Alimentos Analizadas ( ) Técnica: Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli O157:H7 USDA/FSIS - CAA art.

Transcripción

1 Alimentos Analizadas ( ) Técnica: Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli O157:H7 USDA/FSIS - CAA art. 255 / 302 Muestras: 117 Totales. Positivas: 37 %

2 Porcentajes de muestras positivas en los distintos alimentos Chorizo 71% Carne molida 40% Hamburguesa 13%

3 Primers Secuencia de oligonucleótidos ( 5-3 ) Stx 1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG Stx 1 b AGCGATGCAGCTATTAATAA Stx 2 a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT Stx 2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT O157F CGGACATCCATGTGATATAGG O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCC Tamaño del fragmento (pb)

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5 Genotipos detectados en Muestras de Alimentos

6 Aislamiento de Salmonella spp. Por tipo de alimento y método de aislamiento utilizado.

7 Fabricantes de estuches comerciales BAX (Qualicon, USA). Salmonella. Listeria. Listeria monocytogenes y E. coli O157:H7 Reactivos en tabletas y termociclador convencional Utiliza un gel de electroforesis No requiere extracción de ADN. La inclusividad y exclusividad son casi del 100%. Los falsos + y falsos son casi cero. Probelia (Sanofi, France). Salmonella. Listeria. El sistema intenta eliminar la contaminación del producto de PCR al sustituir timina por uracilo. TaqMan (Perkin Elmer, USA). Salmonella. En desarrollo para: Listeria y E. coli O157. Sistema de sondas e incorpora el marcador TaqMan que no es fluorescente en su forma nativa pero la actividad exonucleasa de la DNA polimerasa libera un producto fluorescente, el cual es detectado y cuantificado. Cuantifica el microorganismo de interes.

8 Validación (ISO 8402)Es la confirmación mediante la evaluación y la provisión de evidencia objetiva, de que se cumplieron los requisitos para un uso pretendido y específico. Las metodologías publicadas deben ser reproducibles en cualquier laboratorio correctamente equipado. Ej. Validación para Salmonella. 16 laboratorios Secuencia blanco Gen inva Se probaron 364 cepas Resultados: Inclusividad: 99.6% Exclusividad: 100% Metodología como Estandar Internacional.

9 Estudio de Viabilidad Pruebas de validación. Detección en una gama de concentraciones Desarrollo y estandarización del ensayo Debe optimizarse: Toma, preparación, transporte de muestra y método de extracción. Parámetros, protocolos y reactivos. Repetitividad y Reproducibilidad. Sensibilidad (limite de detección.) Dilución de punto final Especificidad analítica El ensayo distingue entre el agente diana y otro agente estrechamente relacionado.

10 Frecuencia de validación (1 año). Perfil térmco. Parámetros de validación: Exactitud, Uniformidad, Heat Rate, Cool Rate, Undershoots, Overshoots. (huella dactilar).

11 Uniformidad

12 Exactitud Overshoot

13 Conclusiones Alta sensibilidad y especificidad, bajo costo, y la versatilidad que posee. Son cada vez más utilizadas para el diagnostico: Screening de los serotipos más frecuentes Resolución de cepas problemáticas (rugosas, autoaglutinantes) Aporta a la Vigilancia Epidemiología: Otorga información segura y a tiempo. Respuesta en tiempo real, ayudando a Identificar el patógeno, determinar el origen y la fuente, demostrando que el patógeno proviene de la fuente, describe la transmisión del patógeno. Relaciona casos aparentemente esporádicos con brotes. Aporta al desarrollo de estrategias de intervención, reducir y controlar la presencia y diseminación de los patógenos. Requieren un cierto nivel de conocimientos en herramientas básicas de biología molecular y la falta de estandarización.

14 Bibliografía (1). Murphy N. M.,. Mc.Lauchlin J, C. Ohai, Grant K. A. (2007) Construction and evaluation of a microbiological positive process internal control for PCR based examination of food samples for Listeria monocytgenes and Salmonella enteric.. International Journal of Food Microbiology 120, (2). Caffer M. I., Terragno R. (2004). Manual de Enetrobacterias: Actualización diagnóstica servicio Enteroacterias, Departamento de Bacteriología. I.N.E.I. /A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrán / CDC/INPPAZ/OMS. (3). Persing D. Smith T, Tenover F. and White T (2004). Principales and Applications. En Diagnostic Molecular Microbiology.,. Part 1; (4). Malorny B, Hoorfar J., Bunge C., Helmuth R. (2003) Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards an international standard. Appl. Environmen. Microbiol.; 69: (5) Rahn K., De Grandis S.A., Clarke R.C., McEwen S.A., Galán J.E., Ginocchio C. Curtis III R., Gyles C.L. (1992) Amplification of an inva gene seqyence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella Mol. Cell. Probes; 6: (6) Caffer M. I., Terragno R., (2000) Manual de procedimientos para la caracterización de Samonella, servicio Enteroacterias, Departamento de Bacteriología. I.N.E.I. /A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrán / CDC/INPPAZ/OMS. (7) Pollard, D.R.; Johnson, W.M.; Lior, H.; Tyler, S. D. and Rozee K. R. (1990) Rapid and specific detection of verotoxin genes in Escherichia coli by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 28: (8) Paton, A. and Paton, J. (1998)Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using Miltiplex PCR assays for stx1, stx2, eae A, enterohemorrhagic E. coli hly A, rfb O11, and rfb O157. J. Clin. Microbiol. 36:

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16 Muchas Gracias! GRACIAS POR SU ATENCIÓN

17 Calidad de los resultados Metodos estandarizados Metodos modificados Verificación Validación

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