Microscopía: pasado y presente. M. Dolores Gómez

Transcripción

1 Microscopía: pasado y presente M. Dolores Gómez

2 Ramón y Cajal

3 El origen del microscopio óptico da lugar al origen de la biología celular Célula animal Célula vegetal

4 SIGLO XVI-XVII A finales del siglo XVI se construye el primer microscopio óptico (hermanos Jansseen)

5 Hooke escribe la primera obra de carácter científico en la que se exponen sus descubrimientos a través del microscopio.

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7 En 1674 Leeuwenhoek descubre los protozoos y posteriormente las bacterias.

8 SIGLO XVIII Durante el siglo XVIII se introdujeron mejores mecánicas en el microscopio que aumentaron su facilidad de uso aunque no se desarrollaron mejoras ópticas.

9 Siglo XIX

10 SIGLO XIX Schleiden y Schwann proponen la teoría celular: célula nucleada es la unidad estructural y funcional de las plantas y animales. Brown describre el núcleo celular en orquídeas. Kolliker descubre mitocondrias en células musculares. Flemming describió el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis de células animales. Zeiss construye unas lentes que permiten alcanzar el límite teórico de resolución que permiten los microscopios ópticos. Golgi describe el aparato de Golgi impregnando células con nitrato de plata.

11 SIGLO XX

12 TEM SEM SIGLO XX En 1931 se fabrica por primera vez un Microscopio Electrónico de Transmisión y, en 1942, se desarrolla el Microscopio Electrónico de Barrido.

13 R = 0,61 λ / AN Fotones R= 200 nm Electrones R= 0.2 nm

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15 Durante el siglo XX se desarrollan e incorporan al microscopio los llamados métodos de contraste : CAMPO OSCURO CONTRASTE DE FASES CONTRASTE INTERFERENCIAL (Nomarski) FLUORESCENCIA

16 MÉTODOS DE CONTRASTE CAMPO OSCURO CONTRASTE DE FASES CONTRASTE INTERFERENCIAL

17 MICROSCOPÍO DE FLUORESCENCIA

18 QUÉ ES FLUORESCENCIA? Espectro de la luz ULTRAVIOLETA Visible (entre 380 y 760 nm) INFRARROJOS

19 Luz de excitación FLUOROCROMOS Luz de emisión

20 Espectro de la luz I ULTRAVIOLETA Visible (entre 380 y 760 nm) INFRARROJOS Fundamento del Comportamiento microscopio de de un fluorescencia fluorocromo Espectro de excitación/emisión λ

21 Se desarrollan métodos de histo/citoquímica, inmunocitoquímica, hibridaciones in situ de ácidos nucleicos,

22 HISTO/CITOQUÍMICA sustrato??? Reacción química Precipitado coloreado

23 Acumulación de hierro en las células tras un hematoma en el cerebro Glucógeno almacenado en el hígado Células de la cola de un tritón regenerándose

24 Tubulina en fibroblastos INMUNOHISTOQUÍMICA Localización de una caspasa (Xenopu

25 HIBRIDACIÓN IN SITU DE ÁCIDOS NUCLEICOS

26 FLUOROCROMO FISH

27 DIGOXIGENINA/BIOTI NA

28 MICRODISECCIÓN POR LÁSER 1 3 2

29 GENÓMICA PROTEÓMICA

30 SIGLO XX-SIGLO XXI ENSAYOS EN CÉLULA VIVA

31 EL MICROSCOPIO CONFOCAL JUNTO CON FLUOROCROMOS QUE TIÑEN CÉLULAS VIVAS Y LAS PROTEÍNAS FLUORESCENTES POSIBILITAN LA APARICIÓN DE NUEVAS TÉCNICAS APLICABLES EN CÉLULA VIVAS.

32 MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA EPI-FLUORESCENCIA ESPEJO DICROICO LUZ INCIDENTE (microscopio de fluorecencia) Lámparas LUZ TRANSMITIDA (microscopio óptico convencional)

33 MICROSCOPIO CONFOCAL Para excitar la muestra utilizamos un láser: mayor excitación y, por tanto, emisión. El láser barre la muestra y nosotros observamos sólo la fluorescencia emitida por un plano: mayor resolución y calidad en las imágenes. Los diferentes planos pueden sumarse para obtener imágenes en 3D. No es necesario la utilización de secciones de tejido.

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35 Microscopio de fluorescencia convencional Microscopio confocal

36 PROTEÍNAS FLUORESCENTES GFP DsRed

37 GFP DsRed Aequorea victoria Discosoma striata

38 La utilización de proteínas fluorescentes requiere la transformación genética de organismos Drosophila C. elegans Ratones Arabidopsis

39 Para qué podemos utilizar las proteínas fluorescentes?

40 Marcadores celulares/ Expresión génica

41 Marcador de órganos subcelulares

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43 Para diferenciar diferentes poblaciones celulares GFP DsRed

44 Localización de proteínas

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46 FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)

47 FRET (fluorescence resonance energy transfer)

48 Ensayos de complementación para determinar la interacción entre proteínas Bimolecular fluorescence complementation (BiFC)

49 Y HASTA AQUÍ EL FINAL DEL PRESENTE MAÑANA ES FUTURO