Protocolo para la toma, conservación y transporte de muestras de tejidos vegetales Muestras Compuestas (Hojas).

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1 Protocolo para la toma, conservación y transporte de muestras de tejidos vegetales Muestras Compuestas (Hojas). Ing. Agr. Lorena Luna & Lic. Natalia Nikichuk. Centro de Bioservicios Forestales (CEBIOF) Programa Nacional forestal INIA Estación Experimental del Norte Ruta 5 km 386, Tacuarembó Tel : int Cel: Objetivo. El objetivo del CEBIOF es ofrecer al sector forestal asistencia en el control de trazabilidad clonal de sus plantaciones forestales, en todas las etapas de su producción, certificando su identidad desde vivero hasta la plantación. A. Extracción de ADN (muestras de hoja o cambium) B. Genotipado por técnicas de microsatélites C. Análisis bioinformático comparativo entre las muestras enviadas (plantines, plantas madres, árboles adultos) D. Registro de los nuevos clones en el banco de ADN clonal E. Entrega de un informe final

2 Análisis: Muestra Compuesta Introducción El objetivo principal de las colecciones de tejidos es almacenar material biológico del cual se puedan extraer moléculas útiles como ADN, ARN, proteínas o enzimas para su análisis e investigación, mediante el uso de técnicas moleculares. Conservar la integridad de estas moléculas es el principal interés de los diferentes métodos de obtención (toma de muestras), preservación y transporte de tejido biológico con fines de investigación. Estas recomendaciones no son obligatorias y entendemos que no siempre hay tejido a campo con éstas características ideales (como si suele suceder a nivel de vivero), pero la calidad del ADN obtenido de éstas muestras como el análisis y el tratamiento dentro del laboratorio mejora en gran medida si se tienen en cuenta la mayoría de ellas. Materiales: - Una conservadora de tamaño apropiado según la cantidad de material a transportar*. - Sobres de papel*. - Silica gel*. - Tijeras o pinza pequeña.* - Alcohol 95%.* - Servilletas o franela.* - Marcador indeleble de punta fina.* * Estos materiales serán provistos por el laboratorio en caso de no contar con ellos. Procedimiento: 1) Previo a la colecta se debe observar y evaluar la condición de los distintos árboles o plantines de los cuales se tomaran las correspondientes muestras. Es conveniente elegir hojas que tengan la menor cantidad de patógenos como puede ser por ejemplo Mycosphaerella, Roya, picaduras de insectos, suciedad o presencia de cualquier otro síntoma de enfermedad. Se recomienda en lo posible que la colecta de los distintos materiales sea llevada a cabo por la misma persona para evitar errores de manipuleo o rotulación.

3 2) Rotular los sobres cuidadosamente con un marcador indeleble, asegurarse que la escritura sea clara y legible. Chequear que la identificación sea la correcta. 3) Elegir en lo posible hojas juveniles ya que el tejido mas joven es el material que brinda los mejores resultados en cuanto a cantidad y calidad de ADN extraído, debido a que en esta etapa el material se encuentra en un proceso activo de división celular y con menos impurezas y contaminantes que a veces están presentes en hojas adultas y pueden ser coextraídos junto con el ADN y afectar su posterior amplificación por PCR. Entre los compuestos más comunes que pueden inhibir la amplificación se encuentran: polifenoles, polisacáridos, metabolitos secundarios, antocianinas, lignina, etc. (Kubista et al., 2006) IMPORTANTE!!! Las hojas deben sí o sí ser de éste tamaño aproximadamente: No enviar brotes pequeños!! Para éste tipo de análisis se necesita una hoja sana y de tamaño aproximado al de la foto, de modo que podamos usar un sacabocado para obtener una porción estándar de cada hoja para que haya la misma cantidad de ADN en el tubo de cada una de las hojitas que componen la muestra compuesta. No puede haber más ADN de una y menos de las demás porque eso desbalancea toda la reacción. A igual tamaño de tejido de partida= igual cantidad de ADN de cada hoja adentro del tubo.

4 En caso de no haber tejido nuevo disponible elegir hojas adultas sanas y lo mas tiernas posible. 4) En el caso que varias muestras de hojas se envíen en un mismo sobre, colocar solo una hoja para cada planta muestreada, sin estrujarlo o traumatizarlo ya que esto causa que las hojas se necrosen. Asegurarse de que no se arrollen o peguen entre sí, y que queden correctamente cubiertas por la silica gel que es lo que impedirá la descomposición del tejido. 5) En el caso de que cada una de las plantas correspondiente a una muestra compuesta se coloque de forma individual en un sobre de farmacia, continuar con las indicaciones anteriormente mencionadas, con la diferencia de que se coloca una hoja por sobrecito (sin necesidad de rotular) y luego cada uno de ellas en un sobre de mayor tamaño donde se indica la rotulación dada por la empresas. Cuidar de que los mismos queden bien cerrados.

5 6) Para muestrear el siguiente árbol o plantín es necesario limpiar los instrumentos como pinzas o tijeras con una servilleta o tela impregnada en alcohol 95%, de modo de evitar cualquier tipo de contaminación entre las mismas. 7) Enseguida de la colecta se deben colocar los sobres bien cerrados en la conservadora. Sellar la tapa de la conservadora con cinta de embalar para que no se abra durante el transporte. 8) Adjuntar los datos de envío a la conservadora. 9) Despachar la conservadora y notificar al mail: los datos del envío (empresa elegida, horario en que fue despachada, número de remito, etc.) Adjuntar también la planilla de colecta de datos completa. # 10) En caso de no enviar la conservadora enseguida, mantener a temperatura ambiente hasta el momento del envío, ya que en el caso de silica gel no es necesario refrigerarla. # La planilla de colecta se adjunta previamente en un mail o se entrega en el momento del muestreo.

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