M.Sc. Manuel Campos Rudín, Paula Solera, maritza Guerrero, Leonardo Garro Mena, Roberto Vega, Andrea Rivera

Transcripción

1 Ficha del proyecto Título del proyecto Período de ejecución Universidades participantes Nombre y apellidos (investigador principal) Nombre y apellidos(investiga dores asociados) Asistentes Resumen/Abstract (máximo 300 palabras) Selección de cepas de microalgas para la producción de lípidos como fuente de combustibles y otros productos derivados UCR, ITCR, LANOTEC Ana Margarita Silva Benavides M.Sc. Manuel Campos Rudín, Paula Solera, maritza Guerrero, Leonardo Garro Mena, Roberto Vega, Andrea Rivera Olman Gómez Espinoza, Gabriel Rodríguez Castillo, Didier Mena Aguilar, Jeanise Masis Rivera, Laura Brenes, Dayana Vega, José Barrantes. El proyecto inició en enero del 2010 y tiene como objetivo principal contribuir a la implementación de procesos dirigidos al mejoramiento del cultivo y caracterización de microalgas con alto potencial de lípidos para la producción de biodiesel. Ha conllevado a la generación de procesos de producción de microalgas en condiciones de laboratorio y a pequeña escala en fotobiorreactores abiertos y cerrados en las instalaciones de la Universidad de Costa Rica (UCR) y el Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR). Los objetivos del proyecto están dirigidos 1) Crecimiento de cepas aisladas en diferentes condiciones ambientales en el laboratorio y cultivos al externo, 2) determinación de metabolitos de la biomasa

2 en términos de proteínas, lípidos, carbohidratos y pigmentos, 3) construir sistemas de cultivo en el laboratorio y al externo y 4) obtener bioetanol. En el Laboratorio de Microalgas del CIMAR, se trabajó con cuatro cepas de alga verde (Chlorophyceae), una cepa de la clase Eustigmatophyceae, tres cepas de diatomeas de agua de mar (Bacillariophyceae) Las cepas se han escalado en condiciones de laboratorio y cultivos al externo en el CIMAR a diferentes condiciones de luz y temperatura, se ha evaluado la tasa de crecimiento en términos de peso seco y pigmentos (clorofila a,b,c y carotenoides) y la composición bioquímica de la biomasa como carbohidratos, proteínas y lípidos. El ITCR ha estudiado desde el punto de vista de la tasa de crecimiento, pigmentos y composición bioquímica de la biomasa el alga verde Chlorella vulgaris en condiciones de laboratorio. Con el propósito de escalar a volúmenes mayores la biomasa obtenida de los cultivos en el laboratorio, en las instalaciones del ITCR se diseñó y construyó un fotobioreactor rectangular casero con un volumen total de 1000L el cual dispone de un sistema electrónico de control automático que mide de forma sensible variables como el ph, temperatura y dióxido de carbono disuelto (CO 2 ). Además, se realizó un conteo periódico de la cantidad de microalgas por mililitro, utilizando la técnica de conteo con cámara de Neubauer. Luego, se procedió a realizar la extracción de aceite y su cuantificación en el Centro de Química Ambiental (CEQUIATEC). La UCR ( Escuela de Ingeniería Química) diseñó y construyó un fotobioreactor tubular de 1000L que dispone de un sistema de control automático, el cual permite variar las condiciones de operación para evaluar su efecto en el desarrollo de las microalgas. En el CIMAR se construyeron dos sistemas de cultivos abiertos que corresponden a un estanque de 1 m de diámetro y 40 cm de profundidad y una cascada de 9 m de largo y 1.20 cm de ancho. Una vez producido un volumen de biomasa considerable, se procedió a realizar ensayos de extracción de aceites, así como de bioetanol por parte del Laboratorio Nacional de Nanotecnología. Con el análisis de aceites, se pretende obtener el porcentaje de lípidos de la microalga y su composición por medio de una extracción físico química y una posterior separación de la fase lipídica de la solución y obtener eventualmente etanol. Este método consiste en una hidrólisis de la biomasa en azúcares, los cuales se fermentan por medio de levaduras para producir etanol, y posteriormente se determina el rendimiento del proceso por medio de cromatogafía de gases.

3 Objetivo general Resultados principales (los que considera más significativos) Contribuir a la optimización e implementación de procesos dirigidos al mejoramiento del cultivo de microalgas, y la generación de biomasa con alto potencial para ser usado en la producción de biocombustibles y bioetanol. Instituto Tecnológico de Costa Rica Se realizó el ajuste del medio de cultivo de mantenimiento de la cepa Chlorella vulgaris (Chlorophyceae). Se empleó el medio indicado según la UTEX. Cada medio ha sido monitoreado por su edad y replicado cada 22 días. Se estableció una curva de crecimiento preliminar de la cepa en estudio, considerando una relación inicial del inóculo de 50 ml de cultivo provenientes de un patrón con una edad de 22 días y 200 ml de medio de cultivo, para un total un volumen total de 250 ml. Se realizó el conteo diario celular por periodos mayores de 15 días empleando la Cámara de Neubauer. Los resultados obtenidos indicaron un tiempo de 15 días del ciclo de crecimiento; con fases de crecimiento exponencial entre el día 6 y el día 12 (el día 12) el cultivo entró a una fase estacionaria máxima (Fig. 1). Los resultados del crecimiento biomásico algal en los cultivos, mostraron que se puede lograr obtener mayores densidades celulares en menor tiempo, por lo que se considera que el proceso utilizado en el laboratorio es eficiente (Fig. 1). La curva de ajuste (línea continua) indica puntos importantes de conexión con el crecimiento de la microalga.

4 Figura 1. Curvas de crecimiento microalgal acumulado (por conteo de células) de Chlorella sp. durante un periodo de 15 días. ITCR Se realizaron dos tratamientos paralelos con medios de cultivo de Chlorella vulgaris a diferentes concentraciones nutricionales. De esta forma, se logró estimular una respuesta positiva en la producción de aceites en condiciones de laboratorio (tratamiento 1 y tratamiento 2). Se logró obtener una densidad celular al momento de cosecha entre x 10 6 cél ml -1 con un inóculo microalgal (con una relación1:5) proveniente de un cultivo de 22 días y éste fue sembrado en

5 un volumen de 250ml. (Fig. 2). Para el tratamiento 1, se determinó que el patrón de crecimiento de la curva para Clorella vulgaris es semejante con la curva de crecimiento del testigo, así como la producción de aceites. En el tratamiento 2 se observó una vertiginosa desaceleración de la curva de crecimiento cerca del día 2; paralelo a esto, se determinó la acumulación de aceites desde los primeros días de establecido el tratamiento y se incrementó la producción de aceites hasta el momento de cosecha de las microalgas (48% de aceites). Durante el proceso de extracción de aceites, el tratamiento testigo mostró valores que oscilan entre el 0,1 a 21 % de gramos de aceites en relación con la biomasa total acumulada. Para el tratamiento 2, estos valores subieron a 48% gramos de aceites en relación con gramos de biomasa total fijada del tratamiento.

6 Fig. 2. Curvas de crecimiento microalgal acumulado (por conteo de células) de Chlorella sp en dos tratamientos establecidos y un testigo, durante un periodo de 15 días. ITCR Se utilizaron también diferentes medios orgánicos para cultivar Chlorella vulgaris con el objetivo de determinar el mejor tratamiento. Se demostró que los tratamientos orgánicos presentaron una mayor densidad celular microalgal, alcanzando la curva máxima en 7 días, por lo tanto se produce mayor biomasa que el control (medio químico de Chlorella vulgaris). Los resultados de crecimiento algal con el fotobioreactor casero (volumen final de 1000L), se obtuvo una curva de crecimiento exponencial entre el sétimo y noveno día con , 6 cel/ml. Fig.3.

7 Figura 3. Curva de crecimiento de Chlorella sp., en un fotobioreactor de 1000L de volumen total, en un medio de cultivo estándar, durante un periodo de 13 días. ITCR Los resultados de los análisis de la composición química del aceite, demostró que el aceite de microalgas presenta un excelente calor de combustión en relación con el aceite de palma, una de los lípidos de mayor uso para biocombustibles. La viscosidad es semejante al aceite de palma, condición que convierte el aceite de microalgas como potencial para el mercado. Los resultados de producción y extracción de aceites vs biomasa indican que se tiene una relación de un 70% de aceites intra celulares.

8 Cuadro. 1. Análisis Datos promedio Aceite (g.m 3-1.d -1 ) 15,2533 Biomasa seca (g.m 3-1.d -1 ) 24,1576 Relación Aceite/Biomasa (p/p) 0,7224 Masa de CO2 capturado (t.m 3-1.año -1 ) 0,0205 Universidad de Costa Rica Unidad responsable: Escuela de Ingeniería Química, Universidad de Costa Rica. Ing. Jenny Calderón Castro y Ing. Leonardo Garro Mena. Nota: el investigador responsable no envió la información del año 2012; por consiguiente, la siguiente información se obtuvo del informe de labores del año Resultados obtenidos: -Se simuló el flujo dentro del fotobiorreactor utilizando el programa COMSOL. -Se obtuvieron los campos de velocidad dentro del fotobiorreactor (excluyendo la bomba airlift). -Con base en la simulación se determinaron los radios de giro necesarios para asegurar la salud de las microalgas desde el punto de vista hidráulico. -Se determinaron los diámetros de tubería y longitud del fotobiorreactor necesarios para obtener datos útiles al realizar las corridas.

9 -Se definieron las variables de interés a ser controladas. -Se listó la posible instrumentación a utilizar. -Se revisaron las fichas técnicas de la instrumentación. -Se adquirieron las tuberías y algunos accesorios de PVC. - Se definió la forma de realizar el curvado de las tuberías para obtener los radios de giro. Unidad responsable: LANOTEC Resultados principales: Se obtuvieron porcentajes de azúcares fermentables a partir de la hidrólisis de la biomasa y los porcentajes de etanol de la fermentación por medio de curvas en GC, con una columna WAX. (Los responsables no enviaron información adicional). Unidad responsable: CIMAR. A continuación se presenta una lista de las microalgas que se han aislado y cultivado en el Laboratorio de Microalgas del CIMAR a partir de muestras tomadas en varios sitios del país y con las cuales se han realizado varios experimentos en el presente proyecto,:

10 Cuadro 2. Especies aisladas en el presente proyecto. Especie Chlorella sorokiniana (Catarata Monteverde, Puntarenas, y R. Sarapiquí, Heredia). Agua dulce Dos cepas. Nannochloropsis assafsukenik (Isla del Coco, marina) Navicula sp. (Isla del Coco, marina). Navicula sp. (Manglar Térraba-Sierpe,-marina). Phaedactylum tricornutum (Isla del Coco, marina) Haematococcus pluvialis (R. Sarapiquí, Heredia, agua dulce) Cymbella sp. Golfo de Nicoya, marina Scenedesmus sp. (Turbera de San Cristóbal, Cartado, agua dulce). Clase Chlorophyceae Eustigmatophyceae Bacillariophyceae Bacillariophyceae Bacillariophyceae Chlorophyceae Bacillariophyceae Chlorophyceae Crecimiento (g/l) y productividad (mg/l/d)

11 En las Figs. 4. (a-o) se presentan los resultados de crecimiento (g/l) y productividad (mg/l/d) de los experimentos realizados con diferentes especies a varias condiciones de luz. Estos experimentos realizados en el laboratorio indican que la cinética del crecimiento de las diferentes especies de microalgas es regulada en gran medida por la cantidad de la intensidad lumínica. La temperatura juega también un papel importante, pero esta variable no se midió en estos experimentos. En general, la mejor condición en condiciones de crecimiento y productividad se presenta a una intensidad lumínica de 150 µmol/m 2 /seg y las especies que presentaron mayor productividad fueron Nannocloropsis assafsukenik (Eustigmatophyceae), Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyceae) y Scenedesmus sp. (Chlorophyceae).

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13 Figs. 4 (a-o). Distribución de la cinética del crecimiento (mg/l), productividad (g/l/d) de varias especies de microalgas analizadas en el laboratorio.las Figs. 5 a y b presentan las productividades (mg/l/h) medidas en cultivos de Chlorella

14 sorokiniana aislada del R. Sarapiquí, Heredia a dos intensidades lumínicas y a seis temperaturas diferentes (20, 25, 30,35,40,45 C ). Productividad (mg/l/h) Productividad (mg/l/h) de Chlorella sorokiniana Intensidad lumínica: 100 µmol/m 2 /seg Días 20 C 40 C 35 C 25 C 30 C 45 C

15 Productividad (mg/l/h) de Chlorella sorokiniana Intensidad lumínica: 200 µmol/m 2 /seg Productividad (mg/l/h) Días 20 C 40 C 35 C 25 C 30 C 45 C - Los cultivos a una intensidad lumínica de 100 µ mol/m 2 / seg presentaron mayor duración en el tiempo que los cultivos a 200 µ mol/m 2 / seg. -La productividad en todos los cultivos fue mayor a la intensidad lumínica de 200 µ mol/m 2 / seg. -Se presentaron diferencias en la productividad con respecto a las diversas temperaturas. - En general, las productividades a todas las temperaturas a la intensidad lumínica de 200 µ mol/m 2 / seg. presentaron mayores rendimientos que a 100 µ mol/m 2 / seg. A esta intensidad lumínica, la mejor productividad se presentó a 20 C; mientras que a 200 µ mol/m 2 / seg, la mejor productividad se presentó a 30 C.

16 El Cuadro 3 presenta la composición química de Chlorella sorokiniana medidas a seis temperaturas diferentes y a las intensidades lumínicas 100 y 200 µ mol/m 2 / seg. (Los datos presentados constituyen el promedio de varias mediciones realizadas (máximo tres réplicas de cada experimento). Temperatura Intensidad lumínica Proteína (% peso seco) Carbohidrato (% peso seco) lípidos (% peso seco) ,61 37,18 19, ,09 40,80 17, ,17 20,62 26,57/28, ,93 36,79 21, ,33 16,38 20, ,38 21,01 23, ,25 15,95 17, ,30 20,44/25,99 7, ,65 33, ,92 49,63 17, ,63 53,78 16, ,80 61,84 18, ,31 27, ,96 54,69 20, ,53 33,57 17, ,50 18,01 19, ,00 0,00 0,00 En esta especie, los lípidos es el menor componente medido, mientras que se presentó un aumento en las proteínas y

17 carbohidratos. A la luz de 200 µmol/m 2 /seg, la composición química a 45 C fue nula, en paralelo a un crecimiento casi nulo de la biomasa. Composición de la biomasa en diferentes especies de microalgas. El Cuadro 4 presenta la composición química de varias especies aisladas de diferentes sitios de Costa Rica. Cuadro 4. Porcentajes de proteínas, carbohidratos, lípidos y cenizas de varias especies de microalgas aisladas de sitios marinos y de agua dulce de Costa Rica a diferentes condiciones de intensidad lumínica en el laboratorio. La temperatura se mantuvo en todos los experimentos entre C. (Los datos presentados constituyen el promedio de varias mediciones realizadas (máximo tres réplicas de cada experimento). Luz (µmol/m 2 /seg) Proteínas (%) Carbohidratos (%) Lipidos (%) Cenizas (%) Especie Chlorella sorokiniana (agua dulce)-cepa ,25 17,86 27,99 *** Chlorella sorokiniana (agua dulce) Cepa ,31 37,28 24,50 *** Chlorella sorokiniana (agua dulce) Cepa ,04 28,02 30,30 *** Chlorella 60 *** *** 39,40 ***

18 sorokiniana (agua dulce) Cepa 2. Chlorella sorokiniana (agua dulce) Cepa ,38 31,08 18,53 Chlorella sorokiniana (agua dulce) Cepa ,99 11,96 29,91 Nannochloropsis assafsukenik (marina) ,48 9,28 20,67 *** Nannochloropsis assafsukenik (marina) ,44 12,01 21,39 *** Nannochloropsis assafsukenik (marina) 60 34,52 19,79 32,76 *** Phaedactylum tricornutum (marina) 60 25,14 18,36 26,70 *** Phaedactylum ,76 14,10 *** ***

19 tricornutum Phaedactylum tricornutum (marina) ,01 10,50 18,43 Haematococcus pluvialis (agua dulce) 60 27,58 16,18 *** *** Haematococcus pluvialis (agua dulce) ,48 63,34 20,66 *** Haematococcus pluvialis (agua dulce) ,49 60,18 15,65 0,25 Cymbella sp. (marina) ,06 11,60 *** *** Cymbella sp. (marina) ,63 10,60 37,11 6,34 Scenedesmus sp. (agua dulce) 60 33,56 43,71 72,34 *** Scenedesmus sp. (agua dulce) ,41 41,40 *** *** Scenedesmus sp. (agua dulce) ,88 40,91 27,96 ***

20 Consejo Nacional de Rectores (CONARE) Instalación y funcionamiento de dos sistemas de cultivo al externo: Se construyó y se instaló un estanque cuyas dimensiones consisten de 1 m de diámetro y 40 cm de profundidad y una cascada que consiste en una plataforma de 9 m de largo y 1,20 m de ancho. Cascada Estanque Cuadro 5. Datos ambientales medidos en el cultivo externo de Scenedesmus sp. (aislada de una turbera en San Cristóbal, Cartago) en el sistema de la cascada. Hora 09:20 Radiación lumínica 614 C Medio 23,8 C Ambiente 28,8 ph 7,71 O2 disuelto 6,56 Condiciones Ambientales Poco sol

21 16: ,1 23,3 7,88 6,69 Nublado 10: ,4 8,97 6,52 Nublado 09: ,2 8,51 6,71 Soleado 10: ,2 26,9 9,33 6,2 Soleado 16: ,6 25,3 7,91 6,24 Nublado 08: ,8 22,5 7,55 6,76 Nublado y lluvia 09: ,4 26,9 7,72 6,56 Soleado 15: ,1 25,1 8,01 6,52 Nublado 08: ,5 26,4 7,58 6,57 Poco Sol 08: ,2 25,7 7,74 6,43 Soleado 08: ,3 7,62 6,56 Soleado 15: ,7 25,2 7,94 6,33 Nublado 09: ,1 24,5 7,82 6,53 Poco sol 16: ,7 25 7,82 6,29 Nublado 08: ,4 25,3 7,67 6,49 Nublado 14: ,1 27,2 8,08 5,77 Soleado Cuadro 6. Datos ambientales medidos en el cultivo externo de Scenedesmus sp. en el sistema del estanque. Hora Radiación lumínica C Medio C Ambiente ph O2 disuelto Condiciones Ambientales 09: ,4 28,8 8,38 11,31 Poco sol 16: ,5 23,3 7,26 6,24 Nublado 10: ,5 27,4 10,68 9,73 Nublado

22 09: ,1 25,2 7,51 10,02 Soleado 10: ,9 11,55 10,92 Soleado 16: ,7 25,3 10,15 6,49 Nublado 08: ,2 22,5 6,43 7,79 Nublado y lluvia 09: ,4 26,9 10,63 8,81 Soleado 15: ,9 25,1 11,78 6,72 Nublado 08: ,5 26,4 6,94 9,16 Poco Sol 08: ,3 25,7 7,29 8,21 Soleado 08: ,2 26,3 7,22 8,34 Soleado 15: ,6 25,2 7,18 7,95 Nublado 09: ,4 24,5 7,57 8,11 Poco sol 16: ,08 7,11 Nublado 08: ,3 25,3 7,43 8,07 Nublado 14: ,6 27,2 7,34 8,11 Soleado - Cuadro 7. Promedios de metabolitos en las especies Chlorella sorokiniana (aislada del R. Sarapiquí, Heredia) y Scenedesmus spp. (Aislada de una turbera del Cerro de la Muerte) en dos sistemas abiertos de cultivo. Especie Sistema Proteínas (%) Carbohidratos (%) Lípidos (%) Cenizas (%) Chlorella sorokiniana Cascada 90,90 17,15 24,57 *** Chlorella sorokiniana Cascada 71,00 23,87 32,56 *** Chlorella sorokiniana Cascada 84,47 18,37 23,54 0,49 Chlorella sorokiniana Estanque 48,10 10,10 23,50 ***

23 Chlorella sorokiniana Estanque 45,25 12,24 26,15 *** Scenedesmus sp Cascada 41,44 32,90 *** *** Scenedesmus sp Cascada 31,77 44,31 26,70 *** Scenedesmus sp Cascada 32,62 36,11 *** *** Scenedesmus sp Estanque 45,47 36,49 *** *** Scenedesmus sp Estanque 37,06 38,14 25,25 *** Scenedesmus sp Estanque 32,10 27,61 *** *** Cuadro 8.: Concentraciones de pigmentos realizadas en dos sistemas abiertos de la cepa de Scenedesmus sp. (Aislada de una turbera del Cerro de la Muerte) en dos días diferentes. Clorofila a (mg/l) Clorofila b (mg/l) Clorofila a+b (mg/l) Carotenoides (mg/l) Fecha/hora Estanque Cascada Estanque Cascada Estanque Cascada Estanque Cascada 3/03/ hrs. 8,63 12,46 2,92 4,75 11,56 17,22 2,64 4,25 10 hrs. 9,41 11,00 3,11 4,58 12,53 15,59 3,02 3,66 12 m.d. 13,01 9,71 4,03 4,25 17,05 13,97 4,72 3,60 14 hrs 16,98 9,27 5,42 3,95 22,40 13,22 5,68 3,68 16 hrs. 25,35 9,81 9,04 3,89 34,39 13,71 7,72 4,01

24 18 hrs. 27,83 9,77 10,15 3,83 37,99 13,60 7,99 3,95 18/03/ hrs. 12,81 20,89 4,83 9,00 17,64 29,89 4,30 7,44 10 hrs. 13,30 21,30 4,90 9,03 18,21 30,34 4,76 8,45 12 m.d. 15,48 21,32 5,59 8,82 21,07 30,14 5,55 8,75 14 hrs. 18,48 21,35 6,44 8,72 24,93 30,07 6,44 9,12 16 hrs. 25,43 24,28 9,06 9,90 34,50 34,18 8,02 9,47 18 hrs. 24,57 23,70 9,61 9,76 34,18 33,47 8,21 9,48 Cuadro 9: Productividades (g/m 2 /h) obtenidas en el estanque y cascada de un cultivo de la cepa de Scenedesmus sp. (Aislada de una turbera del Cerro de la Muerte) en dos días diferentes. Hora del día Productividad del estanque (50 L) g/m 2 /h 6/3/12 20/3/12 Estanque Productividad Cascada Productividad Estanque Productividad Peso de la Cascada (Peso del estanque Peso seco. de la cascada seco g/l (80 L) seco) g/l. (50 L) g/l (80 L) g/m 2 *h g/m 2 /h g/m 2 /h ,46 0,97 0,86 1,52 Cascada Peso seco. g/l

25 ,70 0,4 1,02 1,75 0,93 2,08 1, ,98 0 0,96 5,5 1,15 2,4 2, ,5 1,24 0 0,81 7 1,43 2,16 2, ,75 1,47 1,84 1,04 7 1,71 0,64 2, ,76 1,58 0 1,02 6,75 1,98 0,4 2,48 En ambas fechas, la productividad y el crecimiento del cultivo en términos de peso seco fue mayor en el estanque que en la cascada, con un aumento en las horas de mayor incidencia lumínica alrededor de las 12 m.d hasta las 16 horas. En la Fig. 6 (abajo), se compararon la productividad del cultivo de la diatomea marina Phaeodactylum tricornutum en la cascada a tres concentraciones de biomasa (0.3, 0.6 y 1.0 g/l) y un estanque a una concentración de 0.3 g/l. La productividad areal de los cultivos en la cascada disminuyó comparado con el estanque que alcanzó productividades areales de 14.8 gp.s.m -2 d -1 ; sin embargo, se obtuvieron altas productividades areales (18 g P.S.m -2 d -1 ) en la cascada cuando la concentración inicial se incrementó a 1.0 gl -1.

26 Phaeodactlylum (diatomea) Comparación de la productivdad volumétrica y areal entre el estanque y cascada a diferentes concentraciones celulares y densidad areal. Productividad (g/l/día) Cascada (1.0 g/l) Estanque (0.3 g/l) Cascada (0.3 g/l) Cascada (0.6 g/l) Condiciones del cultivo Estanque (0.3 g/l) Cascada (0.3 g/l) Cascada (0.6 g/l) Cascada (1.0 g/l) Productividad areal (g/m 2 /día) Productivdad Productivdad areal De los resultados obtenidos de los experimentos realizados en condiciones externas, se nota que la diatomea Phaeodactylum tricornutum puede crecer bien en el estanque y en la cascada; sin embargo, la productividad en la cascada es superior a la del estanque; debido que en esta última, la mezcla que prevalece favorece el incremento de la productividad

27 Más Información (referencias impresas o digitales) Contacto Torzillo, G ; C. Faraloni; A.M. Silva; J. Kpecky; J. Pilny & J. Masojidek Photoacclimation of P. tricornutum (Bacillariophycea) cultures grown outdoors in photobioreactors and open ponds. European J. of Phycology. 47(2): M. Silva