IECS Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria. Informe de Respuesta Rápida N 130. Enero Informe de Respuesta Rápida N 130

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1 ISSN Documentos de Evaluación de Tecnologías Sanitarias Informe de Respuesta Rápida N 130 IECS Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria Ciudad de Buenos Aires Argentina info@iecs.org.ar Informe de Respuesta Rápida N 130 Enero 2008 Utilidad de la PCR en tiempo real para el monitoreo de pacientes con leucemia mieloide crónica / Usefulness of Real-Time PCR for the Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia Patient

2 El Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria (IECS) es una institución independiente, sin fines de lucro, formada por un grupo de profesionales provenientes de las ciencias médicas y de las ciencias sociales dedicados a la investigación, educación y cooperación técnica para las organizaciones y los sistemas de salud. Su propósito es mejorar la eficiencia, equidad, calidad y sustentabilidad de las políticas y servicios de salud. Financiamiento: esta evaluación fue realizada gracias a los aportes de entidades públicas, organizaciones no gubernamentales y empresas de medicina prepaga para el desarrollo de documentos de Evaluación de Tecnologías Sanitarias. Conflicto de interés: ninguno Informe de Respuesta Rápida: este modelo de informe constituye una respuesta rápida a una solicitud de información. La búsqueda de información se focaliza principalmente en fuentes secundarias (Evaluaciones de Tecnologías Sanitarias, revisiones sistemáticas y meta-análisis, guías de práctica clínica, políticas de cobertura) y los principales estudios originales. No implica necesariamente una revisión exhaustiva del tema, ni una búsqueda sistemática de estudios primarios, ni la elaboración propia de datos. Esta evaluación fue realizada en base a la mejor evidencia disponible al momento de su elaboración. No reemplaza la responsabilidad individual de los profesionales de la salud en tomar las decisiones apropiadas a la circunstancias del paciente individual, en consulta con el mismo paciente o sus familiares y responsables de su cuidado. Informe de Respuesta Rápida N 130 Utilidad de la PCR en tiempo real para el monitoreo de pacientes con leucemia mieloide crónica Fecha de realización: Enero 2008 ISSN Copias de este informe pueden obtenerse del Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria, Ciudad de Buenos Aires, Argentina. Tel./Fax: (+54 11) / info@iecs.org.ar IECS Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria. Derechos reservados. Este documento puede ser libremente utilizado solo para fines académicos. Su reproducción por o para organizaciones comerciales solo puede realizarse con la autorización expresa y por escrito del Instituto. 2 de 18

3 Este documento es un informe técnico del Grupo de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria Dirección Dr. Federico Augustovski Dr. Andrés Pichon-Riviere Investigadores Dra. Andrea Alcaraz Dr. Ariel Bardach Dr. Juan Calcagno Dr. Lisandro Colantonio Dr. Fernando Sosavalle Dr. Sebastián García Martí Dr. Demián Glujovsky Dra. Analía López Dr. Alejandro Regueiro Para citar este informe: Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria ( Utilidad de la PCR en tiempo real para el monitoreo de la leucemia mieloide crónica. Documentos de Evaluación de Tecnologías Sanitarias. Informe de Respuesta Rápida N 130. Buenos Aires, Argentina. Enero de 18

4 RESUMEN Utilidad de la PCR en tiempo real para el monitoreo de pacientes con leucemia mieloide crónica Contexto clínico La leucemia mieloide crónica (LMC) pertenece al grupo de los síndromes mieloproliferativos crónicos. Tiene una incidencia de 1 a 2 casos cada personas por año y representa al 15 por ciento de las leucemias en adultos. El diagnóstico se confirma al demostrar la existencia en médula ósea (MO) del cromosoma Philadelphia (Ph), alteración cromosómica que da como resultado al gen BCR-ABL, el cual genera la producción de una proteína con actividad tirosin cinasa anormal que estaría relacionada con la mielopoyesis desordenada de la enfermedad. Esta alteración se halla en el 95% de los pacientes con LMC. Luego de iniciado el tratamiento, el monitoreo de la enfermedad permite evaluar el grado de respuesta al mismo o bien, detectar tempranamente la recaída del paciente. Se recomienda realizar un control hematológico a los tres meses de iniciado el tratamiento para evaluar la existencia o no de remisión hematológica; de existir ésta se seguirá con estudios citogenéticos y/o de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), según el tipo de tratamiento recibido, cada 3-6 meses para constatar la ausencia de cromosoma Ph (remisión citogenética). De constatarse recaída citogenética y/o hematológica, se deberán realizar cambios terapéuticos. Con las pruebas moleculares cuantitativas, emerge el concepto de remisión molecular (ausencia de transcripción del gen BCR-ABL). Diversos estudios intentaron demostrar la utilidad de cuantificar los niveles de BCR-ABL, como factor predictor de recaída citogenética. La tecnología Existen distintos tipos de pruebas de PCR que pueden clasificarse en: PCR cualitativas o PCR cuantitativas. Dentro de las pruebas de PCR cuantitativas, la más común es la PCR competitiva, en la que se incorpora a la muestra a analizar una cantidad conocida y limitada de nucleótidos. A partir del consumo de estos, nos es permitido estimar la cantidad de ADN en la muestra que presentaba la alteración buscada. La PCR en tiempo real es otro tipo de PCR cuantitativa que detecta y cuantifica la fluorescencia emitida por los productos de PCR que se acumulan durante el proceso de amplificación. La misma utiliza una molécula fluorescente, que al unirse al gen diana libera fluorescencia. Los equipos para llevarla a cabo incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder cuantificar e informar la cantidad de ADN de la muestra, que presenta la alteración cromosómica indicada. Objetivo Evaluar la evidencia disponible sobre la utilidad de la PCR en tiempo real para el monitoreo de la LMC. Método y estrategia de búsqueda Se realizó una búsqueda en la base de datos del Centro de Revisiones y Diseminación de la Universidad de York (CRD), en MEDLINE, en Tripdatabase, en la Biblioteca Cochrane, en Embase, en Lilacs y en HTAi Vortal, con el fin de identificar estudios publicados que hayan evaluado el uso de PCR en tiempo real para el monitoreo de la LMC y su implicancia clínica. Se priorizó la inclusión de estudios secundarios (meta-análisis, revisiones sistemáticas y evaluaciones de tecnología sanitaria). Adicionalmente, se consultaron políticas de cobertura de organismos financiadores de salud de otros países. Resultados principales Se identificaron, un ensayo clínico prospectivo aleatorizado que comparó resultados en pacientes tratados al diagnosticarse recaída molecular, versus pacientes tratados al diagnosticarse recaída citogenética; y dos guías de práctica clínica, una perteneciente a la red nacional del cáncer (National Comprehensive Cancer Network NCCN) y la otra al Comité Británico para estándares en hematología. Un pequeño ensayo clínico, prospectivo y aleatorizado comparó los resultados de iniciar un tratamiento al detectarse recaída molecular versus iniciarlo una vez constatada la recaída citogenética. En el mismo se evidenció que el tratamiento precoz podría evitar la progresión de recaída molecular a citogenética, resultado que no se tradujo en una mayor sobrevida de los pacientes 4 de 18

5 Las guías de práctica clínica, consideran útil la utilización de la PCR cuantitativa (ya sea competitiva o en tiempo real) antes y durante el tratamiento para monitorear la respuesta mediante el descenso de los niveles de transcripción BCR-ABL, o bien evaluar en forma temprana la falta de respuesta al tratamiento. Ambas guías coinciden en que a partir de estos estudios no existe evidencia sobre qué cambios terapéuticos realizar en pacientes con recaída molecular. Políticas de cobertura Una financiadora de salud estadounidense, considera médicamente necesario a la PCR cuantitativa (no especifica si competitiva o en tiempo real) en la LMC para el monitoreo de la enfermedad y la evaluación de la respuesta a la terapéutica. El comité asesor de servicios médicos de Australia (MSAC) se basó en estudios de series de casos para evaluar la costo/efectividad de la PCR en el monitoreo de enfermedad mínima residual en pacientes con LMC. El comité concluye reconociendo la utilidad de la PCR cuali o cuantitativa en el monitoreo de la LMC. Implicancias económicas Tanto la PCR en tiempo real como la competitiva tienen un costo aproximado de $1.600 a $2.200 (pesos argentinos año 2007). Conclusiones La evidencia encontrada acerca de la utilidad de la PCR cuantitativa en tiempo real para el monitoreo de la LMC consta de estudios y guías que en general se basan en trabajos con pocos pacientes y de pobre calidad metodológica. A pesar de que existe consenso acerca de la mayor sensibilidad que presenta la PCR en tiempo real en comparación con los estudios citogenéticos u otras pruebas cualitativas, se desconoce si su utilización en el seguimiento rutinario redundaría en un beneficio en el pronóstico de los pacientes. Ante valores elevados (o elevación de valores preexistentes) obtenidos por PCR cuantitativa, diversas guías proponen realizar una nueva evaluación citogenética; actualmente no existe consenso sobre que modificaciones realizar en el tratamiento basándose solo en los resultados de la PCR. 5 de 18

6 ABSTRACT Usefulness of Real-Time PCR for the Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia Patients Clinical Setting Chronic Myeloid Leukemia (CML) belongs to the group of chronic myeloproliferative syndromes. It has an incidence of 1-2 cases every 100,000 people/year and it represents 15% of adult leukemias. Its diagnosis is confirmed by demonstrating the presence of the Philadelphia (Ph) chromosome in bone marrow (BM). This chromosome alteration results in the BCR-ABL gene, which generates the production of a protein with abnormal tyrosine kinase activity which could be related with the disarranged myelopoiesis present in this disease. This alteration is found in 95% of the patients with CML. After starting treatment, disease monitoring allows the assessment of the extent of response or early detection of patient relapse. It is advisable to perform hematological control three months after starting treatment to evaluate the existence or not of hematological remission; and if this were present cytogenetic and/or polymerase chain reaction studies (PCR) should follow, depending on the type of treatment received, every 3-6 months to demonstrate the absence of the Ph chromosome (cytogenetic remission). If cytogenetic and/or hematological relapse are observed, therapeutic changes should be implemented. With quantitative molecular assays, the concept of molecular remission (absence of transcription of BCR-ABL gene) arises. Several studies tried to demonstrate the usefulness of quantifying BCR- ABL levels, as cytogenetic relapse predictive factor. The Technology There are several types of PCR assays that may be classified as follows: Qualitative PCR or quantitative PCR. Among quantitative PCR assays, the most common one is competitive PCR, in which a known and limited quantity of nucleotides is added to the sample to be analyzed. Based on their consumption, it is possible to estimate the amount of DNA in the sample showing the alteration sought. Real-Time PCR is another type of quantitative PCR which detects and quantifies the fluorescent signal emitted by PCR products which accumulate during the amplification process. It uses a fluorescent molecule, which when bound to the target gene, releases fluorescence. The equipment used to perform it, consists in a fluorescence reader and is designed to quantify and report the amount of DNA present in the sample which presents the indicated chromosome alteration. Purpose To assess the available evidence on the usefulness of real-time PCR for CML monitoring. Method and Search Strategy A search was started in the University of York s Center for Reviews and Dissemination (CRD) database, in MEDLINE, Tripdatabase, Cochrane library, Embase, Lilacs and in HTAi Vortal in order to identify those published studies having assessed the use of real-time PCR for CML monitoring and its clinical implications. Priority was given to including secondary studies (metaanalyses, systematic reviews and health technology assessments). In addition, coverage policies from other countries health care providers were reviewed. Main Results One prospective, randomized clinical trial comparing the results of patients treated after molecular relapse diagnosis, versus patients treated after cytogenetic relapse diagnosis; two clinical practice guidelines, one belonging to the National Comprehensive Cancer Network (NCCN) and the other to the British Committee for Standards in Haematology (BCSH) were identified. One small prospective, randomized, clinical trial compared the results of starting treatment after molecular relapse detection versus after proving cytogenetic relapse. This demonstrated that early diagnosis could prevent progression from molecular to cytogenetic relapse, result which did not translate into a longer patient survival. Clinical practice guidelines, consider the use of quantitative PCR useful (either competitive or in real-time) before and during treatment to monitor the response by measuring the decrease in BCR-ABL transcript levels, or assessing the lack of response to treatment, at an early stage. Both guidelines agree that, based on these studies, there is no evidence on what therapeutic changes should be implemented for patients with molecular relapse. 6 de 18

7 Coverage Policies One U.S. health sponsor, considers quantitative PCR as medically necessary (not specifying whether competitive or real-time) in CML monitoring and evaluation of therapeutic response. The Medical Services Advisory Committee (MSAC) based on case series studies to assess PCR cost/effectiveness in the monitoring of minimal residual disease in CML patients. The committee concludes that qualitative or quantitative PCR is useful to monitor CML. Financial Implications: Both real-time and competitive PCR cost about $1,600-$2,200 (Argentine pesos, 2007). Conclusions The evidence found on real-time quantitative PCR usefulness for CML monitoring is based on studies and guidelines generally based on poor methodological quality studies including few patients. In spite of the fact there is consensus on the higher sensitivity of real-time PCR compared with cytogenetic studies and other qualitative assays, it is not known whether its use in routine followup would improve patient prognosis. When increased values (or increase of pre-existing values) obtained with qualitative PCR are found, several guidelines propose performing a new cytogenetic assessment; to date there is no consensus about what treatment changes should be implemented based solely on PCR results. 7 de 18

8 1. INTRODUCCIÓN La LMC pertenece al grupo de los síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC) de naturaleza clonal, con origen en una célula madre pluripotencial común a las 3 series hematopoyéticas. Fue la primera enfermedad maligna en la que se constató una anormalidad cromosómica específica, que se asoció con la patogenia de la enfermedad. 1 Tiene una incidencia, en Estados Unidos de Norte América, de 1 a 2 casos cada personas por año y representa el 15 por ciento de las leucemias en adultos. La edad media de presentación es entre los 45 y 55 años, con un ligero predominio en varones, con una relación hombre/mujer de 1,3:1. 2, 3 4 La sobrevida media de los pacientes sin tratamiento oscila entre los 3 y 5 años. 5 Los síntomas de presentación son fatiga, anorexia, y pérdida de peso, pero aproximadamente el 40% de los pacientes son asintomáticos. Al examen físico, la esplenomegalia es el hallazgo más frecuente y se encuentra en más de la mitad de los pacientes. 4 La enfermedad presenta 3 fases clínicas, y sigue un típico curso de una primera fase crónica, en la que el proceso de la enfermedad es fácilmente controlada, seguida de una fase denominada acelerada con un curso inestable, y, por último, una fase más agresiva (crisis blástica), que suele ser mortal. 2 La mayoría de los casos (aproximadamente un 85 %) son diagnosticados durante la fase crónica, que se caracteriza por una expansión de células mieloides con una maduración normal (ausencia de blastos en sangre periférica); el 85 % de los pacientes se diagnostican en esta etapa y de ellos, el 15 o 20 % son asintomáticos al diagnóstico. 2 La duración de este período varía en función de la terapia utilizada. Esta fase suele ser controlada con medicación mielosupresora, lográndose una remisión hematológica (normalización de los valores de sangre periférica). 6 Algunos pacientes progresan a la fase acelerada o de transición, que puede durar varios meses. La supervivencia de los pacientes diagnosticados en este período oscila entre los 12 y 18 meses. Se caracteriza por una mala respuesta al tratamiento mielosupresor, evidenciándose en sangre periférica un aumento en el recuento de células mieloides, la aparición de células blásticas (> 15%), promielocitos (> 30%), basófilos (> 20%), y recuento de plaquetas menores a células/ml. 6 Por lo general, las dosis de las drogas necesitan ser aumentadas. La aparición de dolor óseo y fiebre, así como un aumento de la fibrosis de MO, son precursores de la última fase. La crisis blástica, es similar a la leucemia aguda, y la supervivencia en esta etapa es de 3-6 meses. Es característica la presencia de un 30% o más de blastocitos en MO y sangre periférica. La infiltración de piel o tejidos también definen a la crisis blástica. 5 En los años 60, mediante el uso de técnicas de estudio de células humanas en mitosis, Novell y Hungerford, logran detectar, en esta patologia, una anormalidad cromosómica que más tarde recibiría el nombre de cromosoma Philadelphia (Ph). En la década del 80, se demostró que el cromosoma Ph tenía un gen de fusión único, denominado BCR-ABL, el cual genera la 8 de 18

9 producción de una proteína con actividad tirosin cinasa anormal que estaría relacionada con la mielopoyesis desordenada que se encuentra en la LMC. 1, 2 El cromosoma Ph es un cromosoma 22 acortado, resultado de la translocación recíproca, t(9;22)-(q34;q11), entre los brazos largos del cromosoma 9 y el 22. Esta translocación produce la transferencia del virus de la leucemia Abelson (ABL), oncogén localizado en el cromosoma 9, a un área del cromosoma 22 denominada como región de rotura de conglomerados (del inglés breakpoint cluster region BCR). Esta alteración cromosómica se encuentra presente en aproximadamente el 95 por ciento de los pacientes con LMC y se la puede considerar como la marca distintiva de esta enfermedad. 7 8 Aunque también se la puede encontrar en un 5 por ciento de los niños con leucemia linfoblástica aguda, en un 15 a 30 por ciento de los adultos con la misma patología y en un 2 por ciento de los pacientes con reciente diagnóstico de leucemia mieloblástica aguda. 8 El 40% de los pacientes al momento del diagnóstico se encuentran asintomáticos, la enfermedad puede sospecharse ante pruebas analíticas alteradas como leucocitosis (basofilia y eosinofilia), anemia y trombocitopenia variables; otros estudios bioquímicos pueden revelar aumento de los niveles de LDH, hiperuricemia y disminución de los niveles de fosfatasa alcalina granulocítica. La detección del cromosoma Ph confirma el diagnóstico de esta enfermedad. 4 Los estudios citogenéticos revelan la presencia del cromosoma Ph en el 90% de los pacientes con LMC. Estos estudios son considerados las pruebas estándares para el diagnóstico de LMC. Del 10 % de los pacientes que padecen LMC y que los estudios citogenéticas dieron falsamente negativos, en un 50% se puede demostrar el producto de la fusión BCR-ABL con estudios moleculares, como la prueba de fluorescencia de hibridización in situ (FISH) o la PCR transcriptasa reversa (RT-PCR). 2 El objetivo del tratamiento de la LMC es alcanzar una remisión completa de la enfermedad, que por lo general se evidencia primeramente como remisión hematológica y posteriormente como citogenética. La remisión hematológica implica la normalización de los índices hematimétricos de sangre periférica, mientras que la remisión citogenética está determinada por la evaluación citogenética de una muestra de MO que constata la ausencia del cromosoma Philadelphia. Una vez confirmado el diagnóstico de LMC dentro de las posibilidades terapéuticas se hallan: el trasplante de MO (considerado como único tratamiento con posibilidades curativas), el uso de inhibidores de la tirosin cinasa, como ser el imatinib (actualmente el tratamiento de elección en quienes no reciben trasplante), la hidroxiurea, el busulfano, irradiación esplénica, leucoféresis si existe gran cantidad de leucocitos y transfusiones si existe anemia severa. 1, 4 Una vez iniciado el tratamiento resulta clave el monitoreo de la enfermedad. Permite evaluar el grado de respuesta a la terapia instaurada o bien, detectar tempranamente la recaída del paciente. El monitoreo se basa en la búsqueda de anomalías en sangre periférica cuya existencia constataría una recaída hematológica, o bien la presencia del cromosoma Ph en MO 9 de 18

10 que definiría a la recaída citogenética, ante cualquiera de estas dos situaciones se deberían realizar cambios terapéuticos buscando el control de la enfermedad. 9 El monitoreo puede llevarse a cabo mediante pruebas de resultado cualitativo (estudios citogenéticos, FISH, PCR, RT-PCR) y/o cuantitativo (PCR en tiempo real, PCR competitiva). Uno de los esquemas que se recomienda para el monitoreo de la enfermedad, en pacientes que reciben terapia con inhibidores de la tirosin cinasa, es el siguiente 10, 11 : A los tres meses de iniciado el tratamiento farmacológico CONTROL HEMATOLÓGICO, para constatar o no remisión a este nivel: o PACIENTE CON REMISIÓN: continua con igual esquema terapéutico o PACIENTE SIN REMISIÓN: evaluar otra alternativa terapéutica A los seis meses del inicio del tratamiento: PRUEBA CITOGENÉTICA, para constatar o no remisión a este nivel: o PACIENTE CON REMISIÓN: continua con igual esquema terapéutico o PACIENTE CON REMISIÓN PARCIAL: puede continuar con igual tratamiento o aumentar dosis de drogas o PACIENTE SIN REMISIÓN O CON RECAIDAC CITOGENÉTICA: evaluar otra alternativa terapéutica. A los doce meses: PRUEBA CITOGENÉTICA, para constatar estado de remisión a este nivel: o PACIENTE CON REMISIÓN: continua con igual esquema terapéutico o PACIENTE CON REMISIÓN PARCIAL: puede continuar con igual tratamiento o aumentar la dosis de las drogas mielosupresoras o PACIENTE SIN REMISIÓN O CON RECAIDAC CITOGENÉTICA: evaluar otra alternativa terapéutica. A los dieciocho meses PRUEBA CITOGENÉTICA, para constatar estado de remisión a este nivel: o PACIENTE CON REMISIÓN: continua igual esquema terapéutico o PACIENTE CON REMISIÓN PARCIAL, SIN REMISIÓN O CON RECAIDA CITOGENÉTICA: evaluar otra alternativa terapéutica. En pacientes que hayan recibido como tratamiento un trasplante de MO se recomienda una vez alcanzada la remisión citogenética, el seguimiento con PCR (cualitativa) cada 3 meses los primeros 2 años y luego cada 6 meses para detectar la reaparición del cromosoma Ph. La positividad de esta prueba está asociada con un elevado riesgo de recaída (sobre todo si se torna positiva entre los 6 a 12 meses después de realizado el trasplante). La presencia de BCR-ABL expuesta por una prueba de PCR debe ser confirmada con un estudio citogenético, 10 de 18

11 el cual en definitiva dará el diagnóstico de recaída citogenética, que llevará a cambios terapéuticos (inicio de tratamiento con inhibidores de la tirosin cinasa, por ejemplo). Con las cualidades de las pruebas moleculares, emerge un nuevo factor pronóstico: la remisión molecular. Diversos estudios intentaron demostrar la utilidad de cuantificar los niveles de BCR- ABL, como factor predictor de recaída citogenética, y pudo observarse que niveles bajos de ARNm de BCR-ABL se asocian con un mejor pronóstico. En varios trabajos se ha reportado que una importante respuesta molecular, definida como una reducción mayor a 3 log, se asocia con tasas de remisión a largo plazo LA TECNOLOGÍA La PCR se vale de la acción de la enzima ADN polimerasa para poder realizar múltiples copias de un fragmente de ADN. El resultado que arroja el estudio de PCR es de características cualitativas, es decir, marca la existencia o no de una determinada cadena de ADN. Por tal limitación, se desarrollaron variaciones sobre la prueba de PCR que permitieron la cuantificación de la muestra amplificada. Es a partir de ese punto que las pruebas de PCR pueden clasificarse según el resultado que arrojan en: PCR cualitativas y PCR cuantitativas. Dentro de las pruebas de PCR cuantitativas, la más común es la PCR competitiva. Consiste en amplificar una porción de ADN incorporando una cantidad conocida y limitada de nucleótidos, lo que permite estimar la cantidad de ADN presente en la muestra. Sin embargo presenta una elevada proporción de falsos positivos y negativos secundario a la contaminación de las muestras y suele tener un rango de cuantificación limitado 12. La PCR en tiempo real, pertenece al subgrupo de pruebas de PCR cuantitativas y es uno de los métodos postulados para el seguimiento de los pacientes con LMC. La PCR en tiempo real (descripta originalmente con el nombre de Kinetic PCR por Higuchi et al. in ), es una variante de la PCR convencional que se basa en la detección y cuantificación simultánea de la fluorescencia emitida por los productos de PCR que se acumulan durante el proceso de amplificación. Su acción se basa, como en la PCR clásica, en la actividad de la enzima ADN polimerasa que puede realizar una copia de una porción de cadena de ADN existente en el ambiente. Con esta reacción se pueden producir múltiples copias de un fragmento determinado de ADN. A diferencia de la PCR clásica, la PCR en tiempo real utiliza otro fragmento de ADN complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar. Este fragmento de ADN lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta fluorescencia (denominado "quencher"). Cuando este fragmento de ADN complementario, es desplazado de su sitio por acción de la ADN polimerasa, la molécula fluorescente se libera de la acción del inhibidor y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser. Los equipos para llevar a cabo la 11 de 18

12 PCR en tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida. La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. Esta técnica requiere la realización en paralelo de una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. La PCR en tiempo real, en contraposición con la PCR cualitativa, informa la cantidad de ADN que presenta la indicada alteración cromosómica valiéndose para esto de la fluorescencia emitida durante el proceso de amplificación. 14 La PCR a tiempo real utiliza sistemas cerrados por lo que el riesgo de contaminación disminuye. Los equipos para PCR a tiempo real tienen la capacidad de llevar a cabo ensayos cualitativos, cuantitativos, determinación de mutaciones, PCR múltiple, entre otros OBJETIVO Evaluar la evidencia disponible sobre la utilidad de la PCR en tiempo real para el monitoreo de la LCM. 4. ESTRATEGIA DE BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN Se realizó una búsqueda en Tripdatabase, en la base de datos del Centro de Revisiones y Diseminación de la Universidad de York (CRD), en MEDLINE, en la Biblioteca Cochrane, Embase, LILACS y HTAi Vortal, a fin de identificar estudios sobre la utilidad de la PCR en tiempo real para el monitoreo de la LMC. Se priorizó la inclusión de fuentes de datos secundarios (meta-análisis, revisiones sistemáticas y evaluaciones de tecnología sanitaria). Para la búsqueda, se utilizaron los siguientes términos: ( PCR realtime OR PCR real time OR PCR quantitative ) AND ( CML OR Chronic Myelogenous Leukemia. Para la búsqueda en PubMed se utilizaron los siguientes términos Mesh: Leukemia, Myelogenous, Chronic, BCR-ABL Positive; Polymerase Chain Reaction. Adicionalmente, se consultaron políticas de cobertura de organismos financiadores de salud de otros países. 5. RESULTADOS Se identificaron, un ensayo clínico prospectivo aleatorizado, un reporte de evaluación del uso de la PCR para el diagnóstico y monitoreo de pacientes con reordenación genética BCR-ABL 12 de 18

13 en la Leucemia Mieloide Crónica, realizada por el comité asesor de servicios médicos de Australia (MSAC); dos guías de práctica clínica una perteneciente a la red nacional del cáncer 10 (National Comprehensive Cancer Network NCCN) y otra del comité británico para estándares en hematología 11. Kim et al (2004) 16 llevó a cabo un ensayo clínico controlado prospectivo aleatorizado en el que evalúa el resultado del tratamiento temprano de la enfermedad mínima residual en pacientes con LMC post trasplante de MO, utilizando a la PCR en tiempo real para el monitoreo molecular de la enfermedad. En este estudio, se monitoreo la enfermedad mínima residual de 45 pacientes utilizando estudios citogenéticos convencionales, FISH RT-PCR y RT-PCR en tiempo real en pacientes consecutivos que recibieron trasplante de MO, y se utilizó a la RT- PCR en tiempo real para analizar la respuesta al tratamiento con inmunoterapia, durante el temprano período post trasplante. De los 45 pacientes, 13 presentaron recaída molecular. Estos fueron asignados en forma aleatorizada a dos grupos: Grupo A (N=6 y Grupo B (N=7). De los 45 pacientes en 4 se diagnosticó recaída citogenética, iniciando inmunoterapia. Pacientes con trasplante de MO Incluidos en el estudio N=45 Pacientes con recaída dentro de los 6 meses post trasplante N=17 Recaída molecular N= 13 Recaída citogenética N=4 Grupo A N=6 Grupo B N=7 Grupo A : pacientes que no recibieron inmunoterapia hasta que se constatara recaída citogenética Grupo B : pacientes que al diagnosticarse recaída molecular iniciaron inmunoterapia. Pacientes con recaída citogenética: iniciaron inmunoterapia al diagnosticare la misma. Grupo "A" Grupo "B" Progresión a recaída citogenética 100% 35,7%± 21% Remisión al instaurarse inmunoterapia 67% 71% Probabilidad de remisión molecular* 100% 78,6%± 17,8% Supervivencia general tras recaída molecular 66.7% ± 19.3% 57.1% ± 24.9% * estimada con el método de Kaplan-Meier 13 de 18

14 Fue observado un menor grado de remisión en los pacientes que progresaron directamente a la recaída citogenética; de los cuatros pacientes a los que se les diagnosticó recaída citogenética y recibieran tratamiento inmusupresor 2 alcanzaron remisión molecular (50%). El autor concluye reconociendo el papel que desempeña la intervención temprana para evitar la progresión de la enfermedad, pero a la par remarca que dicho beneficio no se trasladó en una mayor sobrevida. El Comité asesor de servicios médicos de Australia (2003) llevó a cabo una revisión de la literatura existente para evaluar la precisión de la prueba PCR para el diagnóstico y monitoreo del BCR-ABL en pacientes con LMC. Las búsquedas están actualizadas a Octubre del 2002 y se realizaron en Medline; Embase; Current Content; Cancerlit; Cochrane Library (Systematic Reviews & Controlled Trials Register); NHS Centre for Reviews and Dissemination databases (DARE, HTA, NHS EED). De la exploración realizada cumplieron criterio de elegibilidad 55 artículos. De los que evaluaron la utilidad de la PCR cuantitativa en el monitoreo de la enfermedad, solo cinco estudios fueron realizados utilizando PCR en tiempo real 7, Autor y año Características de la muestra Tipo de PCR utilizada RT-PCR en Serie de casos tiempo real retrospectivo (cuantitativa) Amabile et N=48 al., (2001) 17 Remisión completa Comparador: post-trasplante Estudio citogenético Criterios de elegibilidad Resultados Comentarios Pacientes con diagnóstico inicial de LMC o con remisión completa(ph positivo). - El estudio no aclara el coeficiente Correlación significativa de correlación. entre el nivel cuantitativo - No queda claro si los pacientes de BCR-ABL y los fueron seleccionados niveles de cromosoma consecutivamente Ph (P<0.01) Correlación entre niveles de transcripción Elmaagacli et al., (2000) 18 Serie de casos Pacientes consecutivos RT-PCR en tiempo real (cuantitativa) N= 65 (39 recaídas Correlación incluyendo recaída con estudio molecular) citogenético y hematológico Pacientes con BCR- ABL positivo y estadio de la enfermedad Nivel de transcripciones bcr-abl medio normalizado (%) según tipo de recaída: Molecular 0,004 Citogenético 0,4 Hemtaológico 2,6 - La incapacidad para evaluar la sensibilidad, especificidad y cocientes de probabilidades, limita la utilidad de este estudio Crisis blastica 36 (P<0.001) RT-PCR en Serie de casos Branford et Prospectivo al., (1999) 19 N=53 tiempo real (cuantitativa) Correlación con estudio Pacientes con LMC, BCR-ABL positivo Correlación entre BCR- ABL normalizado y % Ph positivo r=0,94 (P<0.0001) - No hay datos sobre la capacidad de la PCR para predecir la recaída citogenético 14 de 18

15 - Ausencia de detalles sobre Serie de casos Emig et al., N=120 (1999) 20 RT-PCR en tiempo real (cuantitativa) Correlación con estudio citogenético Pacientes con LMC Correlación significativa métodos de selección y entre los coeficientes características de los pacientes. determinados por PCR - Mayoría de las muestras en tiempo real y la provenían de pacientes bajo proporción de tratamiento con IFN (219 cromosoma Ph muestras) reportado por estudio - El resto: post trasplante (17 citogenético. (P<0.0001) muestras) y post quimioterapia (11 muestras) Serie de casos RT-PCR en tiempo real (cuantitativa) Validez de la PCR Pacientes con LMC, con cuantitativa en 18 meses o más de comparación con la haber sido trasplantados recaída posterior - Basa la positividad del estudio en el incremento de BCR-ABL en pruebas secuenciales - No especifica el momento de la Radich et al., (2001) 7 Pacientes consecutivos, N= 379 Correlación con estudio citogenético y/o hematológico de MO citogenética y / o hematológica: evaluación hematológica y citogenética Excluye a pacientes que Sensibilidad 90% (95% hayan recaído 14 días o CI 56, 100) - No existe una diferencia significativa entre el número de antes de la prueba PCR Especificidad 62% (95% pruebas PCR en el grupo que CI 50, 74) recayó y en el que no lo hizo El comité Australiano concluye que la utilización de la PCR cuantitativa en monitoreo de la enfermedad mínima residual, redundaría en una modificación del tratamiento ante una recaída temprana, con la subsiguiente mejoría en el pronóstico del paciente La guía de la NCCN 10 publicada en el 2007 sugiere que para el monitoreo de la LMC el diagnóstico de la remisión citogenética basado en la ausencia del cromosoma Philadelphia, debe ser evaluado por estudios citogenéticos. Una vez que estos se negativizaran pueden ser utilizadas técnicas con mayor sensibilidad como la FISH. Sin embargo postula que cuando el paciente alcanzó niveles bajos de positividad con FISH, esta técnica deja de ser útil para el monitoreo de una mayor reducción de la aberración cromosómica. Es aquí donde pruebas con mayor sensibilidad, como es el caso de la PCR, cobran valor para el monitoreo de la enfermedad. Los estudios con PCR no son necesarios de obtener, salvo en pacientes que presentan un estudio citogenética negativo para la detección de cromosoma Philadelphia, o que tienen niveles bajos de positividad mediante FISH. En pacientes que están recibiendo imatinib como terapia, la guía refiere que el número de transcripciones de BCR-ABL, evaluado con PCR cuantitativa, estaría asociado con una sobrevida libre de progresión. Aquellos pacientes que tienen una reducción de la tasa de trascripción de BCR-ABL de al menos de 3-log al año de tratamiento, la probabilidad de quedar libre de progresión es del 100% a los 19 meses. Esto puede compararse con un 95% logrado en pacientes que habían alcanzado una remisión citogénica completa con una reducción inferior a 3-log, y con un 85% para los pacientes que no habían logrado la remisión citogénica (P < 0.001). 15 de 18

16 Estas guías proponen la utilización de la PCR cuantitativa para el monitoreo de la respuesta a la terapia con imatinib de la siguiente manera: Al momento del diagnóstico, realizar una cuantificación de las transcripciones de BCR-ABL mediante PCR antes de iniciar el tratamiento. Mientras el paciente muestra respuesta al tratamiento, realizar la cuantificación de la transcripción cada 3 meses. Si los niveles de trascripción parecieran estar en aumento (aumento de 1 log), debería repetirse la medición en un mes, si se confirma el aumento del nivel de trascripción, se deberían realizar cuantificaciones mensuales y considerar la evaluación de mutaciones. Por último la guía remarca que actualmente, no existen directrices para modificar la terapia basada en el aumento de las transcripciones BCR-ABL detectada por la PCR cuantitativa. Un aumento en los niveles de trascripción de BCR-ABL podría estar asociado a un mayor riesgo a futuro de desarrollo de una mutación en el gen abl. El comité británico para los estándares en hematología 11, en sus recomendaciones para el manejo de la LMC BCR-ABL positiva (2007), afirma que es siempre importante confirmar la sospecha diagnóstica de LMC Ph positivo, refiriéndose como análisis esenciales al estudio completo de sangre a la microscopía, el estudio citogenética de MO y la evaluación cuantitativa con PCR en tiempo real de las trascripciones BCR-ABL. El comité menciona al PCR en tiempo real como el pilar para el monitoreo de los pacientes que parecen tener una respuesta al tratamiento. En la misma guía se recomienda la utilización de la PCR en tiempo real una vez alcanzada la remisión citogenética, dada su mayor sensibilidad, y sugiere que una recomendación razonable es cuantificar los niveles de trascripción cada 3 meses de manera indefinida. Si los niveles de trascripción se elevaran, los estudios deberían repetirse tan pronto como sea conveniente, sin esperar que pasen los 3 meses. De confirmarse el ascenso, se debería examinar la MO en búsqueda de mutaciones. La información adicional obtenida de estas pruebas contribuirá a la decisión terapéutica. En esta guía, una reducción de 3-log cuantificada con PCR en tiempo real, es referida como la mayor respuesta molecular. 6. POLÍTICAS DE COBERTURA Una financiadora de salud Estadounidense, considera como médicamente necesario a la PCR cuantitativa en la LMC para monitoreo de la enfermedad y evaluación de respuesta a terapéutica. 21 El comité asesor de servicios médicos de Australia (MSAC) se basó en estudios de series de casos para evaluar la costo/efectividad de la PCR en el monitoreo de enfermedad mínima residual en pacientes con LMC. El comité concluye reconociendo la utilidad de la PCR cuali o cuantitativa en el monitoreo de la LMC. 16 de 18

17 7. IMPLICANCIAS ECONOMICAS Tanto la PCR en tiempo real como la competitiva tienen un costo aproximado de $1.600 a $2.200 (pesos argentinos año 2007). 8. CONCLUSIONES La evidencia encontrada acerca de la utilidad de la PCR cuantitativa en tiempo real para el monitoreo de la LMC consta de estudios y guías que en general se basan en trabajos con pocos pacientes y de pobre calidad metodológica. A pesar de que existe consenso acerca de la mayor sensibilidad que presenta la PCR en tiempo real en comparación con los estudios citogenéticos u otras pruebas cualitativas, se desconoce si su utilización en el seguimiento rutinario redundaría en un beneficio en el pronóstico de los pacientes. Ante valores elevados (o elevación de valores preexistentes) indicados por PCR cuantitativa, diversas guías proponen realizar una nueva evaluación citogenética, pero actualmente no existe consenso sobre que modificaciones realizar en el tratamiento basándose solo en los resultados de la PCR. 17 de 18

18 9. REFERENCIAS 1. Goldman JM, Melo JV. Chronic myeloid leukemia--advances in biology and new approaches to treatment. N Engl J Med 2003;349(15): Faderl S, Talpaz M, Estrov Z, O'Brien S, Kurzrock R, Kantarjian HM. The biology of chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 1999;341(3): Pavón Moran V, Hernandez Ramirez, Porfirio, Martinez Antuna, Gisela et al. Leucemia mieloide crónica: Actualización en Citogenética y Biología Molecular. Revista Cubana Hematología Inmunología Hemoterapia 2005;21(2). 4. Sawyers CL. Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 1999;340(17): De Vita VT HSea. Cancer: Principle and Practice of Oncology. 6 ed: Lippincott, Williams & Wilkins; Kantarjian HM, Deisseroth A, Kurzrock R, Estrov Z, Talpaz M. Chronic myelogenous leukemia: a concise update. Blood 1993;82(3): Radich JP, Gooley T, Bryant E, et al. The significance of bcr-abl molecular detection in chronic myeloid leukemia patients "late," 18 months or more after transplantation. Blood 2001;98(6): Kurzrock R, Gutterman JU, Talpaz M. The molecular genetics of Philadelphia chromosomepositive leukemias. N Engl J Med 1988;319(15): Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006;108(1): National Comprehensive Cancer Network. Clinical Practice Guidelines in Oncology: Chronic Myelogenous Leukemia British Committee for Standards in Haematology. Recommendations for the Management of BCR-ABL-positive Chronic Myeloid Leukaemia The Medical Services Advisory Committee. Polymerase chain reaction in the diagnosis and monitoring of patients with BCR-ABL gene rearrangement in chronic myeloid leukaemia Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y) 1993;11(9): Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, et al. Standardization and quality control studies of 'realtime' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003;17(12): Guo JQ, Lin H, Kantarjian H, et al. Comparison of competitive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients. Leukemia 2002;16(12): Kim YJ, Kim DW, Lee S, et al. Preemptive treatment of minimal residual disease post transplant in CML using real-time quantitative RT-PCR: a prospective, randomized trial. Bone Marrow Transplant 2004;33(5): Amabile M, Giannini B, Testoni N, et al. Real-time quantification of different types of bcr-abl transcript in chronic myeloid leukemia. Haematologica 2001;86(3): Elmaagacli AH, Beelen DW, Opalka B, Seeber S, Schaefer UW. The amount of BCR-ABL fusion transcripts detected by the real-time quantitative polymerase chain reaction method in patients with Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia correlates with the disease stage. Ann Hematol 2000;79(8): Branford S, Hughes TP, Rudzki Z. Monitoring chronic myeloid leukaemia therapy by real-time quantitative PCR in blood is a reliable alternative to bone marrow cytogenetics. Br J Haematol 1999;107(3): Emig M, Saussele S, Wittor H, et al. Accurate and rapid analysis of residual disease in patients with CML using specific fluorescent hybridization probes for real time quantitative RT-PCR. Leukemia 1999;13(11): AETNA. Clinical Policy Bulletin: Polymerase Chain Reaction Testing: Selected Indications (11/12/2007). Report No: de 18