Laboratorio de Introducción a la Microbiología. Practico N 5

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1 Laboratorio de Introducción a la Microbiología Practico N 5 PRUEBAS BIOQUIMICAS y AISLAMIENTO Los microorganismos pueden ser separados e identificados de acuerdo a una gran variedad de razones, tales como: 1. Determinación de patógenos responsables de enfermedades infecciosas. 2. Selección y aislamiento de cepas de microorganismos fermentativos necesarios para la producción industrial de alcoholes, solventes, vitaminas, ácidos orgánicos, antibióticos e enzimas industriales. 3. Aislamiento y desarrollo de cepas microbianas que puedan ser utilizadas para la producción de alimentos y mejoramiento de su sabor como son el yogurt, quesos y productos lácteos. 4. Comparación de actividades bioquímicas con propósitos taxonómicos. En microbiología es fundamental establecer criterios taxonómicos que permitan la identificación de una gran diversidad de especies bacterianas, para ello es muy importante la realización de las llamadas pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas sirven para detectar propiedades fisiológicas y bioquímicas, debido a que éstas demuestran la existencia de ciertas enzimas en las vías metabólicas, que son reflejo de la expresión de un determinado gen en el DNA bacteriano. La suma total de todas las reacciones químicas es definida como metabolismo celular, y las transformaciones bioquímicas que ocurren dentro y afuera de la célula se encuentran gobernadas por catalizadores biológicos llamados enzimas. Las enzimas son proteínas muy específicas que realizan sólo una reacción química en el metabolismo de la bacteria. Las complejas reacciones químicas que debe efectuar un microorganismo son producto de la acción colectiva de grupos enzimáticos, que llevan a cabo la síntesis o degradación de cierto sustrato, por ejemplo, la oxidación de la glucosa hasta dióxido de carbono y agua es producto de enzimas encargadas de la glicólisis, el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Las enzimas son producidas en la célula, pero de acuerdo al lugar donde efectúan su acción se pueden clasificar en endoenzimas y exoenzimas. Las primeras son intracelulares y su función está relacionada con las reacciones de degradación y síntesis de sustratos en el interior de la célula, en tanto que las exoenzimas son excretadas a través de la pared celular con el fin de producir los cambios necesarios en los nutrientes del medio ambiente y así permitir el ingreso de éstos a la célula. 1

2 Según sus propiedades, las pruebas bioquímicas se pueden clasificar en: Enzimas extracelulares Enzimas intracelulares Hidrólisis del almidón Hidrólisis de los lípidos Hidrólisis de la caseína Hidrólisis de la gelatina Fermentación de los carbohidratos Producción de sulfuro de hidrógeno Reducción de los nitratos Reacción de la catalasa Test de la ureasa Test de la oxidasa Test de la coagulasa Hidrólisis de la sangre Pruebas IMVIC Agar tres azúcares Indol Rojo de Metilo Voges - Proskauer Utilización del Citrato A.- Enzimas asociadas a la respiración: Oxidasa y Catalasa Todas las bacterias aeróbicas obtienen su energía por la respiración, en donde el oxígeno molecular actúa como último aceptor de electrones, produciendo agua o peróxido de hidrógeno, según la especie bacteriana y su sistema enzimático. 1. Prueba de la Oxidasa: La prueba de la oxidasa está basada en la producción bacteriana de una enzima oxidasa (citocromo-oxidasa), la cual media el traspaso del electrón al oxígeno formando agua. Todos los organismos que poseen la enzima oxidasa son aerobios o anaerobios facultativos, ya que esta respuesta positiva está limitada a aquellos organismos capaces de desarrollarse en presencia de oxígeno. 2

3 Citocromo reducido Oxígeno Oxidasa Citocromo oxidado Agua Procedimiento: Para realizar esta prueba existen diversos reactivos en el mercado, pero lo común a todos ellos es que actúan como aceptores artificiales de electrones, los que al ser oxidados dan compuesto coloreado. La prueba se realiza utilizando papel filtro, el cual es impregnado con una solución al 1% del reactivo oxidasa (N,N-Dimetil-4-fenilendiamina Dihidrocloruro), luego sobre el papel se deposita un pequeño inóculo de un cultivo sólido, de 24 hrs, de la bacteria que se desea probar. Cuide de no utilizar para esta prueba asas que desprenden trozos de metal dado que pueden dar una reacción falsamente positiva. Utilice asas de vidrio preparadas especialmente para esta prueba. Resultados: Si el resultado es positivo se verá después de 30 segundos, un color fucsia o rosado intenso. Si la respuesta es negativa no se producirá la coloración. Se utilizan los microorganismos Escherichia coli negativo y Pseudomonas aeruginosa positivo para este reacción. 2. Prueba de la catalasa Esta prueba tiene por finalidad detectar la presencia de la enzima catalasa, cuya función es descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Este compuesto (H2O2) se forma como producto terminal oxidativo de la descomposición de azúcares y al ser muy tóxico provoca la muerte de la célula. 3

4 La catalasa se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromos. Por lo general los organismos que no poseen el sistema citocromo carecen de esta enzima y por lo tanto no pueden descomponer el peróxido de hidrógeno. La mayoría de las bacterias anaerobias no poseen la enzima catalasa, pero en su reemplazo poseen una enzima flavoproteínica NADH2 peroxidasa, que también cumple la función de descomponer el peróxido de hidrógeno, produciendo agua solamente. H2O2 + H2O2 Catalasa 2 H2O + O2 NADH2 + H2O2 Peroxidasa NAD+ + 2 H2O Procedimiento: Agregar 3 gotas de peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) sobre un cultivo sólido de 18 a 24 hrs. de incubación. Resultados: Si el microorganismo es catalasa positiva, inmediatamente se producirán burbujas por el oxígeno liberado. B.- Utilización de Fuentes de Carbono En esta pruebas se determinara la habilidad de un microorganismo de degradar y fermentar carbohidratos con la producción de un ácido o ácido y gas. Muchos microorganismos obtienen su energía a través de una serie de reacciones enzimáticas ordenadas e integradas conduciendo a la biooxidación de un sustrato, frecuentemente un carbohidrato. Las vías por lo que este proceso ocurre son: 4

5 Respiración celular: Aeróbica: biooxidación en que el oxígeno molecular puede servir como aceptor final de electrones. Anaerobica: biooxidación en que iones inorgánicos diferentes del oxígeno, como son NO 3 - o SO 4 pueden servir como aceptores finales de electrones. Fermentación: Un proceso biooxidativo que no requiere la presencia de oxígeno y en donde un sustrato orgánico sirve como aceptor final de electrones. Los microorganismos pueden utilizar los carbohidratos diferencialmente dependiendo de su complemento enzimático. Algunos microorganismos son capaces de fermentan azúcares como la glucosa anaeróbicamente y otros solo pueden utilizarla por la vía aeróbica. Los microorganismos denominados anaerobios facultativos son enzimáticamente competentes dado que utilizan ambos procesos, el anaeróbico y el aeróbico. También se encuentran microorganismos que carecen de la habilidad de oxidar la glucosa como por ejemplo pseudomona aeruginosa. La incapacidad de algunos microorganismos para utilizar los carbohidratos no puede ser considerada como una ausencia de crecimiento en el medio, dado que ellos utilizan otros nutrientes del mismo medio como fuente de energía para crecer. Entre estos nutrientes se encuentran las peptonas presentes en el medio. Las peptonas pueden ser degradadas por las enzimas microbianas a aminoácidos que son luego convertidos por desaminación oxidativa en ceto-aminoácidos. Estos son metabolizados a través del ciclo de Krebs para producir energía. Esta reacción libera iones amonio, los que se acumulan en el medio formando hidróxido de amonio (NH 4 OH) y producen un ambiente de tipo alcalino. 1.-Prueba de oxido/fermentación. Fundamento: Se llama también prueba de Hugh-Leifson. Con esta prueba se investiga si el microorganismo actúa sobre un azúcar por vía oxidativa o fermentativa. Se utiliza un medio de agar nutritivo semisólido más glucosa al 1% y un indicador de ph, púrpura de bromocresol. Se prepara el medio semisólido, se funde al mechero y luego se distribuye en tubos de ensayo a razón de 7 ml por tubo. Se esteriliza en autoclave por 15 minutos a 121ºC. El medio neutro tiene un color violeta. El medio ácido tiene color amarillo. El medio básico tiene un color azulado-púrpura. Procedimiento: Antes de sembrar el medio se debe regenerar, para lo cual el medio se calienta a baño maría hasta ebullición y luego se enfría rápidamente en agua fría con hielo, esto se realiza para extraer todo el oxígeno que pueda contener el medio. 5

6 Una vez realizada la regeneración del medio, se siembran los tubos por picadura, con un asa en punta. Se siembran dos tubos, uno de los cuales se cubre con 2 ml de parafina líquida estéril, con el propósito de crear un ambiente anaerobio. Se incuba a una temperatura de 37ºC durante 24 a 48 horas. Transcurrido este tiempo, se realiza la lectura. Resultado: TUBO ABIERTO TUBO CERRADO MECANISMO DE ACCION Amarillo Violeta Oxidativo Amarillo Amarillo Fermentativo Violeta Violeta No actúa Ejemplos: Escrerichia coli es un microorganismo fermentativo. Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo que no actúa fermentativamente ni oxidativamente sobre la glucosa, dado que no la utiliza como fuente de carbono. 2.- Agar tres azúcares hierro (TSI). Fundamento: Es un medio diferencial para la identificación de Enterobacterias según la fermentación de tres azúcares (lactosa, sacarosa y glucosa) y producción de ácido sulfhídrico además de gas. Su composición es la siguiente en gramos por litro: Peptona 20 Extracto de levadura 1 Lactosa 10 Sacarosa 10 Glucosa 1 NaCl 5 Sulfato férrico de amonio 0,3 6

7 Tiosulfato sódico 0,42 Rojo fenol 0,0025 Agar 15 La degradación del azúcar con formación de ácido se detecta por el viraje a amarillo del indicador, mientras que la alcalinización vira a rojo violeta. Si sólo se degrada la glucosa, la producción de ácido es débil y en la superficie se evapora el dióxido de carbono producido por la oxidación de la glucosa, y el microorganismo utiliza las peptonas, quedando el medio de color rojo violeta y en el fondo en cambio, el medio permanece de color amarillo, debido a que se ha seguido la fermentación de la glucosa, lo que produce ácidos fuertes no volátiles. Si se degrada además de la glucosa, la lactosa y la sacarosa, la producción de ácido es intensa, y todo el medio (fondo y superficie) quedan amarillos. La producción de gas se detecta por la formación de burbujas, y eventualmente un agrietamiento del agar. La producción de ácido sulfhídrico, ya sea a partir del tiosulfato, como de los aminoácidos azufrados de las peptonas, se detecta por la formación de precipitados negros de sulfuro de hiero cuando reacciona el ácido sulfhídrico producido con las sales de hierro del medio. Procedimiento: El medio se utiliza en tubos inclinados, con fondo abundante y una cuña corta, que se siembra en estría en la superficie y picadura en el fondo. Es recomendable utilizar tubos con tapones de algodón para permitir la re-oxidación del indicador. Si se utilizan tapones de rosca, estos deben aflojarse para permitir el intercambio gaseoso. Resultados: Color y aspecto Fondo Superficie A Color amarillo Fermentación de la glucosa y formación de ácido. G Aparición de burbujas Formación de gas a o grietas. partir de glucosa. K Rojo intenso No se fermenta la glucosa y se produce formación de álcali. R H 2 S No hay cambio del color original del medio. + ennegrecimiento - negativo No hay fermentación de la glucosa. Negro Fermentación de la lactosa y/o sacarosa con producción de ácido. No hay fermentación de la lactosa ni de la sacarosa y hay formación de álcali. No hay fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. 7

8 Ejemplos: Especie Sup. inclinada Fondo H 2 S Gas E. coli A A - + E. aerogenes A A - + K. peneumoniae K A - + Proteus sp. K A + + S. typhi K A + + P.aeruginosa K R Fermentación de la lactosa. Fundamento: Sirve para diferenciar organismos fermentadores de la lactosa y no fermentadores de la misma. Para esta prueba se utiliza el medio agar MacConkey, el cual es un medio diferencial que contiene sales biliares, rojo neutro, lactosa y cristal violeta. La acción diferencial de este medio se basa en la fermentación de la lactosa. Procedimiento: Se siembra por agotamiento por estría en placa. Resultados: Las colonias de microorganismos que fermentan este carbohidrato producen una caída localizada del ph, lo cual seguido por la absorción del rojo neutro, imparte un color rojo a la colonia. Las colonias de organismos que no fermentan la lactosa permanecen incoloras y traslúcidas. 8

9 Ejemplos: De rojas a rosadas...escherichia coli. Grandes, rosadas, mucoides... Klebsiella. Grandes, rosadas. No mucoides...enterobacter. Incoloras transparentes... Proteus. Incoloras, hasta café verdosas... Pseudomonas. Incoloras, transparentes o ambarinas... Salmonella. C.- Utilización de Aminoácidos 1.- Agar Hiero Lisina (LIA). Fundamento: Es un medio diferencial que permite identificar enterobacterias, siendo especialmente útil en la identificación de Salmonella y Proteus. Con esta prueba se desea determinar si el microorganismo posee la capacidad de descarboxilar o desaminar el aminoácido lisina. El medio contiene glucosa (dextrosa) que es rápidamente fermentada por el microorganismo, produciendo acidificación que se representa por el cambio de color de púrpura a amarillo del medio. En las siguientes horas de incubación, aquellos microorganismos que producen rápidamente la descarboxilación de la lisina, provocan una subida del PH de ácido a alcalino, virando el indicador de amarillo a púrpura nuevamente (púrpura de bromocresol). En cambio aquellos capaces de desaminar la lisina provocan un descenso del PH (ácido), tornando un color rojo al medio. Además se 9

10 puede detectar producción de ácido sulfhídrico que queda evidenciado por la formación de un precipitado negro en el fondo del tubo y de gas por la formación de burbujas o agrietamiento del agar. Procedimiento: Se debe realizar, primero, una siembra en picadura en la parte inferior del tubo e inmediatamente una siembra en estría en la cuñalos tubos se deben incubar por 24hrs a 35º-37ºC. Resultados: K = alcalinización (color morado violeta) A = acidificación (color amarillo) R = rojo (color rojo, desaminación de la lisina) + = sulfatorreductora - = no reductora del sulfato Ejemplos: Género y especie Cuña Fondo H 2 S Escherichia coli K K - Shigella K A - Salmonella spp. K K +/- Salmonella typhi K K +/- Citrobacter K A +/- Klebsiella K K - E. aerogenas K K - Serratia K K - Proteus vulgaris R A +/- Proteus miravilis R A +/- 2.- Medio movilidad, Indol y Ornitina (MIO). Fundamento: Es un medio diferencial que se utiliza para la identificación de enterobacterias en base a su movilidad, actividad de la enzima ornitina descarboxilasa y producción de indol. Como se trata de un agar semisólido, la movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o un crecimiento que difunde desde la línea de inoculación. La reacción de la ornitina se indica mediante un color púrpura en todo el medio, este color puede variar en intensidad y puede blanquearse a un color pálido debido a la reducción del indicador. La reacción se debe a que el organismo fermenta la dextrosa del medio, reduciendo su ph, esta condición ácida origina que el indicador púrpura de bromocresol se vuelva amarillo y proporcione las condiciones óptimas para la descarboxilación de la ornitina. Si ocurre esta reacción, el ph sube como resultado y el indicador se vuelve púrpura. Los cultivos negativos a la ornitina producen un tubo amarillo que puede ser púrpura en la parte superior. 10

11 Procedimiento: Los microorganismo a probar en este medio se siembran por picadura, y se deja incubar durante 24 horas a la temperatura adecuada. Ejemplos: Organismo Crecimiento Movilidad Indol D. ornitina E. aerogenes Bueno E. coli Bueno K. pneumoniae Bueno D.- Otras Pruebas 1.- Pruebas IMVIC. Son un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas que sirven para caracterizar bacterias de los diferentes géneros que existen en la naturaleza. Estas pruebas son utilizadas para identificar bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, las cuales son indicadores biológicos de contaminación en alimentos y agua principalmente. Estas cuatro pruebas son Indol, Rojo de Metilo, Voges - Proskauer y Citrato. a) Prueba del Indol. Fundamento: Esta prueba permite determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de la molécula de triptófano a través de la enzima triptofanasa. El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar 3 metabolitos principales: Indol, escatol e indolacético. En este proceso interviene un sistema completo de enzimas llamado triptofanasa. CH 2 CH COOH O I I + CH 2 CH 2 C COOH + NH 3 NH 2 N H Triptofanasa N H Triptófano Indol Ac. Pirúvico Amoníaco 11

12 Procedimiento: El medio de cultivo para realizar este prueba es agua peptonada (rica en triptofano), la peptona se agrega al 1%. Se distribuye en tubos de hemólisis a razón de 3 ml y de 8 ml en tubos de ensayo según se utilice y se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Se siembran los microorganismos problemas y se incuban a la temperatura adecuada durante 48 horas. La lectura se realiza con el reactivo de Kovacs, cuya composición es la siguiente: p-dimetilaminobenzaldehido 5 g Alcohol isoamílico 75 ml Hcl concentrado 25 ml Resultados: Si se produce Indol, se formará un complejo con el aldehído, de color rojo. El HCl es para favorecer la formación del complejo, que ocurre a ph ácido. El alcohol amílico es para concentrar el color en la superficie del tubo. Anillo rojo en la superficie del tubo... Indol + Si no se presenta coloración... Indol - Ejemplos: Escherichia coli es Indol + Enterobacter aerogenes es Indol -. 12

13 b) Prueba del rojo de Metilo. Fundamento: Conocer si el microorganismo tiene la capacidad de producir y mantener estables los productos ácidos de la fermentación ácido mixta de la glucosa (ác. Acético, fórmico, láctico y succínico), y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. El rojo metilo es el indicador de ph utilizado para determinar la concentración de iones hidrógeno después de la fermentación de la glucosa. Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP), cuya composición es la siguiente: Peptona 7 g Glucosa 5 g K 2 HPO 4 5 g Agua destilada 1000 ml Este medio es líquido y se prepara y distribuye a razón de 5 ml por tubo de ensayo y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. La lectura se realiza agregando solución de rojo de metilo, en solución alcohólica al 0,2% (p/v). Procedimiento: Se siembra con asa en loop. Una vez que se siembra y se deja incubar por 48 horas, se leen los resultados. Si el microorganismo ha producido ácidos a partir de la glucosa, se mantendrá rojo el indicador. Resultados: Medio ácido...indicador rojo...rm+ Medio neutro... indicador amarillo naranja.rm- Ejemplos: Escherichia coli es RM + E. arogenes es RM - 13

14 c) Prueba de Voges-Proskauer. Fundamento: La reacción de V.P. se basa en la detección de acetoína a partir de la fermentación butanodiólica de la glucosa. A partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir muchas vías según su sistema enzimático, una de éstas es la fermentación butanodiólica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es el precursor. La prueba V.P. se basa en la detección de éste último. La acetoína que se produce en la fermentación, cuando reacciona con el hidróxido de potasio (KOH al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos guanídicos de la arginina, que está presente en las peptonas que constituyen el medio, dando una coloración rojiza. Procedimiento: Para esta prueba se utiliza el mismo medio que para el rojo metilo. El microorganismo se siembra e incuba por 48 horas. La lectura se realiza agregando el cultivo crecido 6 a 8 gotas de una solución de KOH y 1ml de solución alcohólica de alfa-naftol al 5% p/v. Se debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en estufa el cultivo con los reactivos agregados. Resultados: Formación de un anillo rojizo V.P. (+) Formación de un anillo incoloro V.P. (-) Ejemplos: Escherichia coli es VP - E. aerogenes es VP + 14

15 Esquema de la reacción: Glucosa Ác. Pirúvico -acetolactato Acetoína + -naftol +KOH Diacetilo + guanidina Catalizador condensación rojiza 2,3-butanodiol d) Prueba del citrato. Procedimiento: Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono. Algunas bacterias pueden obtener energía empleando el citrato como única fuente de carbono. En las bacterias la utilización del citrato comprende un sistema enzimático que incluye, por una parte, la enzima citrato permeasa, que permite el paso del citrato a través de la membrana, y por otra, la enzima citrato liasa, que desdobla el citrato en acetato y oxalacetato. El acetato es excretado y el oxalacetato es descarboxilado para generar piruvato. Procedimiento: El medio a utilizar para esta prueba de el Koser Citrato (líquido) o el Citrato de Simmon (sólido). Estos medios contienen citrato como única fuente de carbono, sales de amonio inorgánicas como única fuente de nitrógeno, sales minerales y un indicador de ph, el azul de bromotimol. El medio, en un principio, es de color verde y cuando el microorganismo utiliza el citrato vira a color azul por alcalinización de él. Resultados: Color azul en el medio, prueba del citrato + Color verde en el medio, prueba del citrato - 15

16 Esquema de la reacción Citrato Acetato Citrato liasa Oxalacetato (descarboxilación) Piruvato E. Utilización de compuestos nitrogenados: 1.- Reducción de nitratos y nitritos. Fundamento: Se determina la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito o en nitrógeno libre. Muchos organismos pueden llevar a cabo una reducción no asimiladora del nitrato, que actúa como aceptor final de electrones. Este proceso es facultativo y se produce cuando hay disponibilidad de oxígeno muy baja o nula. Corresponde a una respiración anaerobia. La reducción del nitrato da lugar a nitrito como producto final, que a su vez puede ser reducido hasta la producción de derivados gaseosos (desnitrificación). La presencia de nitritos en el medio de cultivo, originados por la reducción de los nitratos, puede detectarse con reactivos adecuados. El caldo base se debe ajustar a un ph = 7.0. Extracto de carne 3 g Peptona 5 g KNO3 1 g Agua destilada 1 L 16

17 Procedimiento: Una vez preparado el medio se coloca en tubos que deben contener campanas Durham para detectar producción de gases. Luego se esteriliza el medio a 121ºC durante 15 minutos. Después de inocular los tubos, estos deben ser incubados a la temperatura adecuada durante tres a cinco días. Resultados: Se debe observar en primer lugar la presencia o no de gases. Se adicionan los reactivos de nitratos, un ml de solución A y un ml de solución B, a cada tubo. La aparición de un color rojo intenso indica la presencia de nitritos en el medio y por tanto la positividad de la reacción. Los casos que resulten negativos se les debe agregar granalla de zinc para determinar si los nitratos han sido reducidos, si aparece una coloración roja es debido a que en el medio existen nitratos; una ausencia de color rojo indicaría que no hay nitratos en el medio (estos han sido reducidos inicialmente a nitritos, y después a gas), siendo en este caso la prueba considerada como positiva. Reactivo A: Solución al 0,8% de ácido sulfanílico en ácido acético 5N. Reactivo B: Solución al 0,5% de alfa-naftilamina en ácido acético 5N. Ambas soluciones se disuelven por calentamiento suave. Esta prueba ayuda a la identificación de Enterobacterias que por lo general reducen los nitratos. 2.- Hidrolisis de la urea. Fundamento: Se determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoníaco por acción de la enzima ureasa. 17

18 La urea es una diamina del ácido carbónico (carbamida), la hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica la ureasa, para dar dos moléculas de amoníaco. En solución, la urea se hidroliza, dando carbonato de amonio como producto final. Esta enzima está vinculada con la descomposición de los compuestos orgánicos. La ureasa rompe por hidrólisis el enlace entre el N 2 y el C siendo el N 2 disociado a amoníaco. El medio utilizado es el agar base de Christensen (1946): Peptona de gelatina Cloruro de sodio Fosfato monopotásico Rojo de fenol Agua destilada Agar 1 g 5 g 0,012 g 1 l 20 g 2 g Procedimiento: Antes de agregar el agar, ajustar el ph del medio a 6,8-6,9 y luego esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Añada luego de enfriado el medio a 50ºC glucosa al 0,1% y solución de urea al 20% hasta una concentración del 2%. La glucosa y la urea deben ser esterilizadas por filtración. Luego se reparte el medio en tubos de hemólisis estériles, inclinándolos ligeramente hasta su solidificación. Inocule los tubos con los microorganismos problemas e incube a temperatura adecuada durante 24 a 48 horas. Resultado: Un viraje a un color rojo violeta indica la hidrólisis de la urea dando así la reacción como positiva. Si el tubo permanece de la coloración inicial una vez inoculado la bacteria la prueba es negativa. Se debe utilizar un tubo control sin urea, ya que pueden darse falsas reacciones debido a la peptona del medio base. El ph del medio positivo para la reacción pase de 6,8 a 8,4. La actividad enzimática de la ureasa es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar los organismos del género Proteus rápidamente ureasa positivos de otros microorganismos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Ejemplos: Klebsiella pneumoniae Reacción a la urea + Escherichia coli Reacción a la urea - Proteus spp. Reacción a la urea

19 F.- Detección de exoenzimas 1.- Hidrólisis de Almidón: Fundamento: El almidón es una macromolécula (unidades de glucosa) que necesita una hidrólisis previa para ser utilizado por los microorganismos. Con esta prueba se detecta la enzima amilasa que hidroliza el almidón en glucosa y restos de maltosa. Procedimiento: Se prepara agar nutritivo y se le agrega almidón al 1%. Una vez solidificado se siembra en grilla y se procede a incubar por 48 horas. Después de este tiempo se realiza la lectura de la prueba agregando lugol directamente a la placa. La reacción típica del almidón con el lugol es la formación de una coloración azul-parda. Resultados: Un halo incoloro alrededor del inóculo indica la hidrólisis del almidón, y por lo tanto, el microorganismo es amilasa positivo. Si existe una coloración azul-parda alrededor del cultivo significa que el almidón no ha sido hidrolizado por el microorganismo, debido a que no posee la enzima y por lo tanto es amilasa negativo. 2.- Hidrólisis de Gelatina: Fundamento: Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grande para entrar en la célula bacteriana, por lo que primero deben ser degradadas a polipéptidos y finalmente hasta aminoácidos, que entrarán en la célula. La gelatina, proteína de estructura sencilla, es un colágeno desnaturalizado que tiene poco valor nutritivo, pero se usa para detectar la actividad proteolítica. Con este test se determina la capacidad de un organismo para producir enzimas de tipo proteolítico, gelatinasas, que licúan la gelatina. 19

20 Procedimiento: Se prepara un medio de agar nutritivo y se agrega gelatina al 1%. Se funde y luego se esteriliza en autoclave y se distribuye en placas. Cada placa se siembra con asa en loop y se incuba por 48 horas. La lectura se realiza agregando a la placa el reactivo de Frazier que contiene Cloruro de Mercurio, HCl y agua destilada. Resultados: Una halo incoloro alrededor del inóculo indica la hidrólisis de la gelatina, y por lo tanto el microorganismo es gelatinasa (+). Si existe formación de un precipitado blanco alrededor del cultivo se considera negativo, ya que esto corresponde a la reacción de la gelatina con el reactivo de Frazier, lo que indica que el microorganismo no posee la enzima gelatinasa. AISLAMIENTO. Tiene por objetivo separar físicamente las bacterias para evitar la competencia y se usa para separar las bacterias en el laboratorio, es decir, in-vitro. Relativamente pocos métodos permiten el aislamiento de las bacterias en cultivos puros. Comúnmente se hace por separación individual en medio sólido, usando la siembra en placa; es recomendable el uso de medios selectivos para purificarlas, porque de este modo los contaminantes microbianos son inhibidos en su crecimiento. Con medios no selectivos se debe tener cuidado, ya que pueden existir contaminantes de crecimiento rápido que interfieran con el crecimiento de las colonias de interés. Métodos de aislamiento. a) Agotamiento por estría en una placa. 1. Parar el asa estriando 2. Esterilizar el asa y estrías 3 y 4. Estriar el asa sin esterilizar el asa 20

21 b) Por dilución y estrías en una sola placa. Se realizan diluciones seriadas y luego se siembra en una placa dividida en cuatro cada una de las diluciones realizadas En el caso de bacterias anaerobias, las placas inoculadas se introducen en una jarra de anaerobiosis. También se puede usar placas Brewer y un medio con tioglicolato de sodio, que es un agente reductor del oxígeno. En el aislamiento de hongos se debe usar un medio apropiado con sustancias antimicrobianas. También el medio a usar puede tener un ph bajo tendiendo a la acidez. Si se trata de aislar algas, se debe usar un medio apropiado, realizar diluciones y agregar antibióticos y antifúngicos al medio e incubar con una fuente de luz. 21

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