Cultivo de Células en Suspensión y en Monocapa

Transcripción

1 Cultivo de Células en Suspensión y en Monocapa

2 Cultivo Celular en el laboratorio. 1) Accesorios necesarios, instrumentos, etc. 2) Esterilidad en campana de flujo laminar. 3) Proveer a las células para un periodo de cultivo. 4) Preparado para experimentos en cultivo celular. Alrededores adecuados: Cuarto de cultivo. Campana de flujo laminar e incubadora. Preparación de medios de cultivo cuidadosa y críticamente. Considerar: oriesgo de movimiento. osin tráfico de personal. odistancias cortas entre unidades individuales. osuficiente espacio para moverse.

3 Hepatocitos Córnea (epiteliales transfectadas) Próstata (Carcinoma) Fibroblastos Linfomas Placenta Mama Hueso Cultivos Primarios

4 Cultivos primarios Explante Órgano Disgregación Mecánica Enzimática Hialuronidasa Tripsina Colagenasa Elastasa 100 X

5 Fotos explantes

6 Líneas celulares La Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Líneas celulares de una variedad de fuentes animales: Mamíferos, Anfibios Peces Insectos. Humanas. Ratón. Cáncer.

7 ATCC Cell_Biology_Collections.aspx

8 Tissue Skin (247) Derived From Metastatic Site (219) Lung (210) Blood (103) Breast (84) Lymph Node (76) Bone (70) Peripheral Blood (69) Colon (43) Brain (43) More... Disease Carcinoma (269) Cancer (184) Adenocarcinoma (158) Normal (71) Leukemia (62) Lymphoma (61) Melanoma (40) Osteosarcoma (39) Ehlers- Danlos Syndrome (35) Sarcoma (23) More... Cell Type Epithelial (129) Fibroblast (119) Lymphoblast (88) Lymphocyte (71) B Lymphoblast (62) B Lymphocyte (36 Cell Origin Human (666) Mouse (3)

9 Cell Line Designation: Hep G2 ATCC Catalog No. HB-8065 Table of Contents: Cell Line Description Biosafety Level Use Restrictions Handling Procedure for Frozen Cells Handling Procedure for Flask Cultures Subculturing Procedure Medium Renewal Procedure Complete Growth Medium Cryoprotectant Medium References Replacement Policy Cell Line Description Organism: Homo sapiens ( human) Tissue: liver; hepatocellular carcinoma Age: 15 years Gender: male Ethnicity: caucasian Morphology: epithelial Growth properties: adherent. Clusters of multi-layers of cells are not an unusual morphology for this cell line.

10 Tumorigenic: the cells were not tumorigenic in immunosuppressed mice, but did form colonies in semisolid medium. Cellular Products: alpha-fetoprotein (alpha fetoprotein); albumin; alpha2 macroglobulin (alpha-2-macroglobulin); alpha1 antitrypsin (alpha-1-antitrypsin); transferrin; alpha1 antichymotrypsin; (alpha-1-antichymotrypsin); alpha1 acid glycoprotein (alpha-1 acid glycoprotein); alpha2 HS glycoprotein (alpha-2-hs-glycoprotein); beta lipoprotein (beta-lipoprotein); retinol binding protein (retinol-binding protein) haptoglobin; ceruloplasmin; plasminogen; complement (C4); C3 activator; fibrinogen; Receptors expressed: insulin; insulin-like growth factor II (IGF II) Depositors: Wistar Institute Comments: The cells express 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase and hepatic triglyceride lipase activities. The cells demonstrate decreased expression of apoa-i mrna and increased expression of catalase mrna in response to gramoxone (oxidative stress). There is no evidence of a Hepatitis B virus genome in this cell line Karyotype: Modal number = 55 (range = 50 to 60); has a rearranged chromosome 1. Note: Cytogenetic information is based on initial seed stock at ATCC. Cytogenetic instability has been reported in the literature for some cell lines.

11 Descongelamiento de Células

12 Descongelamiento de Células 1. Remover el tubo del nitrógeno líquido. Usar lentes. 2. Transferir el tubo a B.M. con 37 o C en y calentar rápidamente. 3. Limpiar tubo con alcohol al 70%. 4. Transferir la suspensión celular a tubo de centrífuga de 10 ml. 5. Agregar lentamente 10 ml de medio de cultivo. 6. Para remover el DMSO toxico, centrifugar 5 a 800 rpm. 7. Descartar el sobrenadante y remplazarlo por medio de cultivo fresco. 8. Transferir las células a botella de cultivo o caja Petri. 9. Cultivar en incubadora a 37 o C por 24 h. 10. Remover el medio, cada 3er. día.

13 37 o C Limpiar Et-OH 70% o C 10 ml 5 a 800 rpm

14 10 ml 100 X 37 o C 5-8% CO 2 humedad Ocular 10X Obj 10 X 20 X 32 X 200 X

15 RESIEMBRA Y COSECHA DE CÉLULAS 100X Incubar a 37 o C por 7 d 200X 200X Monocapa confluente 1 320X Remover medio y lavar con PBS (con o sin EDTA) Incubar a 37 o C Agregar tripsina Resembrar células en botella. 1:2 Resuspender células en medio y contar Remover tripsina Células redondas 100X después de la incubación Incubar a 37 o C por 10

16 CULTIVO DECÉLULAS EN MONOCAPA Células HepG2. descongeladas. 200 X Células HepG2. 4 h después de descongeladas. 100 X

17 Células HepG2. 3 días de cultivo. 200 X 320X 100 X 200 X 320X

18 100 X 200 X 320X Células HepG2. 5 días de cultivo. 200 X 320X 200 X 320X

19 Células HepG2. 7 días de cultivo. 100 X 200 X 320X 100 X 200 X 320X

20 Día : cero Día: 3 Día: 5 Día: 8

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22 1 X 10 4 No. de células/ml

23 Día : cero Día: 3 Día: 5 Día: 8

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25 Subcultivo celular Puede variar dependiendo de la línea celular, en este caso se trata de células HepG2. 1. Se tienen las células en fase exponencial de crecimiento celular. 2. Se coloca la caja Petri en la campana de cultivo en condiciones estériles. 3. Se desecha el sobrenadante utilizando una pipeta o aspersor. 4. Se lavan las células 1-2 veces con solución de PBS, desechándolo en cada lavado. Se quita el exceso de solución. 5. Se agrega una alícuota de PBS con EDTA 2 mm por 3-5 min y se desecha. 6. Se coloca 1 ml de tripsina y se incuba a 37 o C, por 2-4 min hasta observar que las células comienzan a despegarse. 7. Ya disgregadas las células, agregar un volumen de medio de cultivo, suficiente para subcultivar las células. 8. Homogenizar las células y repartir en las cajas de cultivo: 1:2, 1:3 o 1:4. 9. Cultivar en incubadora a 37 o C, 5% de CO2 y humedad a saturación. 10. Remover el medio, cada 3er. día.

26 SUBCULTIVO Lavar 2 veces con PBS Agregar PBS- EDTA 1mM 3 Agregar 1 ml de Tripsina, incubar 37 o C 3-4 EXPERIMENTO Agregar medio de cultivos suplementado y homogenizar CONTAR CÉLULAS Repartir por igual p.e. 3 X 10 6 células c/u TRATAMIENTO CON AGENTE TÓXICO CONTROL [10mM] [100 mm]

27 No. de Células X 1000 Proliferación de Células HepG Tiempo (días)

28 CULTIVO DECÉLULAS EN SUSPENSIÓN

29 CULTIVO O SIEMBRA. Muestra de sangre humana (3-5 ml) con una jeringa estéril y heparinizada. Vaciar en un tubo de 15 ml, estéril y etiquetado. Agregar: a) 2.5 ml Medio Mc Coy 5A. b) 0.16 ml Fitohemaglutinina. c) ml Antibiótico. d) 3.0 ml Sangre completa, vaciar gotas, quitar la punta metálica de la jeringa para no romper la muestra celular. e) Cerrar el tubo y homogenizar suavemente la mezcla. a. b. c. d. Incubadora Incubadora a 37% C por 72 o 96 h máximo, para realizar el cultivo celular. Cosechar y obtener cromosomas.

30 Cultivo celular en suspensión Eritrocitos Linfocitos

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