MEMORIA DE PRÁCTICAS SALAMANCA LABORATORIO CLÍNICO, LABORATORIO DEL DR. ECHEVARNE

Transcripción

1 MEMORIA DE PRÁCTICAS SALAMANCA LABORATORIO CLÍNICO, LABORATORIO DEL DR. ECHEVARNE Por Isabel Rodríguez Sánchez. Licenciatura en Bioquímica. Facultad de Biología. Universidad de Salamanca

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3 ÍNDICE: INTRODUCCIÓN: A) HEMATOLOGÍA 4 B) MICROBIOLOGÍA.5 C) ORINAS 5 D) PRUEBAS DE FERTILIDAD 7 E) MUESTRAS DE LÍQUIDO SINOVIAL...7 F) MUESTRAS DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO..8 Función del LCR.8 Formación del LCR.8 Circulación del LCR...8 Obtención del LCR.10 A) HEMATOLOGÍA 9 CREATININA KINASA...10 METABOLISMO HEPÁTICO. 12 Calibración del Olympus HEMOGRAMAS...14 Frotis de algún hemograma COAGULÓMETRO SYSMEX...23 MECANISMOS 23 Factores de coagulación. 25 1) Etapas de la cascada de coagulación Mecanismo básico ) Vía intrínseca Formación del factor XI a Formación del factor IX a Formación del factor X a 29 4) Vía extrínseca Formación del factor VII a Formación del factor X a 30 5) Vía común Formación de trombina Formación de fibrina Entrecruzamiento de la fibrina..33 6) Regulación y modulación de la cascada Proteína C Antitrombina III 34 7) Anticoagulantes Para uso In Vitro Anticoagulantes para uso In Vivo (medicamentos anticoagulantes) 35 8) Fibrinólisis 36 COAGULÓMETRO SYSMEX:. 37 Grupo sanguíneo..37

4 B)PRUEBAS DE FERTILIDAD:...38 ESTRADIOL 38 HCG...48 ESPERMEOGRAMA...54 PROGESTERONA..46 Qué es el ciclo menstrual?...47 CICLO REPRODUCTIVO FEMENINO 47 C)MICROBIOLOGÍA:...56 CULTIVO DE ORINA 56 CULTIVO DE EXUDADOS:..56 Exudado faríngeo..58 Cultivo ocular-ótico..58 D)SANGRE OCULTA...60 E) TOXOPLASMA...60 F) MALARIA...60 G) MUESTRAS PARA ENVIAR A BARCELONA:...61 a) MICROBIOLOGÍA...61 b) BIOQUÍMICA...61 c) HEMATOLOGÍA 61 H) FACTURACIÓN DE DOCUMENTOS...62 I) BIBLIOGRAFÍA...62

5 Antes de comenzar el trabajo de laboratorio en el laboratorio tiene lugar: - la calibración del Olympus. - Puesta en marcha del Pentra 80 (aparato destinado a hacer los hemogramas) - Puesta en marcha del lavado de sondas y fijación del coagulómetro Sysmex. - Puesta en marcha del aparato de Uroanálisis. Al mismo tiempo comienza la recepción de los pacientes a los que se les van a extraer las muestras de sangre o solicitar las muestras de orina o se les practicará alguna toma de muestra de exudados. Los pacientes vienen con la tarjeta de su seguro y el volante de su médico correspondientes. Durante la identificación del paciente con estos documentos junto con su correspondiente DNI se le asigna a cada uno de ellos el código de barras que viene en su volante y que figurará en su hoja de extracción y en las etiquetas-pegatinas necesarias para los análisis que el médico solicita en el volante del enfermo. En el laboratorio de análisis clínicos Salamanca se hacen los análisis de: a) HEMATOLOGÍA b) MICROBIOLOGÍA c) ORINAS d) PRUEBAS DE FERTILIDAD e) MUESTRAS DE LÍQUIDO SINOVIAL f) MUESTRAS DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO A)HEMATOLOGÍA: La sangre está constituída por 2 componentes principales: -Elementos formes -Plasma(donde se encuentran las proteínas de coagulación). Al plasma le pueden suceder 2 fenómenos: 1)Que no sufra anticoagulación: En la sangre se observan 2 partes: 1.1.Suero:Es plasma sin proteínas de coagulación. 1.2.Coagulación: donde se encuentran las proteínas de Coagulación. 2)Que sufra anticoagulación: La anticoagulación se produce al añadir un anticoagulante que puede ser: EDTA, CITRATO ó HEPARINA. La otra prueba que se hace de hematología en el laboratorio Echevarne de Salamanca es la prueba de velocidades de sedimentación globular. El primer paso de todo el trabajo de los análisis del laboratorio es centrifugar los tubos de sangre coagulados para que el gel que hay en ellos de densidad intermedia entre el

6 suero y el plasma separe a éstos dejando el plasma en el fondo del tubo y analizar el suero en el Olympus. Esta separación de suero y plasma es necesaria para que no se obstruyan las bombas del Olympus. Las pruebas de hematología que se hacen son: a)alícuotas DE SUERO CONGELADO: Algunas muestras de suero (Carga Viral Hepatitis B, Carga Viral Hepatitis C, insulina, PSA libre) tienen que ir coaguladas para mantener sus propiedades. b)olympus: Se procesan sueros y algunas orinas (Orinas Bioquímica y orinas 24 horas ) c)hemogramas: Sangre total + AEDT. Sirve para analizar: eritrocitos, plaquetas y linfocitos. d)sysmex: Analizar la coagulación de sangre total + citrato e)velocidades DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR: Sangre total+ Citrato Permite comprobar la velocidad de sedimentación de los hematíes, es decir, el tiempo que tardan en caer los glóbulos rojos. b)microbiología: Se hacen: cultivos de orina cultivos de exudados Los análisis microbiológicos se hacen para detectar el microorganismo correspondiente en cada caso, sacar su respectivo antibiograma en Barcelona y poner el antibiótico adecuado al paciente. c)orinas: (Metabolismo de aminoácidos y proteínas) c1)uroanálisis (Sistemático) c2)orinas 24 horas: se hacen en el Olympus. C3)Orinas de embarazo: se hacen Gravindex C4)Sedimentos C5)Análisis de drogas: vienen por parejas: con una se hace un sistemático y de la otra se saca un frasco estéril y se congela la muestra. C1)Uroanálisis (Sistemático) Se pasan por un analizador las orinas impregnadas en unas tiras reactivas en distintos colores para Uroanálisis. El paso inicial del analizador de orinas es la identificación de las orinas mediante la lectura del correspondiente código de barras de cada orina.

7 C2)Diuresis El paciente trae al laboratorio toda la orina miccionada en 1 día en 1 ó 2 garrafas. Se suma la capacidad del volumen total de orina en la garrafa si es la única o en 1 de las 2 si son 2 garrafas. Se mezclan las 2 garrafas (si son 2) en una garrafa del laboratorio destinada para la mezcla y una vez mezcladas se añaden a la garrafa del paciente donde está anotada la suma. Se agita. Se añade una muestra a un tubo de alícuota del Olympus donde se pega la etiqueta Orina 24 horas. Esta orina se hace pasar para ver los iones. C3)Orinas de embarazo Mediante un Gravindex se hace un test de embarazo en orina. CONTROL DE CALIDAD Se incluye con esta prueba un control de procedimiento. Éste se indica con la línea roja en el área de control, el cual es la comprobación de que la prueba se realizó correctamente y de que la tira se encuentra funcionando en buen estado. Esta línea confirma que se utilizó el volumen suficiente de muestra y que se siguieron los pasos del procedimiento correctamente. Se recomienda que un control positivo de hcg (conteniendo ml U/ml hcg ) y un control negativo de hcg (conteniendo 0 ml U/ml hcg )sean evaluados para verificar el funcionamiento apropiado de cada nuevo lote de producto que sea recibido. SIGNIFICADO CLÍNICO: La gonadotropina coriónica humana hcg es una hormona glicoproteína producida por la placenta en desarrollo, poco tiempo después de la fertilización. En un embarazo normal, la hcg puede ser detectada, tanto en orina como en suero, a las 7 ó 10 horas posterior a la concepción. Los niveles de hcg continúan aumentando rápidamente, excediendo los 100ml U/ml al momento del primer período menstrual ausente, llegando a su máximo en ml U/ml en un rango de semanas de embarazo. La aparición de hcg en orina y/o suero, luego de la concepción y su subsiguiente incremento rápido en concentración durante el crecimiento gestacional incipiente, lo hace un excelente indicador para la detección temprana del embarazo. Como se puede ver los resultados vienen marcados por la hormona β-hcg en orina: Resultados:

8 Positivo(2 líneas) Negativo (1 línea C) No válido(1 línea T) C4)Sedimentos: Se hacen pasar para detectar orinas de pacientes con infecciones urinarias. Al microscopio se observan cristales que son consecuencia de esas infecciones urinarias. Esos cristales son de ácido oxálico y de ácido úrico. Dichos cristales originan problemas en el riñón. CRISTALES DE ÁCIDO OXÁLICO CRISTALES DE ÁCIDO ÚRICO D)PRUEBAS DE FERTILIDAD: D1. ESTRADIOL y β-hcg:hormonas femeninas. Este análisis se hace para comprobar si se puede hacer o no una fecundación in vitro. D2. ESPERMEOGRAMA:Análisis del sémen al microscopio. E)MUESTRAS DE LÍQUIDO SINOVIAL: El líquido sinovial es un fluído viscoso y claro que se encuentra en las articulaciones. Tiene la consistencia de la clara de huevo. Su composición es la de un ultrafiltrado del plasma, con la misma composición iónica. El líquido contiene pocas proteínas y células pero es rico en ácido hialurónico sintetizado por los sinoviocitos de tipo B. El líquido sinovial reduce la fricción entre los cartílagos y otros tejidos en las articulaciones para lubricarlas y acolcharlas durante el movimiento. INTRODUCCIÓN: La membrana sinovial es la cubierta interna de la diartrosis o articulaciones sinoviales. Contiene el líquido sinovial, el cual es segregado por la Sinovia que rodea la cápsula articular por su superficie interior. Este líquido forma una fina capa sobre el cartílago articular de aproximadamente 50 μm, infiltrándose en él. De esta forma el cartílago articular puede considerarse como una reserva de líquido sinovial. Durante el movimiento, el líquido es extraído mecánicamente del cartílago para mantener una capa de líquido sobre la superficie del cartílago y disminuir la fricción entre las superficies articulares. El análisis del líquido articular es fundamental siempre que se haga su extracción, no sólo por interés científico-médico para diagnosticar diferentes patologías sino incluso por aspectos legales. Su estudio analítico, citológico, microbiológico así como la búsqueda de cristales e incluso el análisis bioquímico e inmunológico pueden

9 aportar datos suficientes para sentar un diagnóstico definitivo en la patología articular, traumatológica y fundamentalmente en reumatología. La extracción de líquido sinovial apenas tiene contraindicaciones. F) MUESTRAS DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO: El líquido cerebroespinal o cefalorraquídeo, conocido como LCR, es un líquido que baña el cerebro y la médula espinal. Circula por el espacio subaraquidoineo, los ventrículos cerebrales y el canal medular central. Es de color transparente y monse. El líquido cefalorraquídeo puede enturbiarse por la presencia de leucocitos o la presencia de pigmentos biliares. Numerosas enfermedades alteran su composición y su estudio es importante y con frecuencia determinante en las infecciones meníngeas, carcinomatosis y hemorragias. También es útil en el estudio de las enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central o periférico. Contenido: 1. Función del LCR 2. Formación del LCR 3. Circulación del LCR 4. Obtención del LCR 1.Función del LCR El líquido cefalorraquídeo tiene 3 funciones vitales importantes: 1. Mantener flotante el encéfalo, actuando como colchón o amortiguador, dentro de la sólida bóveda craneal. Por lo tanto, un golpe en la cabeza moviliza en forma simultánea todo el encéfalo, lo que hace que ninguna porción de éste sea contorsionada momentáneamente por el golpe. 2. Sirve de vehículo para transportar los nutrientes al cerebro y eliminar los desechos. 3. Fluir entre el cráneo y la médula espinal para compensar los cambios en el volumen de sangre intracraneal (la cantidad de sangre dentro del cerebro), manteniendo una presión constante. 2. Formación del LCR El LCR es producido en un 70% en las placas consideradas de los 4 ventrículos cerebrales, sobre todo los laterales y 30% en el epéndimo a razón de 0,35 ml/minuto ó 500 ml/día. Un adulto tiene 150 ml de éste y se remueve cada 3 o 4 horas. La eliminación del líquido cefalorraquídeo se lleva a cabo a través de las vellosidades aracnoideas, proyección de las células de las aracnoídes sobre los senos vasculares que alberga la duramadre. Estos senos desembocarán directamente en el torrente sanguíneo. En la región más anterior del cerebro está el espacio subaracnoideo de los lóbulos olfatorios que se continúa con un espacio alrededor de los nervios olfatorios (por lo tanto, queda muy cerca de la mucosa olfatoria y del espacio aéreo de la nariz). Desde esta región pasa a los ganglios linfáticos. El fluído cerebroespinal está compuesto por: sodio, potasio, calcio, cloro, sales inorgánicas (fosfatos) y compuestos orgánicos (glucosa). 3.Circulación del LCR La circulación del LCR comienza en los ventrículos laterales, continúa hacia el tercer ventrículo y luego transcurre por el acueducto cerebral (acueducto de Silvio) hacia el 4º ventrículo. Desde allí fluye, a través de un conjunto de orificios: uno central (de

10 Magendie) y 2 laterales (de Luscha), al espacio subaranoideo, que cubre el sistema nervioso central. Por último, el líquido se incorpora al torrente sanguíneo. Todas las superficies ependimarias de los ventrículos y las membranas aracnoideas de líquido y una pequeña cantidad de líquido. Luego abandona el 4º ventrículo a través de 3 pequeñas aberturas laterales, 2 agujeros de Luscha laterales y el agujero de Margendie en la línea media, que ingresan en la cisterna magna, un gran depósito de líquido ubicado por detrás del bulbo raquídeo y por debajo del cerebelo. La cisterna magna se continúa con el espacio subaracnoideo que rodea todo el encéfalo y la médula espinal. Luego, casi todo el líquido encefalorraquídeo fluye a través de este espacio hacia el cerebro. Desde los espacios subaranoideos cerebrales, el líquido fluye en las múltioples vellosidades o granulaciones aracnoideas que se proyectan en el gran seno venoso sagital y otros senos venosos. Por último, se vacía en la sangre venosa a través de las superficies de las vellosidades. 4.Obtención de LCR Se puede obtener, por punción lumbar, por punción cisternal, o por punción ventricular. La obtención de este líquido es importante debido a que es importante elemento de diagnóstico de enfermedades neurológicas, como pueden ser los síndromes meníngeos, las hemorragias subaracnoideas, los tumores cerebroespinales, etc. Para la punción lumbar se utiliza una aguja de aproximadamente 10 cm con mendrial. El paciente puede estar sentado o acostado. Recordando que la médula espinal termina en los niveles L1- L2, ( para no poner en riesgo un daño en la misma, optando por ello el acceso al líquido del filum terminal, que reviste el canal ependimario, con líquido cefalorraquídeo), la punción se realiza entre la 4ª y 5ª vértebra lumbares, y tan sólo se espera a que comience a gotear este líquido. Además, mientras el paciente se encuentra punzado, es posible medir la presión de este líquido con la utilización de un manómetro. Para la punción cisternal, lo único que debe cambiarse es la posición del paciente, el cual sí debe estar sentado, y además con hiperflexión cervical, ya que la aguja se introduce en el espacio occisito-atloideo. Varía de acuerdo donde se coloque el sistema de medición (anatomía); a la posición del paciente, al momento del registro y a la edad. La presión normal depende de la posición del paciente durante su toma así como la edad tomando como base descriptiva a la punción lumbar damos como ejemplo: Posición sentada: -Recién nacido=1,5-8 cm de agua -Menor de 6 años =4-8 cm de agua -Adulto= cm de agua -Cisterna Magna=0-12 cm de agua incluso negativa -Ventrículos=-5 a 8 cm de agua Decúbito lateral (tendido a un costado): -Adulto=6-18 cm de agua. A)HEMATOLOGÍA: Todas las personas sanas disponen de unos niveles normales de glucosa, colesterol. -BIOQUÍMICA- La hemoglobina glicosilada es un análisis que solicitan los médicos en pacientes diabéticos. Los hematíes tienen una vida de unos 90 días, es decir, nuestro organismo regenera hoy los hematíes que mueren hoy porque nacieron hace 90 días. La glucosa se une a la hemoglobina. Por ello, para medir los niveles de glucosa se mide la hemoglobina glicosilada. Por tanto, durante un período de 90 días se miden los niveles de glucosa y colesterol, si éstos se mantienen constantes, la glucemia es la normal, si hay valores muy oscilantes, con mucha diferencia hay problemas de glucemia.

11 Al organismo le interesa mantener: Glucosa Proteínas E Iones en la proporción adecuada. Le interesa eliminar: Urea Creatinina Iones en la proporción que tenga que perder. Dependiendo del esfuerzo físico que hagamos tendremos diferentes clases de metabolismo. Así, sí hacemos: a) Esfuerzo de una acera a otra de enfrente tendremos metabolismo anaerobio. b) Si se hace un esfuerzo más fuerte (intermedio) entonces se consume creatina fosfato. Se trata de un esfuerzo que tira del oxígeno. c) Si el esfuerzo es todavía más fuerte entonces el organismo tira de las reservas. Primeramente tira del glucógeno, si se come menos, de las grasas, conforme aumenta la huelga de hambre se tira de las proteínas y una vez que se echa mano de las proteínas ya no hay nada más que hacer. La creatina fosfato se transforma en creatinina. La creatinina se produce en el músculo. La creatinina es una sustancia muy pequeña que se filtra en el riñón, se puede reabsorber un poquito pero se filtra todo, se hace la creatinina para medir la fuerza del riñón. Al organismo le interesa eliminar urea y creatinina. ClC 2 = 150ml/min Aclaramiento ml de sangre que son depurados de una sustancia determinada en un de la tiempo determinado creatinina Cuanto mejor se elimina la creatinina mejor funciona el riñón.

12 CREATININA KINASA(CK): La creatina quinasa (CK) cataliza la fosforilación del ADP por el fosfato de la creatina, obteniéndose creatinina y ATP. La concentración catalítica se determina empleando las reacciones acopladas de la hexoquinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa a partir de la velocidad de formación del NADH, medida a 340 nm: Fosfato de creatina+adp CK Creatina+ ATP ATP + Glucosa HK ADP + Glucosa 6-fosfato Glucosa 6-fosfato + NADP + G6P-DH Gluconato-6-fosfato + NADPH + H +. CONTENIDO: A. Reactivo 1x40ml 4x40ml B. Reactivo 1x10ml 4x10ml COMPOSICIÓN: A. Reactivo: Imidazol 125 mmol/l, EDTA 2 mmol/l, acetato de magnesio 12,5 mmol/l, D-glucosa 25 mmol/l, N-acetilcisteína 25 mmol/l, hexoquinasa 6000U/l, NADP 2,4 mmol/l, ph=6,7. B. Reactivo: Fosfato de creatina 250 mmol/l, ADP 15 mmol/l, AMP 25mmol/l, P1,P5-di(adenosina-5`-)pentafosfato 102 μmol/l, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa 8000 U/l. CONSERVACIÓN: Conservar a 2-8ºC. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conservan bien cerrados y se evita la contaminación durante su uso. Indicaciones de deterioro: -Reactivos: Presencia de partículas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,300 a 340 nm (cubeta de 1 cm). PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS: Reactivo de trabajo: Añadir el contenido de un frasco del RB a un frasco del Reactivo A. Mezclar suavemente. Si se desea preparar otros volúmenes, mezclar en la proporción: 4 ml de Reactivo A+ 1 ml de Reactivo B. Estable 15 días a 2-8ºC. El reactivo de trabajo se ha de proteger de la luz. EQUIPO ADICIONAL: -Analizador, espectofotómetro o fotómetro con cubeta termostatizable a 25, 30 ó 37ºC para lecturas a 340 nm -Cubetas de 1 cm de paso de luz. MUESTRAS: Suero recogido mediante procedimientos estándar. La creatina quinasa en suero es estable 7 días a 2-8ºC. PROCEDIMIENTO: 1. Precalentar el reactivo de trabajo y el instrumento a la temperatura de reacción. 2. Pipetear en una cubeta: (Nota 1) Muestra 50μl Reactivo de trabajo 1,0ml

13 3. Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro. Poner el cronómetro en marcha. 4. A los 3 minutos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada minuto durante 3 minutos. 5. Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio (ΔA/min). CÁLCULOS: La concentración de CK en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general: ΔA/min x V T x10 6 =U/l εxlxv s El coeficiente de absorción molar (ε) del NADH a 340 nm es 6300, el paso de luz (l) es 1 cm, el volumen total de reacción(v T ) es 1,05, el volumen de muestra (V s ) es 0,05 y 1U/l equivale a 16,67nKcat/l. Se deducen los siguientes factores para calcular la concentración catalítica: x3333 =U/l ΔA/min x55561=n kcat/l VALORES DE REFERENCIA: Temperatura Hombres Mujeres Reacción U/l nkcat/l U/l nkcat/l 25ºC ºC ºC Los niños presentan concentraciones de CK más elevadas que los adultos. Estos valores se dan únicamente a título orientativo, es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia. CONTROL DE CALIDAD: Se recomienda el uso de los Sueros Control Bioquímica niveles I(cod , y 18042) y II(cod , y 18043), para verificar la funcionalidad del procedimiento de medida. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de Calidad interno, así como procedimientos de corrección en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias aceptables. CARACTERÍSTICAS METROLÓGICAS: -Límite de detección:9,2 U/l=153 nkcat/l -Límite de linealidad:1300u/l=21617 nkcat/l Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra ½ con agua destilada y repetir la medición. - Repetibilidad (intraserie): Concentración media CV n 1750U/l=2917 nkcat/l 1,8% U/l=9452 nkcat/l 0,7% 20 - Reproducibilidad (interserie): Concentración media CV n 1750U/l=2917 nkcat/l 1,3% 25

14 567U/l=9452 nkcat/l 1,1% 25 - Sensibilidad:0,3ΔmA*L/U*min=50,3ΔmA*L/nkcat*min - Veracidad: los resultados obtenidos con estos reactivos no muestran diferencias sistemáticas significativas al ser comparados con reactivos de referencia. Los detalles del estudio comparativo están disponibles bajo solicitud. - Interferencias: la bilirrubina(<20mg/dl) y la hemólisis(hemoglobina<10g/l) no interfieren. La lipemia interfiere (triglicéridos >5g/l). Otros medicamentos y sustancias pueden interferir. Estos datos han sido obtenidos utilizando un analizador. Los resultados pueden variar al cambiar de instrumento o realizar el procedimiento normalmente. CARACTERÍSTICAS DIAGNÓSTICAS: La cretina quinasa (CK) desempeña una importante función en el músculo proporcionando ATP, cuando el músculo se contrae, a partir de ADP y utilizando creatina fosfato como reservorio de fosforilación. La creatina quinasa sérica procede fundamentalmente del músculo y su concentración depende de una serie de variables fisiológicas (sexo, edad, masa muscular, actividad física y raza). La concentración sérica de CK se encuentra notablemente elevada en pacientes con algunas de las enfermedades del músculo esquelético (distrofia muscular, miositis, poliomisitis, hipertemia maligna, trauma, rabdomiolisis aguda ), del sistema nervioso central (enfermedad cerebrovascular aguda, isquemia cerebral, síndrome de Reye) y el de tiroides (hipotiroidismo). El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio. NOTAS: 1. Estos reactivos pueden utilizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, si no que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio METABOLISMO HEPÁTICO: El hígado puede tener 3 funciones: a) Almacén b) Síntesis (de proteínas) c) Depurativa Las células del hígado pueden tener 2 enzimas -GPT/ALT -GDT/AST AST está en el núcleo de las células. ALT está en la membrana de las células. Si ALT>AST se produce hepatitis Si ALT<AST se produce cirrosis -GGT es una enzima que aumenta en situaciones de alteraciones biliares y alcoholismo.

15 -FAL es una enzima que participa en alteraciones biliares y bilis extrahepática. Se produce en médula ósea y en niños aumenta. Calibración del Olympus: En la máquina Olympus hay 3 cubetas de reacción SUERO, PLASMA G HK G6P Estas 2 reacciones se hacen para G6P G6PDH NADH 2 saber si los pacientes son o no diabéticos. La sangre contiene glucosa. Al añadir el reactivo R 1 se forma G6P. Si a éste le añadimos G6PDH (R 2 ) se forma NADH 2 Calibración: Además de la glucosa el Olympus puede hacer otras determinaciones para lo cual previamente se ha de calibrar colocándose los controles correspondientes(al igual que los de la Creatina Kinasa) de los cuales se sabe la concentración conocida y como consecuencia de ello el Olympus va a leer la absorbancia correspondiente a cada concentración. Como resultado se obtiene una recta de regresión lineal para cada sustancia.

16 Dichas sustancias en cuestión son las siguientes: Amilasa Auric Ca 2+ L-HDL Fósforo CGT(Ganma Glutamil-Transpeptidasa) LDH Proteínas totales Cl - BBILD CK(Creatina Kinasa) Glu(Glucose) Trg(Triglicéridos) BBILT CREA(Creatinina) GPT(Transaminasa Glutámico Pirúvico) Na BILD LDL GOT(Transaminasa Glutámico Oxalacético) UREA BILT FAL K Las proteínas totales en presencia de un reactivo con Cu 2+ dan un color azul. Puesta en marcha del Olympus una vez calibrado: Una vez calibrado el Olympus ya se pueden ir colocando en él los racs llenos de tubos de suero previamente centrifugados. Según van sucediendo las reacciones en la pantalla aparecen una serie de alarmas de lecturas de reacción de tubos mal leídas. Cuando esto sucede el aparato pita y entonces sobre la bandeja en la que aparecen las filas con los números correspondientes a cada rac con los tubos puestos bocabajo según se han destapado para meterlos en los racs para introducirlos a la máquina de reacción, pues bien, cuando el aparato pita se da la vuelta al tapón correspondiente al tubo mal leído, para que luego, cuando salga de la máquina, ponerlo en otro rac y volverlo a introducir colocando el tapón bocabajo en el número de fila de la bandeja de tapones. Los números deben introducirse calibrados en el Olympus. HEMOGRAMAS QUÉ ES UN HEMOGRAMA? El hemograma es un análisis de sangre en el que se mide en global y en porcentaje los 3 tipos básicos de células que contiene la sangre, las denominadas 3 series celulares sanguíneas: SERIE ERITROCITARIA O SERIE ROJA SERIE LEUCOCITARIA O SERIE BLANCA SERIE PLAQUETARIA Cada una de estas series tiene unas funciones determinadas, y en estas funciones se verán perturbadas si existe alguna alteración en la cantidad o características de las células que las componen. La serie roja está compuesta por los hematíes o glóbulos rojos. Su función primordial es transportar el oxígeno desde los pulmones (a donde llega a través de la respiración) a todas las células y tejidos del organismo. En el hemograma se cuantifica el nº de hematíes, el hematocrito, la hemoglobina y los índices eritrocitarios: - El hematocrito mide el porcentaje de hematíes en el volumen total de la sangre.

17 - La hemoglobina es una molécula que forma parte del hematíe, y que es la que transporta el oxígeno y el dióxido de carbono; se mide su concentración en sangre. - Los índices eritrocitarios proporcionan información sobre el tamaño (VCM), la cantidad (HCM) y la concentración CCH CMI de hemoglobina de los hematíes; el más usado es el VCM o volumen corpusculuar medio. Todos estos valores varían dentro de la normalidad según la edad y el sexo. La serie blanca está formada por los leucocitos o glóbulos blancos. Las funciones principales son la defensa del organismo ante las infecciones y la reacción frente a sustancias extrañas. El recuento de leucocitos tiene 2 componentes: Uno es la cifra total de leucocitos en 1 mm 3 de sangre venosa; el otro, la fórmula leucocitaria, mide el porcentaje de cada tipo de leucocitos, que son: segmentados o neutrófilos, monocitos, linfocitos, eosinófilos y basófilos. El aumento del porcentaje de un tipo de leucocitos conlleva disminución en el porcentaje de otros. Estos valores varían dentro de la normalidad según la edad. La serie plaquetaria compuesta por plaquetas o trombocitos, se relaciona con los procesos de coagulación sanguínea. En el hemograma se cuantifica el nº de plaquetas y el volumen plaquetario medio(vpm). El VPM proporciona información sobre el tamaño medio de las plaquetas. El recuento de plaquetas también varía con la edad. Cómo se realiza? Esta prueba no precisa ayuno previo. Previa desinfección se extraen en torno a 5 cc de sangre venosa, generalmente de una vena de flexura del codo. Tras terminar la extracción y retirar la aguja, se aplica presión en el punto de punción durante unos minutos. Posteriormente se comprueba que no haya hemorragia en dicho punto. Para qué sirve? El hemograma es una prueba que sirve para orientar hacia el diagnóstico de diversas enfermedades que se han sospechado por la historia clínica y la exploración física. A veces, los datos que nos da son suficientes para confirmar o descartar la enfermedad sospechada, pero con frecuencia se necesita utilizar otras pruebas diagnósticas que aportan más información. Cuáles son los factores que intervienen en los resultados? -Serie roja: -Alteración en el tamaño de los hematíes. -Un número muy alto de leucocitos -Hemodilución: aumento de la cantidad proporcional de agua en la sangre. -Deshidratación: pérdida de agua del organismo, que se refleja en la sangre. -Embarazo: porque se produce hemodilución. -Residencia a gran altitud: por ejemplo, la gente que vive en el altiplano andino. -Hemorragia inmediatamente previa a la prueba -Medicamentos. -Serie blanca: -La ingestión de algunos alimentos, la actividad física y el estrés pueden aumentar el número de leucocitos.

18 -Durante el último mes de embarazo y en el parto, puede aumentar la cifra de leucocitos. -Las presiones a las que se han extirpado el bazo pueden tener una elevación leve y persistente de la cifra de leucocitos. -Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir los niveles. -Serie plaquetaria: -La resistencia a gran altitud puede aumentar los niveles de plaquetas. -El ejercicio muy intenso puede aumentar el nº de plaquetas -Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir las cifras. Cuáles son los resultados normales de la serie roja? Los valores que se dan a continuación son solamente orientativos, ya que dependiendo del laboratorio que haga el análisis puede haber variaciones entre las cifras consideradas normales. Recuento de hematíes: Varones adultos: 4,7-6,1 millones/mm 3 Mujeres adultas: 4,2-5,4 millones/mm 3 Recién nacidos: 4,8-7,1 millones/mm 3 Hematocrito: Varones adultos: 42-52% Mujeres adultas: 37-52% Lactantes niños: 33-43% Recién nacidos: 44-64% Posible valor crítico. Hemoglobina Varones adultos: g/dl Mujeres adultas: g/dl Lactantes niños: g/dl Recién nacidos: g/dl Posible valor crítico Volumen corpuscular medio: Adultos/niños/niñas: Recién nacidos: Cuáles son los resultados normales de la serie leucocitaria? -Leucocitos totales: -Adultos/niños>2 años: /mm 3

19 -Niños <2años: /mm 3 -Recién nacidos: /mm 3 -Fórmula leucocitaria:. Neutrófilos o segmentados:55-70% -Linfocitos: 20-40% -Monocitos: 2-8% -Eosinófilos: 1-4% -Basófilos: 0,5-1% Posibles valores críticos: leucocitos<2500 ó >30.000/mm 3 Cuáles son los resutaldos normales de la serie plaquetaria? -Recuentos de plaquetas: -Adultos/niños/as: /mm 3 -Lactantes: /mm 3 -Recién nacidos: /mm 3 Posibles valores críticos: 1 millón /mm 3 Qué profesional sanitario puede y debe realizarlo? Normalmente lo realiza personal de enfermería por indicación de su médico. Puede tener complicaciones? Las únicas complicaciones que puede dar son pequeñas hemorragias en el punto de extracción o hemogramas en la misma zona.

20 HEMOGRAMA: Se hace a partir de sangre total en EDTA. Las poblaciones celulares en la sangre son: Hematíes (glóbulos rojos) Leucocitos (glóbulos blancos) Plaquetas Las células pasan por un acotador de células que tiene un orificio a través del cual pasan y son detectadas por un láser que incide sobre cada una de ellas con lo cual cada vez que pasa una las detecta. Las cantidades normales de poblaciones celulares son las siguientes: HEMATÍES /μl o mm 3 LEUCOCITOS 6.500/μl o mm 3 PLAQUETAS /μl o mm 3 HEMATÍES Mide su Nº Hematocrito Hemoglobina

21 La eritropoyetina o EPO es una hormona glicoproteína que estimula la formación de eritrocitos. En los seres humanos es producida principalmente por el riñón. El uso de la EPO como droga de dopaje en el deporte está prohibido. El efecto positivo de la EPO se debe a que aumenta la masa eritrocitaria(elevando el hematocrito) permitiendo un mejor rendimiento del deportista en actividades aeróbicas. De esta forma se encuentra la resistencia al ejercicio físico. Por tanto, hay EPO sintética en la cara trans del riñón y en el dopaje. Hay que hacer los siguientes cálculos: -VCM -HCM -CHCM -IDE PLAQUETAS: Nos da un número el cual puede bien aumentar o bien disminuir.

22 LEUCOCITOS: Vemos su: Número Población Tamaño Granularidad. Los leucocitos, según su tamaño y granularidad se pueden detectar con un láser. Pueden ser: -Granulocitos -Linfocitos La anemia puede ser detectada con el hemograma. Puede deberse a: -Causas nutricionales. -Agentes infecciosos -Causas tóxicas -Hemorragias Frotis de algún hemograma: Cuando al revisar los resultados de todos los análisis del laboratorio la médico o el jefe de laboratorio detectan entre los hemogramas alguno con un nº alto de leucocitos, es decir, una leucemia, mandan a los técnicos hacer un frotis o extensión sanguínea en un porta, tal y como se muestra en el dibujo y después se tiñe: 1º con colorante azul 2º con colorante rojo 3º con colorante incoloro Se observa al microscopio por el jefe de laboratorio o la médico. Reposición de reactivo en el Aparato de Hemogramas(Pentra 80ABX) Se cambia el reactivo correspondiente dándole a su casilla y cambiando la sonda del recipiente.

23 Se da a lápiz y papel para leer el código de barras y se lee. Se teclea ƴ (Visto Bueno) COAGULÓMETRO SYSMEX: HEMOSTASIA: Hemostasia o hemostasis es el conjunto de mecanismos aptos para detener los procesos hemorrágicos, en otras palabras, es la capacidad que tiene un organismo de hacer que la sangre permanezca en los vasos sanguíneos. La hemostasia permite que la sangre circule libremente por los vasos y cuando una de estas estructuras se ve dañada, permite la formación de coágulos para detener la hemorragia, posteriormente reparar el daño y finalmente disolver el coágulo. MECANISMOS: Los mecanismos de los que consta la hemostasia en la sangre son: -Vasoconstricción: respuesta inmediata (producida por el SN Simpático y por una serie de sustancias liberadas por las plaquetas, tales como: adrenalina, tromboxano y la serotonina) a un daño del vaso sanguíneo, desencadenando un espasmo vascular que disminuye el diámetro del vaso y retrasa la hemorragia. -Hemostasia primaria: es el proceso de formación del tapón hemostático primario o tapón plaquetario, iniciando segundos después del traumatismo vascular. El tapón se forma porque los trombocitos se adhieren fuertemente al colágeno libre del vaso sanguíneo dañado, esto desencadena la liberación de múltiples sustancias químicas, como el ADP, el que aumenta la agregación de las plaquetas permitiendo una mayor unión entre estos elementos figurados, al cabo del proceso el tapón, ya está formado. -Hemostasia secundaria: Comúnmente llamada coagulación. Consiste en la formación de un conglomerado de una proteína llamada fibrina que estabiliza el tapón plaquetario.

24 Cuando se altera suelen aparecer hemorragias tardías, muchas veces en forma de hematomas (colecciones de sangre) en músculos o articulaciones. -Fibrinólisis: Produce también la desintegración del coágulo sanguíneo. COAGULACIÓN: Cuando una lesión afecta la integridad de las paredes de los vasos sanguíneos, se ponen en marcha una serie de mecanismos que tienden a limitar la pérdida de sangre. Estos mecanismos llamados de hemostasia comprenden la vasoconstricción local del vaso, el depósito y agregación de plaquetas y la coagulación de la sangre. Se denomina coagulación al proceso, por el cual, la sangre pierde su liquidez, tornándose similar a un gel en primera instancia y luego sólida, sin experimentar un verdadero cambio de estado. Este proceso es debido, en última instancia, a que una proteína soluble que normalmente se encuentra en la sangre, el fibrinógeno, experimenta un cambio químico que la convierte en insoluble y con la capacidad de entrelazarse con otras moléculas iguales, para formar enormes agregados macromoleculares en forma de una red tridimensional. El fibrinógeno, una vez transformado, recibe el nombre de fibrina. Coagulación es por lo tanto, el proceso enzimático por el cual el fibrinógeno soluble se convierte en fibrina insoluble, capaz de polimerizar y entrecruzarse. Un coágulo es, por lo tanto, una red tridimensional de fibrina que eventualmente ha atrapado entre sus fibras a otras proteínas, agua, sales y hasta células sanguíneas. Por una convención se denomina trombo a un coágulo formado en el interior de un vaso sanguíneo. Contenido: -1)Factores de coagulación -2)Etapas de la cascada de coagulación 2.1 Mecanismo básico -3)Vía intrínseca 3.1 Formación del factor XI a 3.2 Formación del factor IX a 3.3 Formación del factor X a -4)Vía extrínseca 4.1 Formación del factor VII a 4.2 Formación del factor X a -5)Vía común 5.1 Formación de trombina 5.2 Formación de fibrina 5.3 Entrecruzamiento de la fibrina -6)Regulación y modulación de la cascada 6.1 Proteína C 6.2 Antitrombina III -7)Anticoagulantes 7.1 Para uso In Vitro 7.2 Anticoagulantes para uso In Vivo(medicamentos anticoagulantes) -8)Fibrinólisis

25 Factores de coagulación: El proceso de coagulación implica toda una serie de reacciones enzimáticas encadenadas de forma que actúan como un alud o avalancha, amplificándose en cada paso: un par de moléculas iniciadoras activan un número algo mayor de otras moléculas, las que a su vez activan un número aún mayor de otras moléculas,etc En esta serie de reacciones intervienen más de 12 proteínas, iones de Ca 2+ y algunos fosfolípidos de membranas celulares. A cada uno de estos compuestos participantes en la cascada de coagulación se les denomina Factor y comúnmente se lo designa por un número romano elegido de acuerdo al orden en que fueron descubiertos. Siete de los factores de coagulación (precalicreína-factor V-, protrombina-factor IIproconvertina-factor VII-, factor antihemofílico beta-ix, factor Stuart-X-, tromboplastina plasmática-xi- y factor Hageman- XII-) son zimógenos sintetizados en el hígado, esto es, proenzimas que normalmente no tienen una actividad catalítica importante, pero que pueden convertirse en enzimas activas cuando se hidrolizan determinadas uniones peptídicas de sus moléculas. Estas proenzimas, una vez recortadas, se convierten en proteasas de la familia de las serina proteasas; capaces de activar a las siguientes enzimas de la cascada. Una enzima activa recorta una porción de la siguiente proteína inactiva de la cascada, activándola. Algunos factores de coagulación requieren vitamina K para su síntesis en el hígado, entre ellos los factores II(protrombina), VII(proconvertina), IX (antihemofílico beta) y X (Stuart). Facto r Nombre Masa (KDa) Nivel en plasma(mg/dl ) Función I Fibrinógeno Se convierte en fibrina por acción de la trombina. La fibrina constituye la red que forma el coágulo. II Protrombina Se convierte en trombina por la acción del factor X a. La trombina cataliza la formación de fibrinógeno a partir de fibrina. III Tromboplastina o factor tisular Se libera con el daño celular; participa junto con el factor VII a en la acción del factor X por la vía extrínseca. IV Ión Calcio 40 KDa 4-5 Median la unión de los factores IX, X y II a fosfolípidos de membrana. V Procalicreína Potencia la acción de X a sobre la protrombina.

26 VI No existe VII Proconvertina ,05 Participa en la vía extrínseca, forma un complejo con los factores III y Ca 2+ que activa al factor X VIII: C VIII: R Factor antihemofílico Factor Von Willebrand 285 0,1-0,2 Indispensable para la acción del factor X (junto con el IX a ). Su ausencia provoca hemofilia A. >10000 Media la unión del factor VIII:C a plaquetas. Su ausencia causa la enfermedad de Von Willebrand IX Factor Christmas 57 0,3 Convertido en IX a por el XI a. El complejo IX a -VII- Ca 2+ activa al factor X. Su ausencia es la causa de la hemofilia B. X XI Factor Stuart- Prower Tromboplastina plasmática o antecedente trombo plastínico de plasma 59 1 Activado por el complejo IX a -VIII-Ca 2+ en la vía intrínseca o por VII-III-Ca 2+ en la extrínseca, es responsable de la hidrólisis de protrombina para formar trombina Convertido en la proteasa XI a por acción del factor XII a ; XI a activa al factor IX. XII Factor Hageman Se activa en contacto con superficies extrañas por medio de calicreína asociada a quininógeno de alto peso molecular; convierte al factor XI en XI a. XIII Preca licreí na Pretransglutaminida sa o factor Laili- Lorand Activado a XIII a, también llamado transglutaminidasa, por la acción de la trombina. Forma enlaces cruzados entre restos de lisina y glutamina contiguos de los filamentos de fibrina, estabilizándolos. Factor Fletcher Activada a calicreína, juntamente con el quininógeno de alto peso

27 Quini nóge no de alto peso molec ular Factor Fitzgerald- Flaujeac-Williams molecular convierte al factor XII en XII a Coadjuva con la calicreína en la activación del factor XII. Etapas de la cascada de coagulación La cascada de coagulación se divide para su estudio, clásicamente en tres vías: La vía intrínseca, la vía extrínseca y la vía común. Las vías intrínseca y extrínseca son las vías de iniciación de la cascada, mientras que la vía común es hacia donde confluyen las otras dos desembocando en la conversión de fibrinógeno en fibrina. Esta división es un tanto arbitraria y tiene más que ver con las deficiencias de las técnicas que en su momento se utilizaron para desentrañar los mecanismos implicados, que con lo que ocurre realmente en una lesión vascular; ya que en este último caso se establecen varias interrelaciones entre las vías de iniciación. Mecanismo básico Cada reacción de estas vías da como resultado el ensamblado de un complejo compuesto por una enzima(factor de coagulación activado), un sustrato( proenzima de un factor de coagulación) y un cofactor que actúa acelerando la reacción. Estos componentes se ensamblan en general sobre una superficie fosfolipídica y se mantienen unidos por medio de puentes formados por iones Ca 2+. Por lo tanto la reacción en cascada tiende a producirse en un sitio donde este ensamble puede ocurrir; por ejemplo sobre la superficie de plaquetas activadas. Tanto la vía intrínseca como la vía extrínseca desembocan en la conversión del factor X en X a (la letra a como subíndice a significa activado )punto en el que se inicia la vía común. Vía intrínseca Recibe este nombre debido a que antiguamente se pensaba que la sangre era capaz de coagular intrínsecamente por esta vía sin necesidad de contar con la ayuda de factores externos.

28 El proceso de coagulación en esta vía se desencadena cuando la sangre entra en contacto con una superficie extraña, es decir, diferente al endotelio vascular. En el caso de una lesión vascular, la membrana basal del endotelio o las fibras colágenas del tejido conectivo, proporcionan el punto de iniciación. En general las superficies polianiónicas (cargadas negativamente) pueden cumplir el mismo papel, materiales no orgánicos tales como el vídrio, el caolín y algunas resinas pueden actuar como desencadenantes de la reacción. A esta vía es posible subdividirla en tres pasos: Formación del factor XI a En esta etapa participan cuatro proteínas: Precalicreína, Quininógeno de alto peso molecular (HMWK) y los factores XII y XI. Esta etapa no requiere de iones calcio. Estos cuatro factores se adsorben sobre la superficie cargada negativamente, formando el complejo cebador o de iniciación. De estos factores el XII funciona como verdadero iniciador, ya que si bien es una proenzima, posee una pequeña actividad catalítica que alcanza para activar a la precalicreína convirtiéndola en calicreína. En segunda instancia la calicreína actúa catalíticamente sobre el factor XII para convertirlo en XII a, una enzima muchísimo más activa. La actividad catalítica de la calicreína se ve potenciada por el HMWK. Por último la proteasa XII a actúa sobre el factor XI para liberar XI a.. Formación del factor IX a El factor IX se encuentra en el plasma como una proenzima. En presencia de iones Ca 2+ el factor XI a cataliza la ruptura de una unión peptídica en la molécula del factor IX para formar un gloucopéptido de 10 KDa y liberar por otro lado al factor IX a. El factor IX se encuentra ausente en personas con hemofilia tipo B.

29 COAGULÓMETRO SYSMEX Antes de medir las coagulaciones se hace un lavado de sondas con los controles 1 y 2. Coge tampón con cada reactivo factor de coagulación+muestra+cacl 2 La muestra de sangre recogida en citrato ( plasma) tiene eliminados por el citrato los iones Ca 2+. Al añadir CaCl 2 reponemos Ca 2+ para que coagule cuando nos interesa. Cuanto más tiempo tarda en coagular menor coagulación. En este analizador se analizan on line: 3 factores de coagulación: -Cefalina -Fibrinógeno -Protrombina Se hacen para controlar la coagulación del paciente. Miden los factores de la coagulación, que no tengan ningún déficit de coagulación: Formación del factor X a Sobre la membrana de las plaquetas se forma un complejo constituido por los factores IX a, X y VIII. Los residuos ganma-carboxiglutamato de los factores IX a y X actúan como quelantes del ión Ca 2+, permitiendo que estos componentes formen un complejo unido por medio de puentes de iones calcio y ayudando a que el complejo se ancle a los fosfolípidos de membrana. Primero se unen los factores X y IX a a la membrana y luego se une el VIII. El factor y es en realidad un homodímero, formado por cuatro cadenas proteícas, cada una codificada por un gen diferente (VIII:C y VIII:R). El componente VIII:C es conocido como componente antihemofílico y actúa como cofactor del I a en la activación del factor X, el componente VIII:R es el que permite la unión del factor VIII al complejo. La ausencia del componente antihemofílico causa hemofilia A. El complejo formado por los factores IX a -X-VIII-Fosfolípidos y Ca 2+ actúa sobre el factor X para convertirlo en X a.

30 En este punto concluye la vía intrínseca. Vía extrínseca: Recibió este nombre debido a que fue posible notar desde un primer momento que la iniciación de esta vía requería de factores ajenos a la sangre. Cuando la sangre entra en contacto con tejidos lesionados o se mezcla con extractos de tejidos, se genera muy rápidamente factor X a. En este caso la activación de la proenzima X es mediada por un complejo formado por factor VII, Ca 2+ y tromboplastina (llamada también factor III o factor tisular). El factor tisular es una lipoproteína sintetizada en el endotelio de los vasos sanguíneos de todos los tejidos, aunque es especialmente abundante en pulmón, cerebro y placenta. El factor tisular se encuentra normalmente secuestrado en el interior de las células endoteliales y es secretado en respuesta a una lesión, o bajo el efecto de algunas citoquinas tales como el Factor de Necrosis Tumoral(TNF), Interleucina 1(IL-1); o por endotoxinas bacterianas. La vía extrínseca es muy rápida, se cumple en apenas unos segundos y comprende dos pasos; mientras que la intrínseca insume varios minutos. Formación del factor VII a En primera instancia el factor VII se une a la porción fosfolipídica del factor tisular gracias a sus residuos gamma-carboxiglutamato, utilizando iones Ca 2+ como puentes. Este complejo provoca la activación del factor VII a. Formación del factor X a El complejo VII a -III-Ca 2+ actúa sobre el factor X convirtiéndolo en la proteasa activa X a. En este punto termina la vía extrínseca y se inicia la vía común.

31 Vía común: Llegado al punto en que se activa el factor X, ambas vías confluyen en la llamada vía común. La vía común termina con la conversión de fibrinógeno en fibrina, y el posterior entrecruzamiento de la misma estabilizando el coágulo. La vía común implica tres etapas:

32 Formación de trombina La trombina (también llamada factor II a ) es una proteasa generada por la ruptura de la cadena proteíca de la proenzima protrombina (factor II), una glicoproteína constituída por 582 aminoácidos y con 12 puentes disulfuro intracatenarios. La trombina se activa luego de que la proteasa X a: hidroliza dos uniones peptídicas de la protrombina. La X a produce en primer término la escisión de un fragmento de 32KDa de la región N- terminal de la cadena, cortándola sobre una unión arginina-treonina. En segundo término produce la ruptura de un enlace entre una arginina y una isoleucina; sin embargo estos dos últimos fragmentos permanecen unidos por un puente disulfuro. La trombina es una serina-proteasa similar a la tripsina, pero mucho más selectiva. Ataca casi de manera exclusiva las uniones arginina con un aminoácido cargado positivamente en sus sustratos. La conversión de protrombina a trombina debida al factor X a se acelera notablemente por la formación de un complejo con el factor V a y Ca 2+ sobre la superficie de las membranas plaquetarias (fosfolípidos de membrana). El factor X a y la protrombina se adsorben sobre la membrana utilizando iones Ca 2+ como puentes. El factor V a se une a la protrombina acelerando la reacción. El factor V a se produce por la acción de la trombina sobre el factor V en un claro ejemplo de una reacción que va acelerándose a medida que progresa (autoacelerada). Formación de fibrina El fibrinógeno (factor I) es una glicoproteína compuesta por seis cadenas polipeptídicas: dos A-alfa, dos B-beta y dos gamma; unidas entre sí por puentes disulfuro. Se trata de una molécula alargada y simétrica formada por tres dominios globulares conectados por segmentos similares. Cada mitad de la molécula se encuentra formada por tres cadenas (A-alfa, B-beta y gamma) que se enrollan en una triple hélice muy compacta en los sectores fibrilares. Los extremos amino de las seis cadenas se reúnen en el dominio globular central.

33 En un hecho que parecería muy curioso, los extremos N-terminales de las cadenas A- alfa y B-beta emergen como cabos libres del dominio globular central. Estas cadenas son muy ricas en aspartato y glutamato, además las cadenas B-beta poseen en esta región residuos tirosina-o-sulfato formados postraduccionalmente. Estos residuos con una alta tendencia a adquirir carga negativa contribuyen a formar una región central con una muy alta densidad de carga. Esta región electronegativa central es la responsable de la repulsión entre moléculas de fibrina que las mantiene en solución. La trombina ataca los enlaces arginina-glicina presentes en estos cabos libres, separando cuatro péptidos; dos segmentos A de 18 aminoácidos cada uno( provenientes de las cadenas A-alfa), y dos segmentos B de 20 aminoácidos(provenientes de las cadenas B-beta). A estos péptidos se los suele denominar fibrinopéptidos. El resto que queda de la molécula es un monómero de fibrina de composición alfa 2 beta 2 gamma 2. Al eliminarse los fibrinopéptidos desaparecen las fuerzas de repulsión intermoleculares con lo que los monómeros de fibrina tienden a agruparse espontáneamente formando asociaciones altamente ordenadas. Los monómeros se disponen uno a continuación del otro, cabeza con cabeza en forma de largas hebras. Estas hebras a su vez forman manojos, emparejándose con otras hebras de tal manera que la región central de los monómeros de fibrina de una se encuentra rodeada por las cabezas de los monómeros de fibrina de las otras. Este emparejamiento se hace posible gracias a interacciones de tipo electrostático y puente hidrógeno entre las regiones centrales de los monómeros de una y las cabezas globulares de otras. Entrecruzamiento de la fibrina Los haces paralelos de fibrina polimerizada forman una asociación laxa, que se encuentra en equilibrio con la forma monomérica de la molécula; por lo que sería imposible que cumplieran su papel de formar un coágulo estable sin reforzar esta estructura por medio de enlaces covalentes entre hebras vecinas. La formación de estos puentes covalentes intercatenarios es catalizada por la enzima transglutaminidasa (conocida también como factor XIII a ). La transglutaminidasa cataliza la formación de enlaces amida entre restos glutamina y lisina de hebras próximas entre sí. En la reacción se libera amoníaco en forma de ión amonio (NH 4 + ).