lento movimiento de cola con algo de movimiento progresivo 3: movimiento progresivo a velocidad lenta 4: movimiento progresivo rápido 5: movimiento progresivo rápido donde es difícil seguir a una célula determinada El movimiento progresivo se debe evaluar inmediatamente después del descongelado y luego de 2 horas de incubación a 37 ºC. El mínimo aceptable de motilidad es de 25 % de células mótiles a una velocidad 3 inmediatamente después del descongelado y un 15 % de células mótiles a una velocidad de 2 luego de 2 h. de incubación a 37 ºC. La motilidad por sí sola no tiene un valor de predicción de la fertilidad si no va acompañada de la morfología y la integridad del acrosoma. Test de Resistencia osmótica. Este test es una prueba de Integridad Celular utilizado por algunos centros de IA. Se coloca el contenido de una pajuela en una solución hiposmótica de fructosa y citrato de sodio (100 mosm/l). Se utilizan 2 µl y 1 µl de la solución hiposmótica para el contenido de pajuelas de 0.5 y 0.25 respectivamente. Se incuba en baño María a 37º-38º C durante 60 minutos. Luego se coloca una pequeña gota (6 µl) entre porta y cubreobjeto y se cuentan 200 espermatozoides a 400X. Los espermatozoides con colas enrolladas están vivos (reaccionados). Cuanto más colas enrolladas, mejor calidad de semen. Debe haber un 40 % de reaccionantes. La observación de los espermatozoides se realiza a las 0 h, 1 h y 2 h. La solución contiene 9 g de fructosa, 4.9 g de citrato trisódico y c.s.p µl de agua destilada. Integridad del Acrosoma Las enzimas del acrosoma son de real importancia para la penetración de la zona pelúcida durante la fertilización. La visualización de la integridad acrosomal se logra con la observación de la muestra con un microscopio de contraste de fase. Para la evaluación se coloca una gota de 2 a 4 mm de semen sobre un porta objetos más una gota similar de glutaraldehído al 0.2% diluida en buffer fosfato salino. El glutaraldehído detiene el movimiento de las células y previene el deterioro celular. El extendido se observa con un microscopio de contraste de fase y se cuentan 100 células. El semen se debe evaluar nuevamente a las dos horas de incubación. El defecto puede ser la falta del capuchón acrosómico o su perdida en distintas proporciones. Este método es altamente repetible con un error de no más del 6%. Al menos el 50% de las células deben presentar acrosomas intactos, y el 35% luego de las 2 horas de incubación. 20

21 Evaluación de la Morfología Espermática luego del Descongelado La motilidad y la integridad del acrosoma son dos características muy afectadas durante el proceso de la congelación y la descongelación. La morfología en general se mantiene sin grandes cambios. Sin embargo es muy importante hacerlo porque cambios bruscos en la calidad seminal pueden pasar desapercibidos por el centro de IA en su fase más temprana. La evaluación se realiza al igual que para semen fresco; una gota de semen más una gota de eosina-nigrosina y se cuentan al menos 100 células. Recordemos que el mínimo aceptable es 70 % de los espermatozoides normales. Microbiología del Semen La inseminación artificial es una técnica de mucho valor para prevenir enfermedades venéreas. Sin embargo una gran cantidad de gérmenes patógenos se pueden transmitir por medio del semen. Hay algunas enfermedades propias del toro de las cuales debe ser libre para evitar transmisión y otras que surgen del proceso de congelación. Los microorganismos patógenos específicos que el toro puede transmitir con el semen son los siguientes: Aftosa, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Brucella abortus, Trichomonas fetus, Campylobacter fetus veneralis, Leptospira sp. Otros patógenos que son difíciles de controlar dado que se encuentra en la población de vacunos son: IBR, BVD y PI3. Algunos gérmenes patógenos que pueden contaminar durante el proceso de congelación del semen son: Pseudomona areuginosa, Corynebacterium pyogenes, Estafilococos y Estreptococos, E. Coli, Hongos y Levaduras. Esto se puede evitar con higiene durante la colección y el procesado. Si uno sospecha de las condiciones de higiene del laboratorio de donde proviene la muestra de semen se puede proceder al aislamiento de bacterias y virus presentes en el semen. Es una tarea normalmente pasada por alto pero que no deja de ser de suma importancia. La calidad bacteriológica del semen es testigo indirecto de la calidad higiénica del centro de IA y se mide en cantidades de unidades formadoras de colonias (UFC). Un buen semen debería tener < 500 UFC por ml Certificado de Evaluación de Semen congelado. A continuación se incluyen el Certificado de Evaluación de Semen Congelado y esquema de Anormalidades espermáticas como guía. Éste ha sido confeccionado basado en los certificados que otorga la Sociedad de Theriogenología de Norte América y nuestra propia experiencia. Normalmente se trata de pedir al productor o al centro de IA 2 dosis de semen para evaluarlo. No obstante puede 21

22 haber casos donde el semen es muy caro y entonces se podría tomar la muestra en el campo cuando se realiza una IA (aunque esto no es lo más aconsejable). En el Certificado de Evaluación de Semen Congelado se consignan los datos del propietario y del toro. Está integrado por tres partes donde se anotan los resultados de los tres exámenes que se realizan al semen descongelado: a. Viabilidad. Se consignan los datos de % de motilidad progresiva, grado de motilidad y % de acrosomas intactos inmediatamente después de descongelado y luego de dos horas (mantenido en baño maría a 37 ºC, de acuerdo a las pruebas descriptas). MÍNIMO ACEPTABLE Motilidad progresiva: 0 h = 25 % con grado 3 2 h = 15 % con grado 2 Acrosoma: 0 h = 60 % intactos 2 h = 40 % intactos b. Morfología. Se cuentan por lo menos 100 células y se anotan los % de normales y de las principales anormalidades. MÍNIMO ACEPTABLE 70 % normales no más del % de defectos de cabeza no más del 25 % de defectos de acrosoma y cola c. Concentración. Se puede utilizar la cámara para contar glóbulos rojos de acuerdo a lo descripto para contar el total de células y luego, de acuerdo al % de motilidad progresiva a las 0 h, se determina la cantidad de células mótiles por dosis. El número ideal es alrededor de 10 millones de células viables por dosis El semen puede resultar Satisfactorio cuando supera los mínimos establecidos en Viabilidad, Morfología y Concentración. Cuestionable cuando existe uno de estos parámetros ligeramente por debajo del mínimo exigido e Insatisfactorio cuando existe un parámetro muy por debajo del mínimo, o dos o los tres ligeramente disminuidos. 22

23 Resumen 1. Sobre la temperatura de almacenamiento: Mantenerla todo el tiempo por debajo de -130 C para conservar el máximo de fertilidad. 2. Sobre la elección de un procedimiento de descongelado: Para pajuelas, descongelar en agua a C durante 30 segundos. Una vez descongelado, mantener el semen en el mismo baño a 35 C hasta el momento de la inseminación. La inseminación debe realizarse dentro de los 15 minutos de descongelado. 3. Sobre el lugar de deposición del semen: Hacer todo el esfuerzo para localizar la punta de la pipeta en el cuerpo del útero. Si se hace en el cervix, un mayor porcentaje de los espermatozoides saldrá hacia la vagina que si se deposita en el cuerpo del útero. Hay dos fases de transporte espermático, pero los espermatozoides con capacidad de fertilizar llegarán al istmo entre 8 y 12 h post IA. 4. Sobre el control de la Calidad Seminal Es de suma importancia evaluar la Calidad Seminal del Semen Congelado antes de programar un sistema de IATF ya que uno de los factores que más interviene en los resultados es la Calidad del semen que tiene que ser Muy Bueno o Excelente. La evaluación de la Calidad Seminal debe hacerse siempre antes de iniciar un protocolo de Sincronización. REFERENCIAS 1. Berndtson, WE, Pickett BW and Rugg CD. Procedures for field handling of bovine semen in plastic straws. Proc. Sixth Tech. Conf. Artific. Insem. and Reprod , den Dass N. Laboratory assessment of semen vharacteristics. Anim Reprod. Sci. 28:87, Dobrowolski W and Hafes ESE. Transport and distribution of spermatozoa in the reproductive tract of the cow. J. Anim. Sci. 31:940, Gallager GR and Senger PL. Concentrarions of spermatozoa in the vagina of heifers after deposition of semen in the uterine horns, uterine body or cervix. J. of Reprod and Fertility 86:19-25, Larsson B. Transuterine transport of spermatozoa after artificial insemination in heifers. Anim. Reprod. Sci. 12: , Larsson B and Larsson K. Distribution of spermatozoa in the genital tract of artificially inseminated heifers. Acta vet scand. 26:385, Macmillan KL and Watson JD. Fertility differences between group of sires relative to the stage of estrus at the time of insemination. Anim. Prod. 21:243,

24 8. Marshall CE, Graves WM, Meador JL, Swain JB and Anderson JI. A fertility comparison of uterine body and bicornual semen deposition precedures in dairy cattle. American Dairy Science Association and American Society of animal Science Combined Annual Meeting. Abst Mitchel JR, Senger PL and Rosenberger JL. Distribution and retention of spermatozoa with acrosomal and nuclear abnormalities in the cow genital tract. J. Anim. Sci. 61: , Peters JL, Senger PL, Rosenberger JL and O'Connor ML. Radiographic evaluation of bovine artificial inseminationg technique among professional and herdsman-inseminators using.5 and.25 ml french straws. J. of Anim. Sci. 59: , Pickett et al., Proc Tenth NAAM conf AI Beef Cattle, Saacke RG, Nadir S and Nebel RL. Relationship of semen quality to sperm transport, fertilization, and embryo quality in ruminants. Theriogenology 41:45, Saacke RG, Components of semen quality. J. Anim. Sci. 55 (Suppl.II):1, Senger PL. Transport of sperm by the female reproductive tract in the cow as it relates to insemination technique. Revista Brasileira de Rerpoduçao Animal (Suplemento) Vol I:1-15, Senger PL, Becker WC and Hillers JK. Influence of cornual insemination on conception rates in dairy cattle. J. Anim. Sci. 66: , Senger PL, Becker WC and Hillers JK. Effect of thawing rate and post thaw temperatures on motility and acrosomal maintenance in bovine semen frozen in plastic straws. J. Anim. Sci. 42: , Suga T and Higaki S. Studies on uterine secretions in the cow. II Distribution of spermatozoa and seminal plasma after intra-uterine inseminations in the reprodutive tract of the cow during estrus. bull Natl. Inst. Anim. Ind. (Jpn) 24:41, 1971 (103) 18. Swain JB, Senger PL, Hillers JK and Tate WS. Influence of x-ray retraining of herdsman inseminators upon conception in Washington dairy herds. J Dairy Sci 1986; 69 (Suppl 1) Wilmut I and Moeller AN. Sperm transport into the oviducts of heifers mated early in estrus. Reprod Nutr Dev 1984; 24: Zavos PM, Johns JT, Heersche G, Jr and Miksh DE. Site of semen deposition and subsequent conception in synchronized and artificially inseminated (IA) beef heifers. J Anim. Sci 1985; 61 (suppl 1): Sullivan JJ, Sperm numbers required for optimum breeding efficiency en Cattle. Proc. 3rd Tech Conf Artif Insem and Reprod NAAB 1970; Saacke RG, Dalton JC, Nadir S, Nebel RL, Bame JH. Relationship of seminal traits and insemination time to fertilization rate and embryo quality. Anim Reprod Sci 60-61; 2000:

25 2. NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA EL MANEJO DE LA DETECCIÓN DEL CELO Partiendo de los elementos que llevan a una comprensión acabada de los diferentes signos que permiten identificar a una hembra bovina en celo, profundizaremos en los aspectos que puedan minimizar errores de detección, para luego entrar en la descripción de una serie de métodos disponibles como ayuda a la constatación visual, e incluso algunos que se proponen a futuro como lo suficientemente eficientes y exactos como para prescindir de la observación directa Estro y Ciclo Estral Es bien conocido que el ciclo estral en los bovinos tiene un promedio de 21 días, con la mayoría de los ciclos que duran entre 17 y 24 días. La duración del estro varía mucho entre los animales del mismo rodeo, tanto como entre los diferentes estudios realizados. En un estudio con vacas de tambo lactando (Dransfield y col. 1998, 6), la duración del celo (definido como el intervalo entre el primer evento de quietud de monta hasta el último, detectado por un dispositivo preso-sensor radiotelemétrico) fue 7,1±5,4 h (media ± DS; con un rango entre 33 min. a 35,8 h; n=2055 períodos estrales), con 8,5±6,6 montas en cada estro. Usando un equipo similar, la duración del estro en vacas de tambo (n=89) en pastoreo fue 8,6±4,3 h (con un rango de 1 a 21,3 h; 31). En vaquillonas de tambo, la duración del estro fue de 10,3±5,9 h y 12,8± 6 h en vaquillonas Holando y Jersey respectivamente, y el número de montas por celo fue de 16,3±11,6 y 28±17,9 (22). Las diferencias en edad, manejo, tamaño del rodeo, método y frecuencia de detección, y la definición del inicio del estro pueden ser la causa de parte de la variación entre los estudios en cuanto a la duración del estro y el número de montas (21) Qué ocasiona el celo y los signos de celo? El celo o estro es el momento culminante del ciclo estral durante el cual la hembra es sexualmente receptiva. En este momento la hembra presenta un conjunto de signos característicos que denotan su receptividad, este es el único momento del ciclo en que la hembra se mantiene quieta al ser monta. El perfil hormonal que puede llevar a la expresión del celo en la vaca es un alto nivel de estrógenos en sangre en presencia de un bajo nivel de progesterona. Esta situación hormonal normalmente existe cuando hay un folículo preovulatorio maduro secretando estrógenos en ausencia de un cuerpo lúteo funcional. Otras condiciones que pueden llevar a la manifestación de celo incluyen la presencia de folículos quísticos y altos niveles de estrógenos con bajos niveles de progesterona en las vacas preñadas cerca del parto. Mientras que altos niveles de estrógenos y baja concentración de progesterona son considerados pre requisitos para la expresión del celo, estas hormonas no son las que en última instancia inducen el comportamiento clásico del celo. Estas señales son desconocidas, pero incluyen neurotransmisores y posiblemente neuropéptidos. Algunos signos fisiológicos del estro como el edema e hiperemia de los genitales y la secreción del mucus vaginal y cervical son involuntarios. Pero los signos de 25