PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA (CURSO )

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1 PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA (CURSO )

2 Organigrama Distribución de las prácticas por días Análisis de una muestra de orina Análisis de una muestra de faringe Antibiograma Cuantitativo: siembra de Agar CLED Cualitativo: siembra de Agar Cromogénico y Agar de MacConkey Siembra de Agar Sangre Siembra de Agar Salino Manitol Martes Cuantitativo: lectura Cualitativo: Identificación presuntiva de colonias Tinción de Gram Prueba de la oxidasa Siembra en Agar de MacConkey Miércoles Observación de la aparición de halos de hemólisis Tinción de Gram a colonias aisladas en Agar Sangre y Agar Salino Manitol Identificación de cocos Gram positivos Siembra de Agar Sangre Jueves Siembra de Agar Kligler Inoculación de API20E Prueba de la catalasa Inoculación de API STAPH Inoculación de API STREP Siembra de Agar Müeller-Hinton Colocación de los discos E-test Viernes Lectura de Agar Kligler Lectura de API20E Lectura de API STAPH Lectura de API STREP Lectura y medida de halos en discos Lectura del E-test

3 Introducción NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA LABORATORIO DE NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2 Los agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos de riesgo en función de: Virulencia Dosis infectiva del microorganismo Disponibilidad de tratamiento Modo de transmisión en el laboratorio Riesgo de difusión en la comunidad Viabilidad del microorganismo en el entorno

4 Introducción GRUPO DE RIESGO PATOGENICIDAD No suelen causar enfermedad en personas sanas Causan infecciones moderadas o graves Las infecciones suelen tener buen pronóstico Generalmente no se transmiten por vía aérea Se suelen transmitir por contacto o ingestión Es difícil su propagación en la comunidad Existen tratamiento y profilaxis eficaces Causan infecciones graves Algunos se transmiten por vía aérea Pueden propagarse en la comunidad La terapia es de eficacia variable Causan infecciones graves o muy graves Muchos se propagan por vía aérea Se propagan fácilmente en la comunidad La terapia no es muy eficaz EJEMPLOS Escherichia coli Staphylococcus epidermidis Bordetella pertussis Clostridium tetani Haemophilus influenzae Candida Virus del sarampión Entamoeba histolytica Bacillus anthracis Mycobacterium tuberculosis Virus de la hepatitis B Leishmania donovani Virus de la viruela Virus de Marburg Virus Ébola

5 Introducción MICROORGANISMOS GRUPO DE RIESGO 1 GRUPO DE RIESGO 2 GRUPO DE RIESGO 3 GRUPO DE RIESGO 4 RIESGO PROVOCADO INDIVIDUAL BAJO COLECTIVO BAJO INDIVIDUAL MODERADO COLECTIVO MODERADO INDIVIDUAL ELEVADO COLECTIVO ELEVADO INDIVIDUAL ELEVADO COLECTIVO ELEVADO TIPO DE LABORATORIO BÁSICO (Enseñanza) SEGURIDAD (Hospital) ALTA SEGURIDAD (Diagnóstico especializado) MÁXIMA SEGURIDAD (Servicio estatal)

6 Introducción MEDIOS DE CONTENCIÓN Describen los métodos que hacen segura la manipulación de los agentes infecciosos en el laboratorio. Objetivo: reducir al mínimo la exposición del personal y del entorno a agentes potencialmente patógenos. Para la seguridad de los laboratorios de Microbiología Clínica son importantes tres elementos de contención: A) Barreras primarias: primera línea de protección (bata, guantes, gafas, mascarillas, gorros, cabinas de seguridad biológica, etc.). B) Barreras secundarias: normas que deben cumplirse para la construcción de un laboratorio de Microbiología Clínica (alicatado, paredes, grifos, interruptores, aparatos que generan ruido, aparatos que generan calor, etc.). C) Procedimientos estándar: metodología de funcionamiento del laboratorio y de la manipulación de las muestras clínicas.

7 Introducción NIVELES DE BIOSEGURIDAD MUESTRA CLÍNICA SOSPECHOSA DE CONTENER MICROORGANISMOS TIPO DE LABORATORIO RECOMENDADO PARA SU ESTUDIO NIVEL DE BIOSEGURIDAD QUE DEBE TENER EL LABORATORIO GRUPO DE RIESGO 1 BÁSICO 1 GRUPO DE RIESGO 2 SEGURIDAD 2 GRUPO DE RIESGO 3 ALTA SEGURIDAD 3 GRUPO DE RIESGO 4 MÁXIMA SEGURIDAD 4

8 Introducción GESTIÓN Y TRATAMIENTO DE LOS RESIDUOS Objetos punzantes y cortantes Agujas, pipetas Pasteur, portaobjetos, vidrio roto, etc. Constituyen un claro riesgo de inoculación accidental de microorganismos. Se depositan en recipientes específicos resistentes a la punción y con cierre hermético. Es muy importante cerrar correctamente estos recipientes, que deben ser esterilizados en autoclave o incinerados antes de desecharlos. Líquidos infecciosos Deben recogerse en recipientes herméticos y esterilizados, sangre incluida, en autoclave. Esta práctica es también obligatoria cuando los residuos proceden de áreas de micobacteriología y virología. Residuos sólidos Muestras clínicas, medios de cultivo, depresores, tubos de plástico, tiras API, etc. Deben ser esterilizados en autoclave o incinerados antes de ser desechados. Líquido sobrante de tinciones Debe ser recogido en garrafas de plástico (nunca tirar al fregadero).

9 Organigrama PRÁCTICAS A REALIZAR ANÁLISIS CUANTITATIVO ORINA ANÁLISIS CUALITATIVO ORINA ANÁLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARÍNGEA L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 Siembra de la muestra de orina (bote nº 2) Agar CLED Siembra de la muestra de orina (bote nº 1) Agar Cromogénico Agar de MacConkey Toma de muestra Mucosa faríngea Siembra Dos placas de Agar Sangre Siembra Una placa de Agar Salino Manitol

10 ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE ORINA ANÁLISIS CUANTITATIVO Conocer el número de microorganismos presentes en la muestra. Se toma una cantidad conocida de orina y se siembra en un medio de cultivo específico. Se incuba 24 horas y se cuenta el número de colonias. ANÁLISIS CUALITATIVO Conocer qué microorganismos están presentes en la muestra. Se siembran muestras de orina en diferentes medios de cultivo, tratando de obtener colonias aisladas. Tras su estudio, se elegirá una colonia correspondiente a una enterobacteria. La enterobacteria se identificará utilizando un sistema comercial: API 20E.

11 ANÁLISIS CUANTITATIVO FUNDAMENTO En función del número de microorganismos presentes por mililitro de orina se establecerán conclusiones acerca de posibles infecciones existentes en el tracto urinario. METODOLOGÍA Sembrar una placa de agar CLED (agar cistina, lactosa, deficiente en electrolitos). La placa se siembra con asa estéril de plástico calibradas (1 microlitro). El asa se introduce verticalmente en la muestra (Bote nº 2) correspondiente a la orina procedente del chorro medio. Se hace una única estría diametral. Seguidamente, se realizan estrías en zig-zag perpendiculares a la primera estría, tal como se esquematiza en la siguiente imagen.

12 El asa se introduce y se saca verticalmente del bote con orina El asa toca el centro de la placa a partir del cual el inóculo se extiende en forma de una línea a lo largo del diámetro de la placa Sin agregar más orina, con la misma asa se hacen estrías sobre la placa cruzando varias veces la línea del inóculo inicial

13 AGAR CLED (CISTINA, LACTOSA, DEFICIENTE EN ELECTROLITOS) Digerido pancreático de gelatina Digerido pancreático de caseína Extracto de carne Lactosa L-cistina Azul de Bromotimol Agar en polvo Agua destilada 4 g/l 4 g/l 3 g/l 10 g/l 0,128 g/l 0,02 g/l 15 g/l 1 L ph: 7,3 Es un medio diferencial que favorece el crecimiento de todos los microorganismos existentes en la orina. Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento. La lactosa es el único carbohidrato presente. La cistina facilita el crecimiento de los coliformes dependientes de ella. El azul de bromotimol permite distinguir las colonias de bacterias fermentadoras de las que no lo son. Los microorganismos fermentadores dan lugar a colonias de color amarilllo. Los no fermentadores dan lugar a colonias de color claro o traslúcidas. La alcalinización del medio provoca la aparición de un color azul intenso.

14 ANÁLISIS CUALITATIVO FUNDAMENTO Sembrar una muestra de orina (Bote nº 1) en medios diferenciales. El tipo de colonia y su pigmentación servirán para presuponer qué microorganismos pueden estar presentes. METODOLOGÍA Sembrar una placa de agar Cromogénico. Sembrar una placa de agar de MacConkey. Se utilizarán también las placas de agar CLED empleadas en el análisis cuantitativo. Dada la posible escasez de microorganismos presentes en orina, debe utilizarse un método de siembra que pueda descargar un inóculo denso. Con un asa de 10 µl se realizarán tres descargas (30 µl en total) en estrías paralelas en el sector 1. Los sectores 2 al 7 se sembrarán arrastrando inóculo del sector anterior tal como se esquematiza en la siguiente imagen.

15 Técnica de siembra en placa por estrías cada 45º

16 AGAR CROMOGÉNICO El agar Cromogénico es un medio diferencial, pero no selectivo. El carácter diferencial se traduce en que las colonias crecidas presentan diferentes colores en función de su capacidad para utilizar ciertos sustratos presentes en el medio. La presencia en las bacterias de enzimas específicas (por ejemplo, β galactosidasa, β-glucosidasa o triptófano desaminasa) capaces de descomponer esos sustratos, provoca la aparición de un color determinado (rosa, azul turquesa, azul oscuro, verde, blanco, crema, etc.) unicamente en la colonia a la que pertenece dicha bacteria.

17 Técnica de siembra en placa por estrías continuas Alumno A Alumno B Dirección de la siembra Dirección de la siembra

18 AGAR DE MACCONKEY Peptona Lactosa Sales biliares Cloruro sódico Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada ph: 7,1 20 g/l 10 g/l 1,5 g/l 5 g/l 0,030 g/l 0,001 g/l 15 g/l 1L No fermentador Fermentador de lactosa Fermentador fuerte de lactosa El agar de MacConkey es un medio moderadamente selectivo y diferencial utilizado para la recuperación de enterobacterias y bacilos Gram negativos entéricos relacionados. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas Gram negativas exigentes. La lactosa es el único carbohidrato. Las bacterias fermentadoras de lactosa formas colonias de diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo a ph menor de 6,8) por la producción de ácidos mixtos. Las bacterias que no fermentan la lactosa forman colonias incoloras o transparentes.

19 FUNDAMENTO ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE FARINGE En el tracto respiratorio existe una abundante microbiota que se establece, normalmente, sin causar daños al hospedador. El objetivo de la práctica consiste en tomar una muestra del tracto respiratorio superior (faringe) para tratar de identificar cocos Gram positivos. METODOLOGÍA Tomar una muestra de faringe con un hisopo estéril y la ayuda de un depresor también estéril. Sembrar la muestra en dos placas (nº1 y nº2) de agar sangre y en una de agar salino manitol: Placa nº 1 de Agar Sangre: se descarga el hisopo en una zona próxima al borde (zona densa) y se siembra el resto de la placa por estrías continuas. Incubar 48 horas a 37ºC. Placa nº 2 de Agar Sangre: con un asa estéril se toma un inóculo de la zona densa de la placa nº 1 y se siembra la placa por estrías continuas. Incubar 48 horas a 37ºC. Placa de Agar Salino Manitol: sembrar por estrías continuas con el mismo hisopo que se ha sembrado la placa nº 1. Incubar 48 horas a 37º C.

20

21 Siembra por estrías continuas Placa nº 1 con hisopo Placa nº 2 con asa

22 AGAR SANGRE Es una combinación de agar base, generalmente agar nutritivo, y sangre. Se puede utilizar sangre de oveja, de otros animales e incluso humana. Es un medio rico que aporta muchos factores de crecimiento para microorganismos exigentes. Se utiliza también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos, por lo que se considera un medio diferencial. Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que poseen: alfa, beta o gamma.

23 AGAR SANGRE (AGAR BASE DE COLUMBIA + 5% SANGRE OVEJA) Agar base de Columbia Peptona Tripteína Extracto de levadura Extracto de corazón (buey) Almidón soluble Cloruro sódico Agar Agua destilada 5 g/l 12 g/l 3 g/l 3 g/l 1 g/l 5 g/l 15 g/l 1 L ph: 7,3 El agar base de Columbia es uno de los muchos medios de cultivo a los que se les puede adicionar sangre para preparar agar sangre o agar chocolate. La sangre más comúnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estéril y desfibrinada. Una vez preparado el medio de cultivo, se enfría hasta 45ºC y se le añade la sangre.

24 AGAR SALINO MANITOL (MEDIO DE CHAPMAN) Extracto de levadura Triptona Gelatina Lactosa Manitol Cloruro sódico Fosfato dipotásico Rojo fenol Agar Agua destilada 2,5 g/l 10 g/l 30 g/l 2 g/l 10 g/l 75 g/l 5 g/l 0,025 g/l 15 g/l 1 L ph: 7,0 Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. La mayoría de los microorganismos no crecen a una concentración de cloruro sódico del 7,5%, mientras que los estafilococos patógenos sí lo hacen. La presencia de manitol permite detectar a los estafilococos fermentadores del mismo que producen colonias amarillas debido al viraje de color del rojo fenol. Los estafilococos no patógenos no lo fermentan y producen colonias de color rosa.

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