Resistencia al frío en dos microalgas verdes del genero Chlorella, aisladas de la Octava Región y del territorio Antártico chileno.

Transcripción

1 Resistencia al frío en dos microalgas verdes del genero Chlorella, aisladas de la Octava Región y del territorio Antártico chileno. Nombre de los estudiantes que integran el equipo de trabajo (máximo 3) Nombre completo: Curso: 1. María Paz Soto Vergara 3ro Medio 2. Daniel Ignacio Figueroa Jerez 3ro Medio 3. Eugenio Nicolás Sanhueza Monsalves 3ro Medio Asesor(a) Nombre: Juana Verónica Torrejón Montenegro RUT: Especialidad: Establecimiento Educacional: Biologia Colegio San Agustín Dirección Particular: Teléfono Particular: Tucapel 216, Concepcion Celular: personal: juvetomo@yahoo.com Director del establecimiento educacional que respalda la propuesta Nombre: María Paulina Bellolio Olivieri RUT: Firma: Nombre del establecimiento educacional: Dirección: Ciudad/Región: Liceo San Agustín de Concepción Tucapel 219, Concepción Concepción Dependencia: Part/Subvenc. Teléfono: Fax: secretaria@csac.cl Científico (a) asesor (a) Nombre: Especialidad: Institución: Teléfono: Dra. Patricia Gómez Vergara Biotecnología microalgal Universidad de Concepción. Informe si se ha desarrollado parte o toda la investigación en otras instituciones que no haya sido su establecimiento educacional. Toda la investigación se desarrolló en los laboratorios de Cultivo de Microalgas y Sistemática Molecular del Departamento de Botánica, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción. 1

2 INDICE. Resumen de la Investigación... 3 Introducción 4 Formulación del Problema.. 6 Materiales y metodología de investigación 7 Resultados Obtenidos 10 Análisis y discusión de resultados 12 Conclusiones 13 Bibliografía 14 Participación 15 Agradecimientos 16 2

3 RESUMEN DE LA INVESTIGACION. La Antártica es el continente más frío del mundo. Las exploraciones y descubrimientos en estos territorios se encuentran en estado de desarrollo, motivando su estudio a muchos científicos. El calentamiento global afecta en gran medida al continente blanco, ya que el aumento de temperatura de la tierra está derritiendo los hielos, acabando con el hábitat y el maravilloso paisaje de esta tierra. Las algas son los productores primarios en el ambiente marino, con un rol muy importante, sustentando a toda la trama alimenticia. Al ser fotosintéticas absorben CO2 del ambiente contribuyendo a disminuir el efecto invernadero producido por la acumulación de este gas en la atmósfera. Nuestra hipótesis se basa en que las algas antárticas son mas resistentes al estrés por frio que algas de ambientes más cálidos, contribuyendo así a la disminución de las cantidades de CO 2 en la Antártica, y así disminuir los efectos del calentamiento global en este ambiente extremo. En este trabajo se evaluó la capacidad de dos cepas de microalgas, una aislada de Concepción y la otra del territorio Antártico Chileno, de recuperarse y seguir creciendo luego de ser sometidas a estrés por frío. Las cepas fueron sometidas por 24 h a 3 tratamientos de frío: 4ºC, -20ºC y -80ºC. Luego se evaluó su crecimiento en el tiempo por medidas de la absorbancia del cultivo a 665nm (longitud de onda a la que absorbe la clorofila). Para determinar la densidad celular en células por ml se realizo una curva de calibración contando las células en una cámara Neubauer. Con los datos obtenidos se construyeron curvas de crecimiento para las dos cepas sometidas a los distintos tratamientos de frío y se compararon los resultados. En ambas cepas el crecimiento se vio favorecido luego del tratamiento de 4ºC. Las microalgas crecieron en menor cantidad luego de ser incubadas a -20ºC en comparación a los otros tratamientos, incluso al de -80ºC, tratamiento al que respondieron sorprendentemente bien. Los resultados obtenidos en la experimentación en base al crecimiento de las microalgas fueron en general exponenciales hasta el día 12, donde los mejores resultados se observaron a variaciones de temperaturas de 20 y 4 C. Se comprobó que ambas cepas presentan la misma tendencia de crecimiento pero que la cepa antártica tiene un crecimiento más lento que la cepa de Concepción. Se concluye que las algas verdes responden positivamente al estrés de temperatura, lo que permite su sobrevivencia en temperaturas extremas y así estarían contribuyendo en forma muy importante a la disminución de los efectos del calentamiento global. 3 Investigadores Chilenos camino a Patrio Hills. Foto: Inach 16 de mayo 2011

4 INTRODUCCION. La antártica es una masa continental que ocupa el polo sur de nuestro planeta, es el continente más frío y ventoso, y está cubierto por una espesa capa de hielo. Este territorio se encuentra a 66.5 de latitud Sur, con unos catorce millones de kilómetros de tierra aproximadamente. Su temperatura media es cercana a los -17 C. Cerca del 90% del agua dulce del planeta se encuentra en este continente, lo que la convierte en la mayor reserva hídrica del mundo. El continente antártico es un lugar único, donde la ciencia ocupa un espacio privilegiado, asemejándose a un inmenso laboratorio científico. Hoy en día, el principal problema que afecta a nuestro planeta es el calentamiento global, provocado por el aumento de CO 2, causante de los cambios de temperatura y acidificación de las aguas, situación que se ve reflejada mayoritariamente en el continente blanco. Según un estudio de la revista Science, este fenómeno natural ha sido probablemente el principal causante del aumento de las precipitaciones y disminución de la masa de hielos al interior de la antártica. En los últimos cincuenta años la temperatura atmosférica de la península aumento más de 2,5 C. Los investigadores encontraron que entre abril de 2002 y agosto de 2005, la placa de hielo antártica decreció anualmente 152 kilómetros cúbicos de hielo. Si este llegara a derretirse en su mayoría, el nivel del mar subiría en todo el mundo unos 55 metros. El aumento del deshielo podría tener un impacto a mayor escala si es grave y se mantiene en el tiempo. (Steffen. K, 2007) La temperatura normal de la Antártica ha ascendido en los últimos años por acción del fenómeno actual, dejando los -17 C. El continente antártico presenta una escasa vegetación de musgos, algas y líquenes. Dentro de la escasa diversidad de algas, se encuentran las clorófitas, algas verdes que presentan células con un núcleo bien definido, pared celular y se caracteriza por presencia de clorofila a y b, y la acumulación de almidón en el interior del cloroplasto. Existen en la Tierra hace más de 540 millones de años, siendo uno de los organismos más primitivos, sorpresivamente se han conservado de forma casi inalterada hasta nuestros días, gracias a su extraordinaria capacidad de supervivencia. La mayor parte de las algas habitan en agua dulce, suelos húmedos o epifitas. Las clorofilas son cosmopolitas, es decir, presentan una amplia distribución por todo el mundo, variando en sus ambientes. Las algas verdes son organismos fotosintéticos, es decir, realizan el proceso de captación de dióxido de carbono ambiental y lo transforman en oxígeno. Esta flora puede verse afectada por el calentamiento global de manera positiva o negativa, ya que cada especie reacciona de distinta manera a los cambios de temperatura en el ambiente. Por medio de fotosíntesis, estas algas al captar el CO 2 que existe en la atmósfera de manera excesiva, lo disminuirían, y por consiguiente aportarían a minimizar la 4

5 temperatura existente que está aumentando por acción del fenómeno anteriormente nombrado. Dentro de los ambientes acuáticos, el fitoplancton aporta de la misma forma a mitigar el efecto de calentamiento global que los organismos vegetales terrestres, los organismos vegetales marinos cumplen una tremenda función, produciendo la mitad del oxígeno que se respira, absorbiendo el dióxido de carbono y manteniendo a los peces del océano. La importancia del fitoplancton en los océanos reside también en su labor como primer eslabón de la red trófica o alimentaria marina. Sería el equivalente a la vegetación terrestre, ya que transforma elementos inorgánicos en energía y materia orgánica para que el resto pueda alimentarse. (Huertas. E, 2011) Al conocer estas características del continente blanco y saber cómo le está afectando el calentamiento global, nos lleva a pensar en cómo poder aportar a que este maravilloso espacio para la ciencia continúe por un largo tiempo y nos deslumbre con sus hallazgos. Un medio para conseguir esto son las algas verdes, mediante su estudio y experimentación podemos obtener los datos necesarios para responder a los problemas que le afectan. Como el calentamiento global causa una variación de temperatura aparte de las variaciones estaciónales, las algas verdes deberían recuperarse de estos cambios y si es así, a temperatura alta responder de manera adecuada. En este trabajo de experimentación se presenta una posible respuesta a nuestra pregunta, mediante el trabajo en laboratorio con algas verdes, análisis e interpretación de datos de cada muestra de algas y conclusiones que nos llevarán a lograrlo. Para esto, a las microalgas las someteremos a distintos grados de estrés, provocados por la variación de temperatura, y observaremos como se recupera en cada situación. Todo esto con el objetivo de simular los cambios de temperatura en la antártica, tanto los estacionales como los provocados por el calentamiento global, y ver cómo afecta en el crecimiento de las algas verdes, y así comprobar si disminuiría o aumentaría su ayuda a contrarrestar este cambio climático. 5

6 FORMULACION DEL PROBLEMA. Pregunta: Podrán las algas verdes antárticas resistir a una variación de temperatura y luego seguir con un crecimiento eficiente? Hipótesis: Las algas verdes antárticas responderán mejor que las algas de ambientes más cálidos al estrés por frio, por lo que estarían adaptadas para contribuir a disminuir el CO2 atmosférico y por ende el calentamiento global en la Antártica. Objetivos: Motivar al estudio de las microalgas y su rol en el calentamiento global ya que no se les ha dado el grado de importancia en su aporte a contrarrestar este fenómeno. Establecer una comparación de la resistencia al frío entre una microalga verde antártica y una aislada de la Octava Región. 6

7 MATERIALES Y METODOLOGIA DE INVESTIGACION. Tratamiento a algas verdes locales y antárticas: Se somete a las algas verdes a ciertos grados de estrés provocados por la variación de temperatura en 24 horas y luego se deja en una sala de cultivo para comprobar su viabilidad días después. 1.- Área de estudio: Ficología. 2.-Materiales: Cepa antártica (Aff.Chlorella), Cepa local (Aislada de la Laguna Grande de San Pedro, Octava Región), Espectrofotómetro con Cubetas de cuarzo, Maquinas refrigerantes (refrigerador, freezer y congelador), Tubos Eppendorf, Tubos de ensayo, Pipeta con rodillo, Pipetas plásticas, Micropipetas de μL con los tips correspondientes, Timer, Medio de cultivo Bristol, Matraz, Gradilla, Microscopio binocular, Cámara de Neubauer. 3.- Metodología 3.1.-Preparacion de la Muestra: Jueves 15 de Septiembre de 2011 La preparación de las muestras consiste en igualar la densidad celular en ambas cepas para que comiencen con la misma cantidad de células por ml. Para lograr esto, debimos tomar la absorbancia a 750 nm (Turbidez) y a 665 nm (Clorofila) de ambas cepas en el espectrofotómetro, ya que la absorbancia es directamente proporcional con la densidad celular: Primero, debemos tomar 4 ml de medio de cultivo Bristol, con una pipeta, y vertirlo en la Cubeta de cuarzo, especial para el espectrofotómetro, luego se debe ubicar esta cubeta en la primera celda de la máquina. Segundo, extraer 4 ml de cultivo del alga antártica con una pipeta de plástico, y vaciarlo en una segunda cubeta de cuarzo, poner esto en la celda dos del espectrofotómetro. Medir absorbancia a 750 nm y 665 nm. Tercero, retirar la cubeta con muestra de la máquina, y vaciarla en el frasco de desechos líquidos. Lavar el recipiente con agua para eliminar los residuos de la cepa. Cuarto, extraer 4mL de cultivo del alga local, con una pipeta de plástico diferente a la primera, y echarlo en la cubeta de cuarzo lavada. Poner esto en la segunda celda de la máquina. Medir Absorbancia a 750nm y 665 nm Resultados: 750 nm 665 nm Cepa antártica: 0,020 0,021 Cepa Local: 0,800 0,856 Para igualar las absorbancias debemos diluir cierta cantidad de cepa local en un determinado volumen de Bristol. Queremos obtener 20 ml de solución Cepa Local + Bristol con una turbidez de nm. Utilizamos una proporción Inversa como la siguiente: 7

8 20 ml x 0,020 = V x 0,8 Siendo V la cantidad de ml de cepa local. Despejamos V y nos da como resultado que es 0,5 ml de cepa local. Por lo tanto debemos agregar 19,5 ml de medio Bristol para completar los 20 ml de solución. Finalmente a un matraz esterilizado agregamos, con una pipeta, 19,5 ml de Bristol y, con otra pipeta, agregamos 0,5 ml de cepa local. Así nuestras dos cepas poseen la misma absorbancia, por lo tanto, la misma densidad celular Procedimiento del experimento Jueves 15 de Septiembre de 2011 En primer lugar, con una micropipeta extraemos 1,5 ml de cepa local para cada tubo Eppendorf rotulado con números del 1 al 4, luego cambiamos la punta del instrumento y repetimos el mismo procedimiento con la cepa antártica, con otros 4 tubos Eppendorf rotulados del 5 al 8. Pondremos a diferentes temperaturas cada tubo, por 24 horas, como se indica a continuación: Tubo eppendorf 1: Cepa Local a 20ºC en laboratorio con temperatura controlada Tubo eppendorf 2: Cepa Local a 4ºC en la parte baja de un refrigerador Tubo eppendorf 3: Cepa local a -20ºC en el freezer de un refrigerador Tubo eppendorf 4: Cepa local a -80ºC en un congelador (deep freezer) Tubo eppendorf 5: Cepa Antártica a 20ºC en laboratorio con temperatura controlada Tubo eppendorf 6: Cepa Antártica a 4ºC en la parte baja de un refrigerador Tubo eppendorf 7: Cepa Antártica a -20ºC en el freezer de un refrigerador Tubo eppendorf 4: Cepa local a -80ºC en un congelador (deep freezer) MUESTRAS Viernes 16 de Septiembre de horas después sacamos nuestras muestras de sus respectivos lugares y esperamos a que se descongelen por 20 min aprox. Mientras tanto, con una pipeta, vertimos 3 ml de medio Bristol en los 8 tubos de ensayo, cada uno rotulado para cada muestra. Una vez descongeladas las muestras, las homogenizamos agitándolas suavemente, tomamos 1 ml con una micropipeta y lo ponemos en los tubos de ensayo, cambiando la punta del instrumento por cada cepa. Estos 4 ml (cepa + medio de cultivo), se llevan a una sala de cultivo, con temperatura 18ºC ± 1ºC e intensidad luminosa de 17 μmol / m 2 seg, para iniciar con su crecimiento. Jueves 22 de Septiembre de Para saber la cantidad de células por ml, podemos crear una relación entre la absorbancia a 665 nm y la densidad celular, ya que son directamente proporcionales. Para ello debemos crear una curva de calibración, que servirá para extrapolar los datos 8

9 que obtendremos, tanto como de la cepa antártica como local porque son más o menos del mismo tamaño. La forma en que creamos la curva fue: Primero debemos hacer una disolución seriada de la cepa local, colocando 3 ml de Bristol en un tubo de ensayo rotulado con la letra A y agregando 2 ml de cepa local. Lo homogenizamos y luego extraemos 2 ml de solución del tubo A y lo vaciamos en un tubo de ensayo rotulado con la letra B. Se repiten los pasos con los tubos C y D. Teniendo los 4 tubos de ensayos A, B, C y D listos, procedemos a contar el número de celular en el microscopio óptico binocular a magnificación 40X con ayuda de una cámara de Neubauer. En esta cámara podemos contar el número de celular en un volumen de 0.004mm 3, ya que de largo y ancho tiene 0.2 mm y alto 0.1 mm por celda. Los resultados son 121; 35; 30 y 20 de los tubos A; B; C y D respectivamente. Una vez contadas las 4 muestras, calcularemos el número de células en 1 ml con una proporción directa. Por ejemplo si en 0,004 mm 3 hay 20 células, en 1000 mm 3 habría 5x10 6 células. Así calculamos las restantes. Luego las llevaremos al espectrofotómetro y mediremos su absorbancia a 665 nm. Hasta el momento los datos que tenemos son los siguientes: A665 Cels/ml A B C D 0, Tendiendo estos datos, crearemos un gráfico con la absorbancia a 665nm en el eje de las abscisas y el número de células en el eje de las ordenadas. A los puntos que se crean, le crearemos la ecuación de la recta (línea de tendencia) que los delimita, pasando a ser esta la curva de calibración. Esta ecuación es y= x Por lo tanto, sabiendo la absorbancia de nuestra muestra, podemos ingresarla a la ecuación y saber cuántas células por ml hay en el cultivo. Después de 6 días de crecimiento, se realiza la primera medición de absorbancia a 665 nm de todas las muestras. Devolver las muestras a sus respectivos tubos y volver a ponerlos en la sala de cultivo. También se repite el paso anterior a los 10 y 12 días de crecimiento. Los datos obtenidos de las mediciones se ingresan a la formula hecha a partir de la curva de calibración y se extrapolan en un gráfico que tiene el número de días en el eje de las abscisas y el número de células por ml en el eje de las ordenadas. A partir de lo anterior, tenemos el número de células por ml de cada día, tratamiento de temperatura y cepa para crear gráficos comparativos entre estas. 9

10 Cels/ml RESULTADOS OBTENIDOS. Grafico 1: Curva de Crecimiento cepa Local Local 20ºC Local 4ºC Local -20ºC Local - 80ºC Dias Días de Crecimiento Local 20ºC cels/ml cels/ml cels/ml cels/ml Local 4ºC cels/ml cels/ml cels/ml cels/ml Local -20ºC cels/ml cels/ml cels/ml cels/ml Local - 80ºC cels/ml cels/ml cels/ml cels/ml Según el grafico 1: Ninguno de los cuatro tratamientos mata en su totalidad a los cultivos. Posterior al tratamiento térmico, el crecimiento de las algas verdes locales fue exponencial (en el tratamiento de 20, 4 y -80ºC), a diferencia del tratamiento a -20ºC que comienza a disminuir su velocidad de crecimiento entre el día diez y doce de cultivo. La temperatura de tratamiento no es directamente proporcional con el número de células, ya que el tratamiento de -80ºC obtuvo un mayor número de células en todas las mediciones que el tratamiento de -20ºC. Al tratamiento de 4ºC obtuvo la mayor densidad celular en menor tiempo, que fue de cels/ml. 10

11 Cels/ml Grafico 2: Curva de Crecimiento cepa Antártica Antártica 20ºC Antártica 4ºC Antártica -20ºC Antártica -80ºC Dias Días de Crecimiento Antártica 20ºC cels/ml cels/ml cels/ml cels/ml Antártica 4ºC cels/ml cels/ml cels/ml cels/ml Antártica -20ºC cels/ml cels/ml cels/ml cels/ml Antártica -80ºC cels/ml cels/ml cels/ml cels/ml Según el grafico 2: Ninguno de los cuatro tratamientos mata en su totalidad a los cultivos El crecimiento posterior a los cuatro tratamientos fue exponencial. La temperatura de tratamiento no es directamente proporcional con el número de células, ya que el tratamiento de -80ºC obtuvo un mayor número de células en todas las mediciones que el tratamiento de -20ºC La muestra del tratamiento a 20ºC a los seis días es muy similar en densidad celular al tratamiento de -80ºC, y luego a los doce días es muy cercano al número de células de la cepa del tratamiento a 4ºC. La densidad más alta se dio en el tratamiento a 20ºC con cells/ml Comparación entre cepa antártica y local: En todas las mediciones, la cepa que mayor crecimiento celular presentó, fue la cepa local. En ambos casos, la muestra del tratamiento de -80ºC supero en densidad celular a la cepa del tratamiento de -20ºC. 11

12 ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. A partir de los gráficos anteriores podemos deducir que: - El alga Antártica responde favorablemente al tratamiento de temperatura extrema, esto nos comprueba su adaptabilidad a medios extremos - Las algas estudiadas tienen una amplia resistencia a diversas variaciones de temperaturas. - En el gráfico de la cepa local, se aprecia una disminución en la velocidad de crecimiento a temperatura de -80 C (entre el día 10 y día 12) a diferencia de la antártica que continua exponencialmente hasta el día 12. Esto podría deberse a que la población está llegando a su capacidad carga, ya que al haber estado sometidas a un estrés necesito más nutrientes para sobrellevar este cambio. - Las cepas del género Chlorella, podrían tener una característica que les permita adaptarse a temperaturas extremas. - Se valida que estas algas verdes también aportarían a frenar el calentamiento global, ya que a temperaturas altas (20 y 4ºC) el número de células por ml es mayor, lo que se traduce como una mayor actividad fotosintética, captando más CO 2. - Los cambios de temperatura a 20 y 4ºC provocaron que las microalgas verdes del género Chlorella sobrevivieran y continuaran creciendo exponencialmente, lo que valida nuestra hipótesis diciendo que el microalga verde antártica crece favorablemente a las variaciones de temperaturas altas. -Los datos obtenidos en el tratamiento de -80ºC fueron más positivos que los del tratamiento de -20ºC, lo que nos permitiría afirmar, que estas algas incluso pueden resisitir temperaturas inferiores a la temperatura media de la antártica (-17ºC). -La proyección de nuestra investigación es la interrogante de qué manera utilizan los nutrientes las algas para poder sobrellevar el estrés causado por la variación de temperatura? 12

13 CONCLUSIONES. Las cepas de Chlorella son capaces de reactivarse luego de una variación drástica de temperatura, continuando con su crecimiento a una temperatura estándar (20 C). La microalga antártica puede crecer luego de un tratamiento de 4ºC, por lo tanto se deduce que sobrevivirían al cambio de temperatura causado por el calentamiento global, e incluso mejoraría en comparación al tratamiento de 20 C. Se infiere que la cepa local se podría adaptar exitosamente en el continente antártico a pesar de las bajas temperaturas que este presenta. Las microalgas fotosintéticas disminuyen el CO 2 presente en el agua, regulando el ph y con ello favoreciendo la vida acuática. El calentamiento global produce un aumento de temperatura, por lo que las microalgas de género Chlorella resistirían temperaturas extremas y continuarían con un crecimiento óptimo, ayudando a que la concentración de CO 2 disminuya y así no afecte mayormente al continente antártico 13

14 BIBLIOGRAFIA. Sitios web: Bioma Antártico, Wikipedia enciclopedia libre. Articulo principal: Flora antártica; conclusión. 29 de junio, [En línea]. [Consulta: 02 de septiembre de 2011] La antártica se derrite y es la nueva amenaza mundial. 20 de mayo [En línea]. (Consulta: 03 de septiembre de 2011.) Península antártica: 85% de los glaciares se redujeron por el calentamiento global. 22 de mayo [En línea]. [Consulta: 04 de septiembre de 2011] El portal de la ciencia y la tecnología en español. Detectada una importante pérdida en la masa de hielo antártico. [En línea] Educación Hielos. 31 de mayo [En línea] [Consulta: 04 de septiembre de 2011.] Ecología verde, desarrollo sostenible para un mundo mejor. Medio ambiente: La Antártida sufre consecuencias del calentamiento global. 17 de mayo [En línea] [Consulta: 07 de septiembre de 2011] Biodiversidad y taxonomía de plantas criptógamas. Chlorophyta. [En línea] [Consulta: 07 de septiembre de 2011.] Investigación Chlorella. [En línea] [Consulta: 07 de septiembre de 2011] Biodiversidad. Explican importancia del fitoplancton para la vida, por Stephen Leady. 02 de agosto [En línea] [Consulta: 07 de septiembre de 2011] El Fitoplancton en mar abierto, más vulnerable al cambio de temperatura. 17 de mayo 2011 [En línea] [Consulta: 08 de septiembre de 2011] 14

15 PARTICIPACION. María Paz Soto Vergara: Experimentación, introducción, resultados obtenidos y respectivo análisis. Objetivos, hipótesis y conclusión. Desarrollo y redacción del proyecto en general. Daniel Figueroa Jerez: Experimentación. Metodología, introducción, análisis de resultados y conclusión. Desarrollo y redacción del proyecto en general. Eugenio Nicolás Sanhueza Monsalves: Experimentación. Metodología, Análisis de resultados, registro fotográfico. Desarrollo y redacción del proyecto en general. Profesora Juana Verónica Torrejón: Ayuda y explicaciones antes y durante el proyecto. Dra. Patricia Gómez: Ayuda y guía en realización del experimento. Indicaciones previas y durante el experimento. 15

16 AGRADECIMIENTOS. Como finalización de este trabajo, queremos agradecer especialmente a la Doctora Patricia Gómez, Bioquímico, Doctora en Ciencias Biológicas área Botánica, quien nos ayudó y guió en este experimento, por su tiempo y paciencia, siendo un gran apoyo en nuestro proyecto. También, agradecer a nuestra Profesora Verónica Torrejón, quien nos motivó y alentó para seguir con el proyecto, cuidándonos y apoyándonos en todo momento. Agradecemos a nuestro colegio, que nos apoyó y nos facilitó materiales, uso del laboratorio, y nos permitió salir en horario escolar. Agradecer a la Universidad de Concepción, por facilitar sus dependencias para la realización de este proyecto. Finalmente, un agradecimiento a las familias de cada uno de los participantes, por el apoyo incondicional. 16