CAPÍTULO INTRODUCCIÓN

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1 CAPÍTULO VALIDACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS INTRODUCCIÓN El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se realiza mediante la detección directa e indirecta de los agentes infecciosos. Mediante los métodos directos se detectan las partículas de los agentes infecciosos y/o sus componentes, tales como los ácidos nucleicos, las proteínas estructurales y no estructurales, los enzimas, etc. Los métodos indirectos ponen de manifiesto los anticuerpos inducidos por las infecciones. Los métodos más comunes de detección directa son: el aislamiento o el cultivo in vitro, la microscopía electrónica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica, el enzimoinmunoensayo (ELISA para antígenos), la hibridación de ácidos nucleicos (NAH), las micromatrices y macromatrices y las diversas técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o los métodos de amplificación isotérmica, como por ejemplo la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NSABA), la amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP). También se denominan métodos de diagnóstico molecular, puesto que los ensayos de NAH, de macro y micromatrices y los diversos ensayos de amplificación tienen como objetivo las moléculas de ácidos nucleicos. Los métodos indirectos más comunes de detección del agente infeccioso son las pruebas serológicas tales como: la neutralización vírica, la detección de anticuerpos mediante el ELISA y las pruebas de inhibición de la hemoaglutinación,a las que se han incorporado otras más novedosas, tales como el método de los biosensores, la bioluminometría, el método de la fluorescencia polarizada, los ensayos de quimioluminiscencia, etc. En general, los laboratorios de diagnóstico aplican simultáneamente los dos métodos para garantizar un diagnóstico seguro. Las experiencias de las dos últimas décadas indican que las técnicas de la PCR finalmente sustituirán a muchos de los métodos directos clásicos de detección de agentes infecciosos. Está claro que la PCR está reemplazando el aislamiento de virus o el cultivo de bacterias para la detección de agentes que son difíciles o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta tendencia, teniendo en cuenta que el aislamiento de los virus requiere: i) la presencia de los microorganismos que se replican (virus o bacterias); ii) cultivos celulares caros y el mantenimiento de las instalaciones; iii) hasta varias semanas para completar el diagnóstico en algunas ocasiones; y iv) una pericia especial, que se está perdiendo o disminuyendo hoy en muchos laboratorios. Aunque los ensayos de la PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en día son herramientas relativamente baratas, seguras y fáciles de utilizar en los laboratorios de diagnóstico (2, 4, 6, 7, 11, 13). Generalmente, la sensibilidad y la especificidad de la PCR son mayores que los procedimientos ELISA de captura del antígeno. La introducción de varios métodos de la PCR en tiempo real, de robots para la extracción del ácido nucleico y de estaciones de trabajo automatizadas ha dado como resultado hoy en día a un gran volumen de trabajo y a ensayos muy fiables, rápidos y sólidos para el diagnóstico molecular. Manual de la OIE sobre animales terrestres

2 1. Principios de la técnica de PCR A. MÉTODOS DE LA PCR UTILIZADOS EN LOS DIAGNÓSTICOS MOLECULARES RUTINARIOS La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica que en el ensayo hay una reacción de amplificación basada en enzimas. El término reacción en cadena se refiere a varios ciclos de copiado de un tramo específico de ADN, en este caso a partir del genoma del agente infeccioso. La región que hay que amplificar está definida por dos (o más) secuencias de nucleótidos cortos denominados sitios de los cebadores, que flanquean a la secuencia diana. Los cebadores, oligonucleótidos cortos que son complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de ADN para ser copiadas. Utilizando una polimerasa que no se desnaturalice durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia diana uniendo los nucleótidos libres a los cebadores. Repitiendo el régimen de ciclos de calentamiento de 20 a 40 veces, la cantidad de ADN diana copiado que se obtiene aumenta de forma exponencial, produciendo suficiente para operaciones posteriores, tales como la detección, la clonación y la secuenciación. La sensibilidad de diagnóstico de la PCR es muy alta, porque se producen varios millones de copias de la diana seleccionada. La especificidad de la reacción puede ser también muy alta, ya que está determinada por las secuencias específicas de nucleótidos de la diana seleccionada, así como por el diseño del cebador. Los cebadores pueden diseñarse para detectar secuencias específicas de nucleótidos en los genomas de los agentes infecciosos diana seleccionados o pueden diseñarse para ser complementarios de regiones más conservadas, permitiendo de este modo la detección de miembros dentro de una familia o género del agente infeccioso. Se ha publicado una sinopsis más detallada de las técnicas moleculares (17). a) Amplificación del ADN Si el genoma del agente infeccioso es de ADN, la amplificación se realiza directamente, con o sin purificación previa del ADN diana. En muchos casos el empleo de ADN extraído y purificado del material que se va a utilizar en la prueba, dará como resultado un aumento en la sensibilidad analítica y diagnóstica. b) Amplificación del ARN (PCR de trascripción inversa) Los genomas de muchos agentes infecciosos contienen ácido ribonucleico (ARN) que no se puede amplificar directamente mediante la PCR. Para la amplificación por PCR se necesita un ADN diana monocatenario, y éste no está disponible en los virus de ARN. El problema puede resolverse por la adición de una etapa antes de comenzar la PCR. Utilizando la transcriptasa inversa, el ARN se puede transcribir a ADN complementario (ADNc), que es ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en el ensayo de la PCR (el procedimiento se denomina PCR de trascripción inversa: RT-PCR). Tradicionalmente, la reacción de trascripción inversa se realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se transfiere después a un tubo nuevo para la reacción de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de polimerasas de ADN termoestables con actividad transcriptasa inversa y tampones específicos en los cuales las polimerasas RT y ADN están activas. Ambas permiten una reacción RT-PCR que tiene lugar en el mismo tubo en secuencia directa sin manipulación adicional y con menos probabilidad de seguir contaminando. En la mayoría de los casos será necesario extraer y purificar el ARN antes de la trascripción inversa. c) Detección del amplímero por la PCR El producto PCR o amplímero puede detectarse utilizando varios procedimientos. El más común incluye la detección no específica del producto de la PCR, basada en una medida amplímera utilizando electroforesis en gel de agarosa y tiñendo el ADN con un tinte intercalado no específico, como el bromuro de etidio (ahora es posible reemplazar este último con tintes no cancerígenos, por ejemplo GelRed, o el reconocimiento específico de la secuencia diana amplificada utilizando una transferencia de ADN por Southern blot seguido de hibridación con sondas de oligonucleótidos complementarias de la secuencia diana. Las sondas de hibridación pueden ser, enzima, marcado como quimioluminiscente o radionucleótido para permitir la detección de la secuencia diana específica. Más adelante se dan algunos ejemplos de métodos de la PCR utilizados actualmente. 2. PCR convencional En la PCR convencional (o simplemente PCR) se utiliza un par de cebadores oligonucleótidos para amplificar una parte pequeña del genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analítica es relativamente alta con un número mínimo de 100 a 1000 copias de ADN diana detectable. La especificidad analítica puede ser alta, dependiendo de la selección de la diana, del cebador designado, y de la optimización de la prueba. La sensibilidad y especificidad analíticas se pueden mejorar mediante la aplicación de la PCR anidada (véase más adelante el punto 3). La especificidad y la sensibilidad se pueden mejorar posteriormente utilizando el método 2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

3 Southern blot seguido de las sondas de hibridación, pero esto lleva mucho tiempo y requiere el manejo en el laboratorio de ADN amplificado, y la interpretación de los resultados puede ser técnicamente subjetiva. Esta detección de los métodos, basada en la complejidad y los gastos, no es una práctica común hoy en día en los laboratorios de diagnóstico. 3. PCR anidada En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos ciclos de amplificación con cuatro cebadores, denominados cebadores externos e internos. En general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan una sensibilidad y especificidad analíticas superiores si se comparan con las pruebas de la PCR convencionales. Sin embargo existe un alto riesgo de contaminación cruzada dado que los productos de la primera tanda de amplificación se utilizan a menudo como molde inicial para la segunda tanda, dando como resultado la transferencia de material entre los diferentes tubos de PCR. La PCR anidada ha sido ampliamente reemplazada por los protocolos de la PCR en tiempo real, los cuales son igualmente sensibles, pero tienen un riesgo de contaminación mucho menor. La sensibilidad analítica es típicamente <10 copias de genoma del agente infeccioso, y la especificidad analítica también aumenta porque, en la PCR anidada, cuatro oligonucleótidos tienen que unirse específicamente a las dianas seleccionadas para producir una reacción positiva (4). 4. PCR en tiempo real La PCR en tiempo real difiere de la PCR estándar. Aquí los productos de la PCR amplificados son detectados directamente durante los ciclos de amplificación utilizando sondas de hibridación que incrementan la especificidad del ensayo. Diversos métodos en tiempo real, tales como los ensayos que se realizan con las sondas fluorescentes TaqMan, los cebadores Scorpion, la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET), la transferencia de energía con cebadores-sondas (PriProET), la técnica del fluoróforo SybrGreen, la técnica Light- Upon-extension (LUX) y los ensayos con baliza molecular (Molecular Beacon) se han convertido en herramientas con mucha aceptación para la detección de agentes infecciosos. La PCR en tiempo real se ha utilizado para la detección de bacterias, virus o parásitos de una amplia variedad de especies animales (2, 4, 14, 17). Estos ensayos tienen varias ventajas comparados con los métodos clásicos de la PCR convencional o anidada. En general, sólo se utiliza un par de cebadores, presentando, a menudo, una sensibilidad próxima o igual a la PCR anidada tradicional, pero con un riesgo mucho más bajo de contaminación. La fluorescencia, que indica la presencia del producto amplificado, se mide a través de la tapa o del lado del tubo de reacción, de forma que no es necesario el manejo posterior de los productos de la PCR. Estos procedimientos llevan considerablemente menos tiempo si se compara con la detección tradicional de los productos de la PCR en geles de agarosa, seguidos de la tinción con bromuro de etidio o el equivalente a la tinción de detección del ADN con lo que, de nuevo, se reduce el riesgo de contaminación. El empleo de la modalidad de placa de microtitulación de 96 pocillos, sin la necesidad de la PCR anidada, permite que el procedimiento sea automático y apropiado para pruebas a gran escala (10, 17). El diagnóstico se puede automatizar posteriormente utilizando robots para las extracciones de ADN/ARN y el pipeteo. En comparación con los métodos clásicos, una ventaja adicional de la técnica de la PCR en tiempo real, es que es posible realizar ensayos cuantitativos (6, 7). Utilizando la PCR en tiempo real, el tiempo de diagnóstico puede acortarse de horas a minutos. La PCR en tiempo real también puede utilizarse para la PCR de trascripción inversa, usando protocolos de una etapa, que permiten que la etapa de la RT y la PCR tengan lugar en el mismo tubo durante el mismo protocolo de la PCR (17). 5. PCR múltiple Se denominan pruebas de PCR múltiple a las PCR que utilizan cebadores múltiples dirigidos a diferentes dianas en un único ensayo. En la PCR múltiple se pueden detectar y diferenciar de forma simultánea varios agentes infecciosos en un único tubo de reacción individual. Los diferentes PCR diana amplificados en una prueba estándar de PCR se identifican basándose en el tamaño del producto de la PCR. El empleo de los métodos de la PCR anidada clásica para la construcción de un ensayo múltiple resulta complicado debido a la necesidad de dianas de diferentes tamaños, así como de cebadores que puedan competir entre sí en la misma mezcla reactiva, todo lo cual puede repercutir negativamente en la eficacia de la PCR. Por el contrario, el concepto de la PCR en tiempo real (pares de cebadores únicos) proporciona excelentes posibilidades para la construcción de sistemas múltiples muy sensibles (2, 4, 9) basados en un tamaño más uniforme de la diana, en unas condiciones de amplificación uniformes y en la detección por separado de las dianas utilizando sondas de hibridación específicas marcadas con fluoróforos diferentes. También debería advertirse que los cebadores comunes pueden utilizarse para amplificar regiones específicas del genoma de un grupo de patógenos y después pueden emplearse las sondas fluorogénicas (TaqMan) para discriminar entre los miembros del grupo. Esta no es estrictamente una PCR múltiple, aunque podría describirse erróneamente como tal. 6. Métodos adicionales de diagnóstico molecular Aunque este capítulo se centra en el diagnóstico molecular basado en la PCR, debería mencionarse brevemente que, además de la PCR, se están introduciendo muchos otros métodos nuevos para la detección molecular de los Manual de la OIE sobre animales terrestres

4 patógenos, por ejemplo, varios métodos de amplificación isotérmica (tales como la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico [NASBA], tecnologías para la amplificación isotérmica mediada por bucles, varias macromatrices y micromatrices utilizando sondas-candado, amplificación de ciclos rodantes y otros enfoques moleculares. Se están evaluando otros enfoques para detectar y analizar los productos de la PCR, tales como MALDI y LUMINEX. La ventaja de estos enfoques, en combinación con la PCR múltiple, es que se hace posible la tipificación de diferentes cepas o tipos a partir de un microorganismo. Es evidente que el arsenal de diagnósticos moleculares se está reforzando con estos métodos. B. PRINCIPIOS DE VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS PARA LAS PRUEBAS DE DETECCIÓN DEL ACIDO NUCLEICO Cuando se realizan los análisis de material clínico es importante obtener datos de buena calidad. Para esto, hay que cumplir algunos criterios clave. Es necesario establecer los sistemas de garantía de calidad (GC) y de control de calidad (CC), esto es, un conjunto de protocolos de calidad, incluyendo el empleo de muestras control, que aseguren que el sistema está funcionando adecuadamente y confirme la calidad de los datos. En muchos laboratorios de todo el mundo ya se han establecido los sistemas GC y CC y hay personal entrenado y competente. La validación de los ensayos es otro factor fundamental para garantizar que los resultados de las pruebas reflejan el estado real de las muestras (8). Para predecir la eficacia de un ensayo diagnóstico, es necesario utilizar una metodología de validación con el fin de documentar los resultados que se esperan del ensayo en cuestión. La validación es la evaluación de un ensayo diagnóstico con el fin de determinar su idoneidad para una utilización concreta. Los principios generales de validación de los ensayos se pueden encontrar en el Capítulo Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas. El presente capítulo extiende estos principios de validación a los ensayos de diagnóstico molecular. Consúltese para la explicación de los términos y las definiciones el capítulo C. VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS INTRODUCCIÓN 1. Selección de una prueba apropiada para el propósito previsto La conveniencia de los ensayos de PCR para varios fines es muy amplia. Donde existe la necesidad de una detección directa de un agente infeccioso, es generalmente posible utilizar la PCR. Durante los primeros años de desarrollo del diagnóstico de la PCR, muchos laboratorios tuvieron problemas con la contaminación y la ejecución; de este modo la PCR tenía una reputación pobre como técnica apropiada para uso diagnóstico. Los logros de los últimos años han cambiado esa opinión. Con la nueva tecnología (por ejemplo la PCR en tiempo real) se ha conseguido que esta técnica sea menos proclive a producir resultados positivos falsos causados por la contaminación, y sea fácil de usar. Además, la automatización de los procedimientos de extracción y pipeteo por medio de robots ha reducido sustancialmente los costes, ha mejorado la repetitividad y ha reducido la cantidad de trabajo necesaria. Durante los primeros años se desarrollaron muchas pruebas a nivel local y su armonización y la validación fueron muy pobres o inexistentes. La OIE, los Laboratorios Nacionales y los Laboratorios de Referencia de la Comunidad Europea (LRCE) tienen un importante papel que jugar en la continuación del trabajo de validación y armonización. Es justo decir que la PCR, tal como se desarrolla actualmente, es segura (con un riesgo bastante bajo de resultados positivos falsos), generalmente validada de alguna manera y apropiada para los propósitos deseados. Más adelante se dan algunos ejemplos específicos de la importancia de la PCR y en el capítulo se pueden encontrar las definiciones de los objetivos perseguidos: Diagnosticar la infección cuando los niveles de anticuerpos son tan bajos que la exposición previa no puede ser confirmada por una prueba de anticuerpo (p.ej. el enzimoinmunoensayo ELISA repetido varias veces en la zona gris durante los programas de erradicación de la leucemia bovina. Discriminar entre la infección y la inmunidad maternal en animales jóvenes (p.ej. terneros jóvenes en los programas de erradicación). Detectar un ácido nucleico bacteriano o vírico cuando la muestra de diagnóstico no es apropiada para el aislamiento del virus debido a la toxicidad (p.ej. el semen o el examen de fetos momificados). En la etapa final de los programas de erradicación, cuando es necesaria una investigación exhaustiva de casos individuales (p.ej. latencia del herpesvirus y los animales reactivos individuales durante los programas de erradicación de la enfermedad de Aujeszky). 4 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

5 Discriminar las cepas vacunales de los virus de campo (Métodos DIVA [que diferencias los animales infectados de los vacunados]). Determinar la relación filogenética de los virus y utilizar esta información para la epizootiología molecular. Facilitar un primer diagnóstico rápido y seguro en situaciones de brote (p. ej. los brotes de influenza aviar muy virulenta. Determinar la carga vírica (p.ej. en las infecciones por el tipo 2 del circovirus porcino). Supervisar de formarápida de los animales vacunados que parecen tener signos clínicos. Detectar las mutantes de los patógenos resistentes a los fármacos, etc. Demostrar la ausencia de infección en los animales vivos o los en productos animales. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que algunos animales infectados puede que no tengan ácido nucleico detectable en los tejidos sometidos a examen. 2. Consideraciones para el desarrollo de la prueba inicial a) Precauciones y controles Teniendo en cuenta la incertidumbre en torno a la seguridad y fiabilidad de la PCR en el diagnóstico rutinario, se deben tomar precauciones especiales en cualquier laboratorio que utilice la técnica de la PCR para la detección de agentes infecciosos, con el fin de evitar resultados positivos falsos o negativos falsos. Estos, junto con los controles internos (miméticos) garantizan la evaluación segura de los resultados, excluyendo los resultados positivos falsos causados por la contaminación. Los controles internos auténticos utilizando genes locales también completan el objetivo de la PCR, pero solo para los reactivos que se encuentran en cantidades excesivas, tales como la polimerasa y los nucleótidos. Una competición mínima implica que se conoce el nivel real de la diana, lo que no sería el caso para las muestras de campo. Los ARN blindados permiten la imitación que se añade en el proceso de extracción, que es un paso para conocer que la extracción ha funcionado. Un control interno auténtico proporciona más seguridad de que la extracción se ha realizado de forma correcta. El punto débil de la utilización de genes locales como controles internos es que dichos genes pueden estar presentes en mayores cantidades que los patógenos diana. b) Precauciones para evitar resultados positivos falsos Los resultados positivos falsos (muestras negativas que presentan una reacción positiva), pueden surgir bien de temas relacionados con el laboratorio, tales como la contaminación cruzada, o factores relacionados con la prueba, como por ejemplo, una realización del ensayo o de la optimización ineficaces. Los restos de productos de las muestras positivas o, más comúnmente, de la contaminación cruzada por los productos de la PCR provenientes de experimentos anteriores constituyen una posible fuente de error, y se han aplicado varias técnicas y herramientas para evitar los resultados positivos falsos de la PCR. Las muestras y los reactivos se deben manejar en campanas de aire de flujo laminar, que se descontaminan regularmente utilizando luz UV y lejía (para que el uso de los rayos ultravioleta sea eficaz, se requiere un mantenimiento muy cuidadoso). La construcción y utilización de soportes de tubos y abridores especiales ayuda a evitar resultados positivos falsos de la PCR (2). Además, se deberían aplicar prácticas de laboratorio seguras, esto es, realizar las etapas básicas (extracción del ADN, preparación y mezcla del cebador, preparación de la muestra, electroforesis de los productos de amplificación con gel de agarosa, etc.) en áreas o dependencias del laboratorio separadas (1,2). Se deben utilizar diferentes juegos de pipetas en cada una de las etapas. Se recomienda el empleo de un desplazamiento positivo y de filtered tips. También se recomienda que diferentes personas lleven a cabo las distintas etapas, que están restringidas a las respectivas áreas del laboratorio. Se deben tomar precauciones para evitar la introducción de material amplificado procedente de laboratorios potencialmente contaminados dentro de las áreas limpias del laboratorio mediante las restricciones en los movimientos de las muestras, los documentos, el equipo, las personas o cualquier otra forma de contaminación potencial. El movimiento en la dirección contraria debería ocurrir sólo después de la descontaminación del equipo y los tubos y del cambio de vestimenta y guantes de laboratorio. Si se considera que la muestra va a contener una gran cantidad de ácido nucleico del agente o diana, es preferible diluirlo antes de introducirlo en las áreas limpias del laboratorio. Manual de la OIE sobre animales terrestres

6 Figura 1. Preparación del laboratorio recomendada para la PCR de diagnóstico en tiempo real. Las muestras que se han de analizar se transfieren al laboratorio de preparación para la extracción del ácido nucleico. La mezcla base para la PCR se prepara en el laboratorio limpio y se transfiere al laboratorio de preparación para su distribución en placas para PCR y para la adición del molde. Los tubos/placas con la reacción preparada se transfieren a la habitación con los aparatos para correr la PCR. El laboratorio limpio se utiliza solo para preparar la mezcla base para PCR; en la habitación no se permiten ni ADN ni productos PCR. Es recomendable una entrada con esclusa de aire al laboratorio limpio para ponerse una bata y zapatos de laboratorio que se utilizarán solo en esta estancia. El laboratorio de preparación se utiliza para procesar las muestras y preparar las reacciones de la PCR (habiéndose preparado la mezcla base en el laboratorio limpio ). En esta habitación no se permite la presencia de productos de la PCR ni nada procedente del laboratorio de preparación se vuelve a introducir en el laboratorio limpio. La habitación de los aparatos contiene las máquinas de la PCR y nada debe volver desde esa habitación al laboratorio limpio o al laboratorio de preparación. Si el laboratorio contiene un sistema de aire controlable, el laboratorio limpio debe ser positivo y los otros dos, negativos. Si se va a aplicar la PCR anidada, se recomienda la disponibilidad de dos habitaciones más: Un segundo laboratorio para PCR para preparar la segunda reacción para la PCR (lo que implica el manejo de productos PCR, cosa que no debe hacerse en el laboratorio de preparación ) y un laboratorio para electroforesis para el análisis de los productos de la PCR en geles de agarosa. También es muy importante incluir controles negativos, p.ej. muestras que sean tan similares a las muestras de la prueba como sea posible, pero sin que contengan la diana. En laboratorios que tengan problemas con la contaminación cruzada, se recomienda al menos un control negativo por cada 5 muestras de diagnóstico. Tanto las muestras de control negativo como las de control positivo deben entremezclarse de forma rutinaria con las muestras de diagnostico para evaluar el funcionamiento de la prueba de la PCR. c) Precauciones para evitar los resultados negativos falsos Se ha demostrado que la PCR es un método muy efectivo para la detección de ácidos nucleicos, tales como los genomas víricos, en muestras clínicas. Sin embargo, en las etapas finales de la infección es posible que un animal infectado ya no tenga ácido nucleico vírico en los tejidos que se están examinando. Por consiguiente, en tales casos los resultados negativos de la PCR deben considerarse como una parte de un examen de diagnóstico complejo. Los resultados negativos falsos (muestras que contienen el agente diana, pero probadas como negativas) se deben en su mayor parte a los efectos inhibidores y/o a los errores de pipeteo; sin embargo algunos problemas atribuibles al manejo de las muestras también pueden provocar resultados negativos falsos. De ahí que se utilicen controles internos como indicadores de la eficacia de la prueba PCR. Los controles internos de la PCR pueden incluir un ADN extraño añadido a la muestra o el ADN ubicuo que se da en la muestra de forma natural. El ADN extraño añadido a la muestra puede incluir imitaciones de ADN o de ARN. Las imitaciones de ADN, oligonucleótidos manufacturados, tienen las mismas secuencias de unión a los cebadores que las de la PCR diana, pero flanquean un fragmento de ADN heterólogo de un tamaño diferente. Las secuencias de nucleótidos de unión al cebador que son idénticas permiten la amplificación simultánea del molde y del mimético en el mismo tubo con una competición mínima. Las diferencias de tamaño permiten una discriminación fácil por medio del análisis de Southern blot. El RNA blindado, un concepto idéntico a los miméticos de ADN, utiliza un fragmento de ARN control envuelto en proteínas protectoras de bacteriófago para proteger o estabilizar el ARN para los ensayos de control o la 6 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

7 estandarización de las pruebas RT-PCR (para más detalles, véase la información anteriormente expuesta sobre controles internos) En los ensayos de la PCR en tiempo real, también es posible emplear controles internos, un gen vigilante que se da en forma natural, un fragmento seleccionado del genoma del animal hospedador como el beta actina, GAPDH o el ARN ribosómico. Mediante el multiplexado de dicho control intrínseco con un fluoróforo indicador específicamente coloreado, es posible comprobar la calidad de la muestra y confirmar la eficacia de la PCR cuando se detectan simultáneamente el agente en estudio y el ADN intrínseco (14). Los controles internos aumentan la fiabilidad de la PCR de diagnóstico (1, 4). Se debe tener precaución al diseñar y validar los controles internos. Es necesario realizar muchas pruebas para garantizar que la amplificación por PCR del control interno añadido no compita con la PCR de diagnóstico ni, por tanto, disminuya la sensibilidad analítica. Los controles internos se emplean en concentraciones ligeramente por debajo del límite de detección de la PCR de diagnóstico para garantizar la realización de la prueba. También debería tenerse en cuenta que los controles internos tienen la desventaja, similar a las muestras descartadas, de no ser representativos del ácido nucleico diana y pueden llevar a resultados negativos falsos. d) Preparación de estándares Los laboratorios de referencia deben proporcionar muestras estándar representativas de un agente infeccioso dado. Dichas muestras pueden ser agentes infecciosos cultivados, especímenes clínicos, etc., que se distribuyen de manera que el agente infeccioso se conserve bien. De esta forma, las muestras se distribuyen congeladas en disolventes orgánicos (p.ej. trizol) o de otras formas adecuadas. Las muestras también se pueden enviar como ácidos nucleicos (congelados, liofilizados o en etanol). Para los detalles específicos, véanse los capítulos individuales sobre las distintas enfermedades. Los laboratorios de referencia deben proporcionar las réplicas apropiadas. La disponibilidad de muestras estándar es crucial para una validación exitosa del ensayo. Desafortunadamente este es el tema más difícil de resolver cuando se planifica un proyecto de validación. No es suficiente con utilizar solo agentes cultivados o muestras descartadas; las muestras de campo auténticas pueden tener características muy diferentes a las muestras generadas en el laboratorio. Puede resultar muy difícil obtener muestras de campo que sean realmente negativas o positivas, sobre todo porque la PCR generalmente tiene una sensibilidad analítica mayor que la mayoría de los métodos de referencia ( estándares de oro ), lo que dificulta el poder determinar el estado de las muestras que se intentan validar utilizando las pruebas ya establecidas. Tal como mencionamos al principio, los laboratorios de referencia podrían ser una fuente potencial para esta clase de muestras de referencia. Alternativamente, los métodos bayesianos ofrecen enfoques probabilísticos para validar las pruebas de diagnóstico en ausencia de una prueba de referencia (5), pero no nos ocuparemos de ellos en este capítulo. D. VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS - PARTE 1 1. Optimización y estandarización de los reactivos y determinación de los parámetros de control importantes La toma, preparación y transporte de muestras (véase el capítulo ) y los métodos de extracción de ácidos nucleicos (véase el capítulo ) son todos parámetros esenciales en la realización de un ensayo y deberían optimizarse para el diagnóstico de las enfermedades. Incluso los métodos adecuados varían dependiendo del tipo de muestra y organismo. En general, el suero sanguíneo, el tejido del cuerpo y las muestras de frotis son muestras adecuadas para la extracción fácil de ácidos nucleicos objeto de estudio, mientras que las muestras de heces, material autolisado y semen son más difíciles de manejar. La extracción del ARN difiere de la del ADN, y el ARN es más proclive a la degradación. Tanto los métodos comerciales (robóticos, columnas de giro, extracciones por procedimientos magnéticos, etc.) como los métodos químicos estándar se utilizan para la extracción del ADN o del ARN. Es fundamental establecer el método más reproducible y eficaz de extracción antes de llevar a cabo una validación posterior del ensayo. Si se cambia el método de extracción, deben generarse unos datos de equivalencia o se debe repetir el procedimiento completo de validación. Todo el equipo utilizado en el proceso debe mantenerse correctamente. Los aparatos que requieren calibración (bloques de calentamiento, refrigeradores, congeladores, termocicladores, pipetas, etc.) deben calibrarse según los protocolos de calidad del laboratorio. También es importante validar apropiadamente el equipo y los protocolos utilizados. Un buen ejemplo es la reciente aplicación de los métodos de extracción robótica en el proceso de diagnóstico rutinario. No es suficiente comparar las características de esta técnica con las del método de extracción previamente utilizado. El robot y el protocolo deben validarse para confirmar que no hay peligro de contaminación cruzada, p.ej. haciendo correr un conjunto de muestras positivas y negativas mezcladas. Manual de la OIE sobre animales terrestres

8 Cuando se realicen los ensayos clásicos o de la PCR en tiempo real, es necesario optimizar todos los parámetros, los protocolos y los reactivos. Un ensayo estandarizado es un método que produce constantemente el mismo resultado para una muestra dada cuando se repite varias veces y cuando se lleva a cabo por diferentes analistas en diferentes laboratorios. Durante la optimización del ensayo de la PCR, también se puede estimar la capacidad del método de no verse afectado por pequeños cambios en los parámetros principales. Es preciso documentar las variaciones intencionadas durante la realización del ensayo de la PCR a fin de caracterizar los parámetros esenciales del mismo. Los ejemplos de tales parámetros son: tiempos de incubación y temperaturas, concentración de tampones, cebadores, MgCl 2, etc., ph, cantidades de otros componentes añadidos (p. ej. dntp, seroalbúmina bovina, etc.). La caracterización de dichos parámetros de control es crucial para la identificación de los puntos esenciales que deben controlarse correctamente en el ensayo. Las variaciones intencionadas de los parámetros pueden conducir a una manifestación preliminar de la robustez del ensayo. 2. Repetitividad En esta etapa debe conseguirse una concordancia entre las réplicas en la realización del ensayo y entre las distintas realizaciones del mismo. Esto proporciona una información importante sobre el ensayo antes de que se lleve a cabo una validación adicional. Si se encuentra una excesiva variabilidad, habrá que corregirla antes de continuar con el proceso de validación. La repetitividad de un ensayo de PCR exige tratar cada réplica como una muestra independiente. Según el cálculo de variación de una réplica (p.ej. un triplicado), se extraen y amplifican 3 alícuotas individuales del analito inicial, y la desviación del valor principal detectado se determina como una indicación de la repetitividad. De este modo, no es aceptable estimar las amplificaciones triplicadas a partir de una extracción. Asimismo las réplicas de pases múltiples deben ser tratadas como muestras individuales. Este proceso generará estimaciones de variabilidad dentro y fuera del ensayo. En un ensayo de PCR en tiempo real, los valores CT producidos por las muestras de réplicas pueden usarse para determinar el coeficiente de variación dentro del pase (CV; véase el capítulo Control de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias. Es importante que el analito que se ha de detectar en la PCR esté en la misma matriz que las muestras de prueba que se van a utilizar en el ensayo. Por ejemplo, si el ensayo se va a utilizar para demostrar la libertad de un agente en la matriz conocida para la actividad de inhibición por la PCR (como el semen con extensores), es muy importante evaluar a fondo la repetitividad. Cuando se introducen en la prueba nuevos lotes obtenidos de los fabricantes de oligonucleótidos u otros reactivos, debe volver a establecerse en cada ocasión la repetitividad de la prueba. 3. Determinación de la especificidad y la sensibilidad analítica La especificidad analítica se define como la capacidad de un ensayo para distinguir el agente objeto de estudio de otros agentes infecciosos. Dicha capacidad se determina mediante el análisis de los patógenos genéticamente relacionados entre sí y el material clínico obtenido de los animales portadores de enfermedades que pueden imitar a (o confundirse con) aquella para la que se ha diseñado la prueba. Es conveniente obtener muestras de campo de animales infectados, pero esto puede resultar difícil o incluso imposible. En tales casos pueden utilizarse los virus crecidos en cultivos celulares. La reactividad cruzada depende en gran medida de los objetivos de la prueba y deben determinarse en cada caso. Es útil realizar estudios in silico como complemento de la valoración del laboratorio. La sensibilidad analítica (o límite de detección) se define como la cantidad más pequeña de un agente detectado por el ensayo, y puede representarse como el número de copias del genoma, de dosis infecciosas, de unidades que integran la colonia, de unidades que forman la placa, etc. del agente que puede detectarse y distinguirse a partir de un resultado cero. Para determinar la sensibilidad analítica se utiliza una dilución de punto final hasta que el ensayo ya no pueda detectar el blanco en estudio en más del 5% de las réplicas. Los fragmentos clonados de los productos de la PCR en estudio se pueden usar como muestras estándar, bien para ADN o como dianas de ARN, siendo este transcrito in vitro al ADN. Las estimaciones de la sensibilidad analítica pueden variar sustancialmente para el mismo ensayo cuando se utilizan diferentes muestras como matrices. Cuando se pone en marcha una serie de diluciones, es importante utilizar un diluyente que tenga cualidades similares a la muestra matriz, por ejemplo diluyendo semen positivo en semen negativo y no en tampón. E. VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS PARTE 2 Las características operativas (o parámetros del ensayo) proporcionan información sobre la eficacia de un método bajo condiciones específicas. En el capítulo se presentan algunas características operativas. 8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

9 1. Determinación de las características operativas del ensayo a) Poblaciones animales de referencia i) Animales de referencia negativos Las muestras negativas, por ejemplo, las muestras de animales que no han tenido una posible exposición al agente pueden ser difíciles de obtener en algunas ocasiones. Con frecuencia es posible recoger muestras de países que tienen erradicada la enfermedad en cuestión. Es importante que las muestras negativas obtenidas sean representativas de las muestras que serán analizadas, por ejemplo: especie, edad, sexo, raza, etc. ii) Animales de referencia positivos Generalmente es problemático encontrar un número suficiente de animales de referencia positivos. Se necesitan animales infectados de forma natural o experimental y su estado positivo se demuestra mediante el aislamiento del agente. Antes de utilizar animales infectados de forma experimental, por favor, véase el capítulo iii) Estado de los animales de referencia determinado por otros ensayos El término estándar de oro/de referencia se utiliza frecuentemente para describir cualquier estándar de comparación y debería estar limitado a los métodos que de forma inequívoca clasifican a los animales como infectados o no infectados. La expectativa general que los nuevos ensayos de la PCR funcionen mejor que cualquiera de los métodos de referencia ya existentes y, por tanto, puede no ser apropiado utilizar el estándar de oro/referencia como una comparación. Esto es especialmente cierto cuando se intenta demostrar que un animal de referencia negativo es realmente negativo. La validación por medio de la PCR de las pruebas moleculares comparándolas con una prueba estándar de oro/referencia puede complicarse por el hecho de que la PCR sea más sensible, dando como resultado una aparente disminución de la especificidad. 2. Determinación del umbral La sensibilidad diagnóstica (DSe: proporción de animales de referencia que se sabe que están infectados, que resultan positivos en el ensayo) y la especificidad (DSp: proporción de animales de referencia que se sabe que no están infectados y que resultan negativos en el ensayo). Se puede calcular el número de muestras de referencia que se requiere para determinar las estimaciones y el margen de error admisible de la sensibilidad y especificidad diagnósticas. Para llevarlo a cabo, debe utilizarse una predicción razonable de la sensibilidad y especificidad diagnósticas. Normalmente, la confianza de la estimación se fija en el 95%. Sin embargo, ninguna fórmula puede explicar los numerosos factores del hospedador/microorganismo que pueden afectar al resultado de la prueba. En el capítulo se esboza el número de muestras requeridas para determinar las estimaciones de la sensibilidad y de la especificidad diagnósticas. En el caso de una enfermedad que no es endémica o no está extendida, puede ser difícil inicialmente conseguir el número de muestras para alcanzar un intervalo de confianza satisfactorio; pero con el tiempo, la acumulación de adicionales mejorará la confianza en el umbral. El uso de muestras descartadas en la PCR es el último recurso, porque tales muestras podrían no ser representativas de muestras infectadas de forma natural. Si las muestras de los animales infectados de forma natural no están disponibles, las infecciones inducidas por medio de esas infecciones naturales miméticas pueden proporcionar muestras útiles. Un ejemplo es la infección transmitida por las garrapatas, que es provocada por la exposición a las garrapatas infectadas. No siempre es posible ajustarse a las normas propuestas (p.ej. las recomendaciones de la OIE sobre las pruebas de validación). Al enfrentarse a números de muestras pequeños para la evaluación de la prueba, o para pruebas que carecen de estándar de referencia, un enfoque consiste en introducir pruebas moleculares como parcialmente validadas y añadir después los datos de validación si se ensaya un número significativo de muestras clínicas. En este sistema los casos positivos se confirman por otros medios, como el aislamiento del patógeno en cuestión o mediante secuenciación, y se confirma también como adecuada (no inhibidora) una muestra de negativos para las pruebas de la PCR en las que se utilizan genes control. Este principio de validación continua permite una rápida introducción de nuevas pruebas y disminuye el coste de la validación. Este proceso debe utilizarse bajo condiciones establecidas. Solo es aplicable cuando existe una sólida evidencia relativa al ensayo de una gama adecuada de cultivos conocidos, a muestras descartadas (para proporcionar datos analíticos) y a algunas muestras clínicas (para demostrar que se dispone de una diana en determinados tejidos) en el sentido de que una prueba puede publicarse como parcialmente validada (15). F. VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS PARTE 3 1. Determinación de la reproducibilidad del ensayo La reproducibilidad es un parámetro importante para la precisión del ensayo. La reproducibilidad se determina en varios laboratorios utilizando una prueba idéntica (protocolo, reactivos y controles). Cada uno de al menos tres Manual de la OIE sobre animales terrestres

10 laboratorios ensayan el mismo conjunto de muestras (un mínimo de 20 muestras), con alícuotas idénticas para cada uno de los laboratorios. Este esfuerzo proporcionará estimaciones de la solidez del ensayo. Las estimaciones de la reproducibilidad son esenciales antes de que pueda considerarse su utilización válida en otros laboratorios. Actualmente apenas se evalúa de forma completa la reproducibilidad en los laboratorios veterinarios de diagnóstico que realizan pruebas de la PCR. Tradicionalmente muchos laboratorios han utilizado pruebas diseñadas por ellos mismos, probablemente por razones de tipo práctico. En la medida de lo posible se deben seguir los métodos estandarizados publicados y validados, especialmente los de los laboratorios de referencia de la OIE, los ECR o laboratorios nacionales. Además, se deben llevar a cabo los procesos de validación interlaboratoriales. Este trabajo servirá de ayuda para estandarizar ensayos, permitiendo una actividad diagnóstica harmonizada en diferentes países. 1. Implementación de programas F. VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS PART 4 Los laboratorios de referencia juegan un papel importante en la implementación de nuevas pruebas moleculares o en la validación de las ya existentes. Se urge a los laboratorios de referencia de la OIE, los ECRL y los laboratorios nacionales a que ayuden en la implementación de nuevos ensayos prometedores en relación con las enfermedades de su interés. Un ejemplo es la asistencia prestada por la OIE y el CDRL para implementar el diagnóstico molecular de la influenza aviar en Europa. 2. Monitorización de la validez de la ejecución de los ensayos a) Interpretación de los resultados de las pruebas factores que afectan la validez de los ensayos Un factor importante que afecta a la interpretación de los resultados de las pruebas es la prevalencia del analito en la población diana. Una prueba de la PCR que sea muy precisa y exacta, incluso con estimaciones de la DSe y la DSp cercanas al 99%, puede aún proporcionar inferencias falsas (véase el capítulo 1.1.3). Para las pruebas de ácido nucleico, los resultado positivos falsos son bastante preocupantes en poblaciones con una prevalencia baja. En este caso, puede ser necesaria la confirmación de los resultados positivos de la PCR mediante el análisis de secuencias del producto amplificado como medio para corregir los errores debidos a la diana inespecífica o a la unión de los cebadores. b) Mantenimiento de los criterios de validación Cuando el ensayo se utiliza como una prueba rutinaria, es importante mantener el CC interno. El ensayo tiene que ser supervisado continuamente con relación a la repetitividad y exactitud. La OIE recomienda que la reproducibilidad entre laboratorios (pruebas del anillo) se compruebe al menos dos veces al año (16). Estas pruebas son administradas normalmente por un laboratorio de referencia, que distribuye conjuntos de muestras, recibe los resultados de otros laboratorios, analiza los datos e informa de los resultados a esos otros laboratorios. Si el ensayo se va a aplicar en otra región geográfica y/o población, podría ser necesario hacer una revalidación o documentar la equivalencia bajo las nuevas condiciones. Debe determinarse la revalidación o equivalencia si la prueba se aplica a una matriz de muestra distinta, por ejemplo, validación en sangre y utilización en otro tejido o validación para tejidos de cabezas de ganado y utilización en otra especie. Pueden requerirse protocolos de extracción diferentes cuando se ensayan especies o tejidos diferentes: los cuales pueden contener factores inhibidores diferentes. Esto es especialmente cierto para los ensayos de la PCR, ya que es muy común que las mutaciones puntuales ocurran en muchos agentes infecciosos (esto es, virus de ARN). Las mutaciones, que se pueden dar dentro de los emplazamientos del cebador o la sonda pueden afectar a la eficacia de un ensayo y, de ser así, los criterios de actuación establecidos ya no son válidos. También es recomendable confirmar de forma regular la secuencia diana de las regiones genómicas seleccionadas para los aislamientos nacionales o regionales de los agentes infecciosos. Esto es especialmente cierto para los emplazamientos de los cebadores si se quiere garantizar que los mismos permanezcan estables con el fin de que no se cuestione la validez de la prueba. Pueden ser necesaria la validación y la estimación de la solidez cuando la prueba se transfiere de un laboratorio de desarrollo al campo, dado que las condiciones pueden ser menos óptimas y el personal ser menos experimentado. REFERENCES 1. BALLAGI-PORDÁNY A. & BELÁK S. (1996). The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in diagnostic PCR. Mol. Cell. Probes, 10, Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

11 2. BELÁK S. & THORÉN P. (2001). Molecular diagnosis of animal diseases. Expert Rev. Mol. Diagn., 1, BELÁK S. (2005). The molecular diagnosis of porcine viral diseases: a review. Acta Vet. Hung., 53, (Review). 4. BELÁK S. (2007). Molecular diagnosis of viral diseases, present trends and future aspects. A view from the OIE Collaborating Centre for the Application of Polymerase Chain Reaction Methods for Diagnosis of Viral Diseases in Veterinary Medicine. Vaccine, 25, BRANSCUM, A.J., GARDNER I.A. & JOHNSON W.O. (2005). Estimation of diagnostic-test sensitivity and specificity through Bayesian modelling. Prev. Vet. Med., 68, BURNS M.J., NIXON G.J., FOY C.A. & HARRIS N. (2005). Standardisation of data from real-time quantitative PCR methods - evaluation of outliers and comparison of calibration curves. BMC Biotechnol., 5, BUSTIN S.A. (2005). Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot of current procedures and preferences. Expert Rev. Mol. Diagn., 5, BURKHARDT H.J. (2000). Standardization and quality control of PCR analyses. Clin. Chem. Lab. Med., 38, ELNIFRO E.M., ASHSHI A.M., COOPER R.J., & KLAPPER P.E. (2000). Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clin. Microbiol. Rev., 13, JUNGKIND D. (2001). Automation of laboratory testing for infectious diseases using the polymerase chain reaction our past, our present, our future. J. Clin. Virol., 20, HUGGETT J., DHEDA K., BUSTIN S. & ZUMLA A. (2005). Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun., 6, (Review). 12. LAUERMAN L.H. (2004). Advances in PCR technology. Anim. Health Res. Rev., 5, (Review). 13. LOUIE M., LOUIE L. & SIMOR A.E. (2000). The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases. CMAJ., 163, MACKAY I.M., AARDE K.E. & NITSCHE A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res., 30, SAWYER J., WAKELEY P., WEST D., FEARNLEY C., ANDERSON S., FLOWERS M., WEBSTER K., ERRINGTON J. & WILLIAMS R. (2006). Discussion 324-5, Practical experiences of moving molecular diagnostics into routine use at the Veterinary Laboratories Agency. Dev. Biol. (Basel), 126, WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2002). OIE Guide 3: Laboratory Proficiency Testing. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, VILJOEN G.J., NELL H & CROWTHER J.R. (2005). Molecular Diagnostic PCR Handbook. IAEA-FAO, Springer, Dordrecht, The Netherlands. * * * NB: Existe un Centro Colaborador de la OIE para el diagnóstico, basado en la tecnología, de las enfermedades infecciosas en medicina veterinaria (véase el cuadro de la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: Manual de la OIE sobre animales terrestres