Manual de Procedimientos

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1 Manual de Procedimientos Diagnóstico y caracterización de Salmonella spp. 2008

2 AUTORES María Inés Caffer Raqurel Terragno Norma Binsztein Departamento Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrán Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur 2

3 INDICE CAPÍTULO I- INTRODUCCIÓN 5 CAPÍTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SAMONELLA spp EPECÍMENES 9 2.-PROCESAMIENTO AISLAMIENTO 10 Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica de Salmonella spp a partir de heces IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE SALMONELLA spp Pruebas Bioquímicas 22 Agar Hierro Tres Azúcares y Agar Kligler 22 Prueba de la β-galactosidasa 23 Agar Lisina Hierro 25 Agar SIM 26 Test de Utilización de Azúcares 27 Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa 29 Prueba del Malonato 32 Ensayo del Rojo de Metilo 33 Ensayo de Voges-Proskauer 35 Prueba de la Urea 36 Prueba del Indol Problemas de Diagnóstico Diferencial SEROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA spp. 42 Antígenos Somáticos 43 Antígenos Flagelares 44 Antígeno Capsular 45 Descripción del Esquema de Kauffmann-White SEROTIPIFICACION SOMÁTICA O SEROTIPIFICACION FLAGELAR H 51 Flujograma para Serotipificación de Salmonella spp. 56 3

4 CAPÍTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD NIVEL DE LABORATORIOS ELEMENTOS DE PROTECCIÓN INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO CENTROS PARA REQUERIR AYUDA TRANSPORTE DE MUESTRAS 62 CAPÍTULO IV- MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES 64 Caldo Selenito 64 Caldo Tetrationato 64 Caldo Flagelar 65 Solución Salina 65 Agar Movilidad (Swarm Agar) 65 Agar Nutritivo 65 Agar Mueller-Hinton 66 Agar EMB 66 Agar McConkey 66 Agar SS 67 Agar Hektoen 68 Agar Verde Brillante 69 Agar XLD 69 CAPÍTULO V- PLANILLAS DE RESULTADOS 71 4

5 CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN El género Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros del género Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm, generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos, no esporulados. El género Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a través de los años, en lo que respecta a su nomenclatura y taxonomía. Sin embargo, todavía siguen vigentes las ideas desarrolladas por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la década del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del género Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Estudios del DNA mediante técnicas de hibridación mostraron que el género Salmonella está constituído por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori. Salmonella enterica está compuesta por 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica, Salmonella enterica subespecie salamae, Salmonella enterica subespecie arizonae, Salmonella enterica subespcie diarizonae, Salmonella enterica subespespecie houtenae y Salmonella enterica subespecie indica. A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen en más de 2400 serovariedades, que están definidas en función de diferentes asociaciones de factores antigénicos somáticos O y flagelares H. La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un nombre por lo general relacionado con el lugar geográfico donde se la aisló por primera vez. Como las serovariedades no tienen nivel taxonómico de especie, sus nombres no siguen las reglas del International Code of Nomenclature of Bacteria, de manera que sus nombres se deben escribir en letras romanas (no itálicas) y con mayúscula; por ejemplo el nombre completo de Salmonella Typhimurium es Salmonella enterica subesp. enterica serovariedad Typhimurium. Como este nombre es muy largo, a los fines prácticos se usa directamente Salmonella Typhimurium 5

6 Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja incidencia en patología humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie, seguido de la fórmula antigénica, por ej: Salmonella subesp. IV 50: b : - (Salmonella enterica subesp. houtenae 50:b : -) Los nombres de todas las serovariedades están contenidos en el Esquema de Kauffmann- White, publicado por el Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigación de Salmonella, del Instituto Pasteur de París (1). Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se los encuentra como comensales y como patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades en el hombre y los animales. Los miembros del género se pueden clasificar en tres grupos: a) Los que no tienen preferencia por algún huésped en especial, por lo que infectan tanto al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayoría de las serovariedades responsables de las salmonelosis. b) Los que infectan sólo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi C c) Los que están adaptados a un huésped animal: S. Abortusovis, a los ovinos; S. Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. La tasa de incidencia de la infección es mayor en los lactantes y en niños de corta edad. Epidemiologicamente, las infecciones por Salmonella pueden causar pequeños brotes en la población en general, sin embargo el 60-80% de los casos son esporádicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines maternales, geriátricos, restaurantes. Es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario, la fuente más frecuente de infección son los alimentos contaminados, incluido agua. También puede ocurrir la transmisión de persona a persona. A pesar de todos los controles que se han puesto en práctica, las infecciones por Salmonella debidas al consumo de alimentos contaminados continúa siendo un problema serio con millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes pérdidas 6

7 económicas. En el 2003, se estimó que solamente en los Estados Unidos, el costo de las salmonelosis producidas por alimentos contaminados llegaba a la cifra de dólares. La vigilancia de Salmonella spp. en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los alimentos constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias eficientes de control de la misma. En programas de monitoreo y control es esencial contar con métodos de laboratorio eficientes para el aislamiento, identificación y tipificación de Salmonella spp. Se debe destacar que hay muchos procedimientos distintos para el aislamiento de Salmonella. El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rápido y económico. Ningún método cumple con todos criterios y ninguno es óptimo para todas las condiciones. Por lo tanto es aconsejable consultar la literatura antes de elegir un método para un determinado propósito y es recomendable la comparación frecuente de los métodos de cada laboratorio con los nuevos métodos que surjan. Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella spp. están ampliamente descritos, sin embargo estas pruebas dependen de la expresión fenotípica de las características analizadas y pueden verse afectadas por variaciones en los medios de cultivo y en las condiciones de incubación. Como una alternativa se están introduciendo cada vez más los métodos moleculares; que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más simples de realizar, pero tienen la desventaja que son caros. El sistema de serotipificación de Salmonella spp. es probablemente el mejor sistema de tipificación fenotípica bacteriano. Tiene un alto poder discriminatorio y provee información con significado epidemiológico, desde el punto de vista de la vigilancia basada en laboratorio. La disponibilidad y el costo de antisueros de alta calidad es un problema en algunos países y regiones. La subtipificación molecular da información adicional, de mayor discriminación sin embargo no es un sustituto de la serotipificación. Los microorganismos del género Salmonellae son bacilos Gram negativos (0.7 a 1.5 x 5 µm), no fermentadores de lactosa. Son móviles por medio de flagelos peritricos, con la excepción de Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum. Fermentan glucosa con producción de 7

8 ácido y gas (excepto S. Typhi). También fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, D- manosa, L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita. Son oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges-Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons positivo, urea negativo y producen SH 2. Los procedimientos siguientes servirán como guía para realizar los pasos necesarios para aislar adecuadamente Salmonella spp. de heces, efectuar la identificación bioquímica de Salmonella spp. y serotipificar los aislamientos utilizando antisueros somáticos y flagelares adecuados. Recolección y transporte de muestras Aislamiento de Salmonella spp. de heces. Identificación bioquímica de Salmonella spp. Serotipificación de Salmonella spp. Bioseguridad Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones establecidas en Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 th. CDC/NIH (Ver Capítulo III - Precauciones de Bioseguridad) 8

9 CAPÍTULO II AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SALMONELLA spp ESPECÍMENES Para el diagnóstico de Salmonella spp. se pueden usar muestras de materia fecal y fluidos (sangre, orina, bilis y pus de abscesos). a) Materia fecal: La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estéril, se recoge una pequeña cantidad de una evacuación espontánea reciente, seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Las muestras que no se pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte. Como medio de transporte se usa Cary Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 días, siempre en refrigeración. b) Sangre: La muestra se toma en el momento del pico de fiebre. Se siembran 10 ml de sangre en un frasco de hemocultivo de 100 ml (relación 1:10). Se incuba a 35-37ºC, durante 7 días, haciendo un control (en medio de agar sangre) a ciegas a las 8 horas de incubación y controles periódicos de acuerdo a la turbidez observada. El hemocultivo reviste un interés especial en el caso de fiebre tifoidea y paratifoidea; pero no es constantemente positivo. Los porcentajes de positividad, en ausencia de tratamiento antibiótico, son: 90% durante la primera semana de evolución, 75% en la segunda, 40% en la tercera y 10% en la cuarta. Los hemocultivos son negativos en los sindromes de infecciones transmitidas por alimentos por serovariedades como S. Typhimurium ó S. Enteritidis, sin embargo estas serovariedades causan septicemia en los inmunocomprometidos. c) Material de abscesos y orina: El pus y la orina se recogen en recipientes estériles y una alícuota se siembra directamente en los medios de cultivo. 9

10 2.- PROCESAMIENTO AISLAMIENTO Materiales y equipamiento Ansas descartables (10 µl) Placas de Petri descartables (9 cm diámetro) estériles Balanza Estufas a 37 o C Mechero bunsen Hisopos de algodón Medios Caldo nutritivo Caldo selenito Agar hierro tres azúcares (TSI) Agar lisina hierro (LIA) Estrías de agar tripticas de soja (TSA) Placas de agar Salmonella Shigella (SS) Placas de agar MacConkey (MC) Procedimiento Día 1 Cultivo primario en placas de agar (Camino I) y enriquecimiento selectivo (Camino II) (Figura 1) Resuspender el hisopo en 1 ml de caldo nutritivo de manera de tener una suspensión homogénea de la materia fecal. Sembrar con ansa una muestra de la suspensión de materia fecal, en placas de agar MC y SS (o XLD) (Camino I- Cultivo directo) Comentarios Para estas muestras se recomiendan dos caminos simultáneos: Cultivo directo en medios sólidos, aislamiento e identificación de las colonias Subcultivar el hisopo en un tubo de Enriquecimiento en caldo selectivo, 10

11 caldo selenito, (Camino II - Enrequicimiento para la detección de Salmonella spp) se usa para favorecer el aislamiento de los microorganismos cuando se encuentran en muy bajo número en la muestra. La elección del método depende del número de microorganismos presentes en la materia fecal, que está en relación con el proceso diarreico o el estado de portador. Si en el camino de aislamiento directo (Camino I) se identifica y confirma Salmonella spp., no es necesario continuar la vía del enriquecimiento (Camino II) Incubar las placas del Camino I y el tubo (con el hisopo incluido) del Camino II, a 37ºC, horas Día 2 Subcultivo de las colonias sospechosas de ser Salmonella Observar la morfología y características fenotípicas de las colonias aisladas en las placas de agar MC y de agar SS (Camino I). Anotar los resultados en la Planilla 1 Registro de Resultados: Aislamiento de Salmonella spp. Morfología en placas de agar selectivo (Camino I) En la placa de agar MC las colonias típicas son lactosa negativas e incoloras, y en las de agar SS: las colonias típicas son incoloras, translúcidas con un centro negro debido a la producción de SH 2. (Ver Tabla 1: Características de las colonias en medios selectivos y diferenciales ) Subcultivar 2 colonias sospechosas de ser Salmonella de las placas de agar MC y SS en estrías de agar TSA, agar TSI y agar LIA (Camino I). El subcultivo de colonias sospechosas de Salmonella en estrías de agar TSA al mismo tiempo que la inoculación en TSI y LIA permite ganar un día en la 11

12 identificación y serotipificación Sembrar con ansa una muestra del caldo selenito en placas de agar MC y SS. Incubar todos los medios a 37ºC, horas. (Camino II) Si se obtienen resultados por el Camino I, no continuar adelante por el Camino II. Día 3 Confirmación bioquímica y serotipificación de Salmonella (Camino I) y subcultivo de colonias sospechosas de Salmonella provenientes del camino de enriquecimiento (Camino II) Leer las reacciones bioquímicas TSI y LIA, si son compatibles con Salmonella spp., realizar las pruebas bioquímicas complementarias y la serotipificación somática (Camino I). [Ver Procedimiento Identificación y caracterización de Salmonella spp (2.2) y Serotipificación de Salmonella spp. (2.3) ] Subcultivar 2 colonias sospechosas de Salmonella de las placas de agar MC y SS provenientes del enriquecimiento en caldo selenito (Camino II), en estrías de agar TSA, agar TSI y agar LIA. Si se obtienen resultados por el Camino I, no continuar adelante por el Camino II Día 4 Leer los resultados de las pruebas bioquímicas complementarias y realizar la serotipificación flagelar de Salmonella spp. 12

13 (Camino I) y/ o los resultados de la confirmación bioquímica preliminar y realizar la serotipificación somática de Salmonella spp. (Camino II). TABLA 1. Características de las colonias en medios selectivos y diferenciales Medio de cultivo Selectividad Aspecto de las colonias Agar MC Baja Incoloras Agar EMB Baja Incoloras Agar SS Alta Incoloras con centro negro Agar XLD Alta Rojas con centro negro Agar HK Alta Verdes-azuladas con centro negro Agar BGA Alta Rosadas pálidas Ver Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica (Figura 1) 13

14 FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE SALMONELLA spp. A PARTIR HECES Camino II 1er. día MATERIA FECAL (HISOPO) Camino I Suspensión en solución fisiológica Caldo de enriquecimiento (1) Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2) hs, 37ºC Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2) Colonias típicas (3) 2do. día TSI LIA Estría 3er. día hs, 37ºC Colonias típicas (3) Lectura (4) Serotip. O (6) TSI LIA Estría P. bioq. (5) Caldo Flagelar hs, 37ºC Lectura (4) Serotip. O (6) Lectura Serotip. H 4to. día P. bioq. (5) (1) Caldo selenito (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar verde brillante. (3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioquímicas complementarias (P.bioq.) y se realiza la serotipificación O (Serotip. O) (5) Pruebas bioquímicas complementarias: RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato. (6) Serotip: Serotipificación. Si la serotipificación somática O de las colonias obtenidas por ambos procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificación flagelar H debe hacerse en una sola de ellas. 14

15 2.2.- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE SALMONELLA spp. Las probables colonias de Salmonella spp. en los medios de aislamiento utilizados se confirman mediante pruebas bioquímicas recomendadas por Le Minor y Richard: desarrollo en agar hierro-tres- azúcares (TSI), utilización de urea de Christensen, determinación de lisina y ornitina decarboxilasa y de arginina dehidrolasa, prueba de la beta-galactosidasa (ONPG), prueba del rojo de metilo, reacción de Voges-Proskauer, prueba de fermentación de la dulcita y utilización del malonato. La mayoría de las serovariedades (99,8%) de Salmonella aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a Salmonella enterica subesp. enterica (I) y tienen propiedades bioquímicas características (Tabla 2), siendo excepciones las serovariedades S. Typhi y S. Paratyphi A. TABLA 2. Pruebas bioquímicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I) Pruebas bioquímicas Salmonella enterica subep. enterica (I) Lactosa *** - ONPG - Producción de SH 2 + Glucosa (fermentación) *** +/con gas Dulcita (fermentación) *** + Adonita (fermentación) *** - Lisina decarboxilasa ** + Ornitina decarboxilasa** + Arginina dihidrolasa ** + Urea (hidrólisis)** - Indol - Rojo de Metilo * + Voges Proskauer * - Citrato de Simmons ** + Malonato (utilización)* - *Lectura a los 2 días; ** Lectura hasta los 4 días; *** Lectura hasta los 7 días; **** Lectura hasta los 30 días 15

16 Las características bioquímicas que permiten diferenciar las distintas subespecies dentro de la especie S. enterica y la diferenciación con la especie S. bongori se indican en la Tabla 3. TABLA 3. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp. Pruebas bioquímicas S. enterica subesp. Enterica (I) S. enterica subesp. salamae (II) S. enterica subesp. arizonae (IIIa) S. enterica subesp. diarizonae (IIIb) S. enterica subesp. houtenae (IV) S. enterica subesp. indica (VI) S. bongori (V) Dulcita d + ONPG d + Malonato Gelatina Sorbita KCN L(+) tartrato Mucato (70%) Salicina Lactosa (75%) + (75%) - d - Habitat de las cepas Animales de sangre caliente Animales de sangre fría y medio ambiente + 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones Es importante tener en cuenta la posibilidad de aislar más de una serovariedad de Salmonella de un alimento ó de un material patológico. Si bien esto no ocurre con frecuencia, hay que tenerlo presente cuando se trabaja con muestras de materia fecal o de ganglios mesentéricos y sobre todo en el caso de ciertos alimentos para consumo humano o animal, como huevos a granel, embutidos, harinas de carnes o huesos. Es por ello que se recomienda estudiar varias colonias simultáneamente. Materiales y equipamiento Ansas descartables (1 µl) Ansa aguja Mechero Bunsen Estufa a 37 o C 16

17 Medios Medio para la prueba de urea Medio para la prueba de fenilalanina Medio Citrato de Simmons Medio para la prueba de la lisina decarboxilasa (LDC) Medio para la prueba de la ornitina decarboxilasa (ODC) Medio para la prueba de la arginina dihidrolasa (ADH) Medio control para las pruebas con aminoácidos. Vaselina estéril Medio base para azúcares Solución madre de dulcita al 5% Solución madre de salicina al 10% Solución madre de sorbita al 10% Solución madre de lactosa al 10% Solución madre de adonita al 10% Solución madre de glicerol al 10% Slución madre de manita al 10% Solución madre de glucosa al 10% Solución madre de dulcita al 10% Solución madre de ramnosa al 10% Solución madre de silosa al 10% Caldo Malonato Discos de o-nitrofenil-β-d-galactopiranósido (ONPG) o reactivo para la prueba de la β-galactosidasa Agar SIM Reactivo de Erlich para la prueba de indol Medio RM/VP para la prueba de Voges-Proskauer Solución de KOH 40% para la prueba de Voges-Proskauer Solución alcohólica de alfa-naftol para la prueba de Voges Proskauer 17

18 Cepas bacterianas Cepas de referencia para el control de calidad de los medios. Procedimiento Día 3 Siembra de las pruebas bioquímicas complementarias Inocular a partir de un cultivo en estrías de agar TSA, los medios para las siguientes pruebas: Medio para la prueba urea. Medio para la prueba de LDC, ADH y ODC y el medio control. Cubrir con una capa de vaselina estéril. Medio para ONPG. Medio RM/VP. Agar SIM. Dulcita Caldo Malonato Comentarios Incubar todas las pruebas bioquímicas a 37ºC por horas. Test de la β-galactosidasa: Resuspender un ansa del cultivo proveniente del TSI en un tubo que contiene 0.5 ml de medio de ONPG e incubar a 37 C. Se debe ver una reacción positiva dentro de los 20 minutos pero usualmente la prueba se lee a las 3-4 horas o más. También se pueden usar discos de ONPG siguiendo las indicaciones del fabricante La β-galactosidasa es una enzima inducible, y como la lactosa, presente en el TSI, es uno de los inductores del operón lactosa, la prueba se realiza a partir del desarrollo en este medio. 18

19 Día 4 Lectura de las pruebas bioquímicas complementarias Prueba de urea. Prueba de LDC, ADH y ODC. Prueba de ONPG. Prueba de RM/VP. Prueba de SIM. Fermentación de Dulcita Utilización de Malonato Si se presentan resultados no concordantes con los esperados para la identificación bioquímica de Salmonella spp. se deben realizar pruebas diferenciales. Ver Problemas de Diagnóstico Diferencial, donde se presentan pruebas bioquímicas comparativas con otros géneros de la familia Enterobacteriaceae Agregar los reactivos correspondientes a las siguientes pruebas: RM: agregar a 0,5 ml del caldo RM/VP 1 gota de rojo de metilo VP: agregar a 1 ml del caldo RM/VP, 0,6 ml de la solución alcohólica de α- naftol y 0,2 ml de la solución de KOH. Indol: agregar 1 ml del reactivo de Erlich al medio SIM. Agitar muy bien luego de la adición de cada reactivo. Leer los resultados de acuerdo a las Tablas 4, 5 y ver Pruebas Bioquímicas Propiedades e Interpretación de los Resultados. Anotar los resultados en las planillas de registro. 19

20 TABLA 4. Pruebas bioquímicas: interpretación de los resultados TSI TSI Medio Reacciones/enzimas Producción de ácido (si el fondo es amarillo y la estría es roja, (la producción de ácido es sólo a partir de glucosa). Producción de ácido a partir de lactosa y/o sacarosa. Negativo Fondo rojo Estría roja Resultados Positivo Fondo amarillo Estría amarilla TSI Producción de gas No hay burbujas en el fondo Burbujas de aire en el fondo TSI Producción de H 2 S No hay color negro Color negro LIA La decarboxilación de la lisina produce una reacción alcalina (color violeta) a través del medio. Los organismos que no decarboxilan la lisina producen una estría alcalina y un fondo ácido (color amarillo). Botón purpura/superficie amarilla Botón púrpura/superficie púrpura LIA Producción de H 2 S No hay color negro Color negro Urea Ureasa Amarillo Rosa/Cereza LDC Lisina decarboxilasa Color amarillo/marrón Color púrpura y color amarillo/marrón en el medio control. ODC test Ornitina decarboxilasa Color amarillo/marrón Color púrpura y color amarillo/marrón en el medio control ADH test Arginina dihidrolasa Color amarillo/marrón Color púrpura y amarillo/marrón en el medio control ONPG β-galactosidasa Permanece incoloro Amarillo Voges Producción de acetoína Permanece incoloro Color rojo/rosado Proskauer Indol Producción de Indol anillo amarillo anillo rojo/rosado SIM agar Producción de H 2 S No color negro Color negro SIM agar Producción de indol Anillo amarillo anillo rojo/rosado SIM agar Movilidad Desarrollo solo a lo largo de la línea de punción Muestra un crecimiento difuso que se disemina a partir del punto de inoculación 20

21 TABLA 5. Resultados de las pruebas bioquímicas para Salmonella spp. Prueba 1) TSI glucosa (ácido) TSI glucosa (gas) TSI lactosa TSI sacarosa TSI sulfuro de hidrógeno LIA agar SIM agar (H 2 S) SIM agar (indol) SIM agar (movilidad) Utilización de urea Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dihidrolasa Reacción de β-galactosidasa Reacción de Voges-Proskauer Reacción de indol Utilización del Malonato Fermentación de Dulcita Reacción positiva o negativa % de aislamientos de Salmonella que muestran la reacción 2) ) ) ) ) ) Ewing W. H. and Ball M. M., The biochemical reactions of members of the genus Salmonella. National Communicable Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966). 2) Estos porcentajes indican solo que no todas las cepas de Salmonella muestran las reacciones marcadas + o -. 3) Salmonella Typhi es anaerogénica. 4) Salmonella (subgénero) subespecie III (Arizona) da reacciones + o para lactosa pero es siempre β- galactosidasa positiva. Salmonella (subgénero) subespecie II da una reacción negativa para lactosa y una reacción negativa para β-galactosidasa, (Antigenic Formulas of the Salmonella serovars, 2001). Para el estudio de las cepas, puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarias. 5) S. Paratyphi A es negativa. 21

22 PRUEBAS BIOQUÍMICAS Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler I. Principio El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH 2 ). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y 10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de ph es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formación de SH 2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el ph del medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de SH 2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volumenes de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar. II. Resultados A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa (E. coli). B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.). C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH 2 (Salmonella spp). 22

23 E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.). III. Control de Calidad Bacteria Punción Estria Sh2 Salmonella Typhi Ac Alc + (*) Salmonella Paratyphi A Ac/g Alc - Salmonella spp. Ac Alc + Shigella spp. Ac Alc - Enterobacter aerogenes Ac/g Ac - Enterobacter cloacae Ac/g Ac - Escherichia coli Ac/g Ac - Citrobacter Ac/g Ac + Klebsiella Ac/g Ac - Proteus vulgaris Ac/g o Ac Ac +(sucio) Proteus mirabilis Ac/g o Ac Alc + (sucio) Klebsiella pneumoniae Ac/g o Ac Alc - (*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo. Para el control de calidad selecionar entre aquellos microorganismos disponibles. Prueba de la β-galactosidasa I. Principio La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras la permeasa facilita la penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas, sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no permeasa. El o-nitrofenil-β-d-galactósido (ONPG) es un compuesto incoloro estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y o- nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupan de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de fermentadores de lactosa. 23

24 II. Materiales A. Solución de ONPG Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5.0 ml del buffer fosfato, ajustar a ph 7.0 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses. Guardar refrigerada (4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio. Rotular la solución, indicando fecha de preparación y de expiración. B. Buffer fosfato de sodio 1M (ph 7.0) Disolver 6,9 gr de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una solución de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el ph a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua destilada y guardar a 4º C.III. Procedimiento A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en 0.5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba basada en la observación de un cambio de color. B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG. C. Incubar la mezcla a 37ºC y examinar cambio de color hasta 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de calidad Escherichia coli (+) Salmonella (-) VI. Consideraciones A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de TSI. B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo. 24

25 Agar Lisina Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido, es necesaria la fermentación previa de la glucosa. Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formación de SH 2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii, desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera. II. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formación de SH 2 se indica por la aparición de una coloración negra. 25

26 III. Control de Calidad Bacteria Punción Estria Sh2 Salmonella sp. Violeta Violeta + Proteus mirabilis Amarilla Pardo-rojiza + Proteus vulgaris Amarilla Pardo-rojiza + Morganella morganii Amarilla Pardo-rojiza - Prov. rettgeri Amarilla Pardo-rojiza - Providencia spp. Amarilla Pardo-rojiza - Citrobacter spp. Amarilla Violeta + Escherichia coli Amarilla Violeta - Shigella spp. Amarilla Violeta - Klebsiella Violeta Violeta - Para el control de calidad seleccionar entre aquellos microorganismos disponibles. Agar SIM I. Principio Es un medio que se usa para determinar la formación de sulfuro de hidrógeno, la producción de indol y la movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, calentar suavemente hasta su disolución y dispensar en volumenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar a 121ºC, 15 minutos; enfriar en posición vertical y guardar en heladera. III. Procedimiento A.Con un ansa tomar material de una colonia y sembrar por punción. B.Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas. IV. Resultados A. Para la producción de SH 2 Ensayo positivo: ennegrecimiento del medio. 26

27 Ensayo negativo: no hay ennegrecimiento. B. Para la movilidad Ensayo positivo: hay una turbidez difusa del medio. Ensayo negativo: sólo hay crecimiento a lo largo de la punción. C. Para la producción de indol Ensayo positivo: aparición de color rojo cuando se agrega el reactivo de Erlich. Ensayo negativo: no hay aparición de color. V. Control de Calidad Escherichia coli: SH 2 -, indol +, movilidad + Klebsiella pneumoniae: SH 2 -, indol -, movilidad - Proteus vulgaris: SH 2 +, indol +, movilidad + VI. Consideraciones Un organismo que produce sulfuro de hidrógeno puede mostrar ennegrecimiento en SIM pero no en TSI por la presencia de sacarosa en este último medio. La utilización de la sacarosa puede suprimir los mecanismos enzimáticos responsables de la producción del sulfuro de hidrógeno. Test de Utilización de Azúcares I. Principio Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del organismo y de la claridad visual del cambio de ph. II. Materiales A. Medio base Peptona Extracto de carne 10.0 g 1.0 g 27

28 Cloruro de sodio Azul de bromotimol Indicador de Andrade Agua destilada 5.0 g 10.0 ml 5.0 ml 1000 ml Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar el ph a (7.4). Autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50ºC. Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azúcares. Dispensar en volumenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es estable por 3 meses. Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes de autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar en forma estéril después de enfriar a 50º C. B. Indicador de Andrade Disolver 0.5 gr de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N (4%); mezclar bien y dejar descansar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una decoloración suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%). III. Procedimiento 1) Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido. 2) Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono. Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería grande (15 a 20) de azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el ansa antes de tomar nueva muestra. 3) Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados día por día. 4) En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días. 28

29 IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de calidad Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo: Escherichia coli: glucosa + Klebsiella: lactosa + Yersinia enterocolitica: sacarosa + VI. Consideraciones A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo. B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa. C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular. D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas las Enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone campanita al medio con glucosa. Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa I. Principio La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción de una dihidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (ph < 6.0), apareciendo color amarillo. La 29

30 acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el ph con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-). II. Materiales El medio basal más utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio contiene peptona 5.0 g, extracto de carne 5.0 g, glucosa 0.5 g, bromocresol púrpura 0.01 g, rojo cresol g piridoxal g pero está disponible comercialmente. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El ph de la fracción que lleva ornitina se debe reajustar después de agregar el aminoácido y antes de esterilizar. Fraccionar en volumenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración y guardar en heladera. Al aceite mineral se le agrega 1 ml de agua por cada 100 ml de vaselina, y se autoclava a 121ºC por 45 minutos. III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos. B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril. C. Incubar a 37ºC D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento. 30

31 Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo). V. Control de calidad Bacteria Arginina Lisina Ornitina Proteus vulgaris Morganella morganii Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes S. Typhimurium Klebsiella VI. Consideraciones A. Inocular siempre un tubo control. B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido. C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de interpretar la reacción. D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe agregar más indicador antes de interpretar el resultado. E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado postivo. F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de interpretar los resultados. G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas. H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso. 31

32 Prueba del Malonato I. Principio El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar malonato como fuente de carbono. Las cantidades mínimas de glucosa del medio, permiten el desarrollo de organismos que no pueden usar malonato o sales de amonio, sin embargo esos organismos no pueden mantener un ph alcalino. La producción de ácido por la fermentación de la glucosa impide una posible alcalinización. Solamente los microorganismos que pueden usar simultáneamente malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno son capaces de ejercer una acción buffer produciendo hidróxido de sodio. El aumento de la alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie de verde a azul. Los microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa hacen que el indicador cambie de verde a amarillo. La mayoría de las especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato de sodio. El ensayo también sirve para separar Salmonella arizonae (+) de otras especies de Salmonella (-). II. Materiales El medio contiene: extracto de lavadura 1.0g, sulfato de amonio 2.0g, fosfato dipotásico 0.6g, fosfato monopotásico 0.4g, ClNa 2.0g, malonato de sodio3.0g, glucosa 0.25g, azul de brotimol (1g/500ml) 12.5g. Disolver en 1000 ml de agua destilada, dispensar 3 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar antes de usar; el sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración y guardar en heladera. Si hay cambio de color en el medio no usar. III. Procedimiento A. Con ansa estéril tomar material e inocular el medio. B. Incubar a 37ºC por 24 a 48 horas. C. Continuar incubando los tubos negativos hasta 4 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: reacción alcalina (azul). 32

33 Ensayo negativo: no hay cambio de color (verde). Ensayo negativo: reacción ácida, sólo fermentación de glucosa (amarillo). V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes + Escherichia coli - VI. Consideraciones A. Algunos organismos malonato (+) producen una ligera alcalinidad, que hace la interpretación difícil. Cuando hay duda comparar con un tubo sin inocular. Cualquier vestigio de color azul denota una prueba positiva luego de una incubación de 48 horas. No se debe hacer una interpretación final negativa hasta no haber incubado los tubos durante 48 horas. B. A veces es necesario agregar extracto de levadura y glucosa para estimular el crecimiento de algunos organismos. C. Algunas cepas malonato (-) dan color amarillo por la fermentación de la glucosa solamente. Esto produce una disminución del ph y el viraje del indicador al amarillo. Ensayo del Rojo de Metilo I. Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen ácido y bajan el ph a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a ph < 5.0 y amarillo a ph > 5.8. El test es útil para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo). La mayoría de las Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metabólico, pero raramente ambos. II. Materiales A. Preparación del medio 33

34 El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera. B. Preparación del reactivo Disolver 0.1 gr de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua destilada, para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera. III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP. B. Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas. C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo. D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color. IV. Resultados Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo. Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja. Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más. V. Control de Calidad Escherichia coli + Enterobacter aerogenes - VI. Consideraciones A. Variaciones en la cantidad de peptona del medio puede afectar el resultado. B. Aumentando la concentración de glucosa en el medio no se acelera la reacción del rojo de metilo. C. No sobreinocular, el crecimiento bacteriano se inhibe cuando el inóculo es grande. D. Una incubación de 48 horas es suficiente para la mayoría de los cultivos; pero el ensayo no se debe realizar con cultivos que tengan menos de 48 horas de incubación. 34

35 Ensayo de Voges-Proskauer I. Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de α-naftol antes del agregado de KOH. II. Materiales A.Preparación del medio El medio está disponible comercialmente. Para la preparación del caldo RM/VP, ver el procedimiento indicado para el test de rojo de metilo. B. Preparación de solución de α-naftol Disolver 5.0 gr de α- naftol en una pequeña cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el volumen a 100 ml. La solución debe ser incolora. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera en frascos color caramelo. C. Preparación de la solución de KOH Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml (trabajar sobre baño de agua fría para evitar recalentamiento). El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP. B. Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas. C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a otro tubo. D. Agregar 0.6 ml del reactivo de α-naftol. 35

36 E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH. F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos. G. Observar la formación de un color rosado a rojo. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de Calidad Klebsiella pneumoniae Escherichia coli + VI. Consideraciones A. Cuando hay una incubación prolongada (más de 3 días) algunos organismos VP + pueden producir un aumento de la acidez del medio, dando reacciones positivas débiles o falsas reacciones negativas. B. La mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas entre el rojo de metilo y VP, sin embargo algunos organismos como Hafnia alvei pueden dar ambas reacciones positivas. C. Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversión del orden puede dar un resultado positivo débil o un falso negativo. D. No se debe agregar KOH en exceso, porque se puede enmascarar una reacción positiva débil por la formación de un color cobrizo por la reacción del KOH con el α-naftol. No leer el ensayo después de 1 hora; puede aparecer una coloración cobriza dando un resultado falso positivo. Prueba de la Urea I. Principio La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2 moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una actividad 36

37 característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-) II. Materiales El medio base está disponible comercialmente, es el medio base de urea de Christensen, que contiene peptona 1.0 g, glucosa 1.0 g cloruro de sodio 5.0 g, fosfato monopotásico 5.0 g, solución de rojo fenol al 0.2% 6 ml. Se disuelve medio en agua destilada y esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar 5 ml de una solución de urea al 40% por cada 100 ml de medio. Mezclar y fraccionar en volumenes de 2.5 ml en tubos estériles. Guardar en heladera. La urea se pesa asepticamente, se disuelve en agua y se calienta a 70ºC por 20 minutos, se guarda en frascos estériles con cloroformo (igual que para los azúcares). III. Procedimiento A) Con un ansa estéril se toma abundante material y se inocula por punción B) Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se observan diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del mismo. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes Escherichia coli Proeus vulgaris + 37

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