CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN DE GALLO: UNA ALTERNATIVA PARA LA RECUPERACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LA GALLINA DE RAZA MURCIANA.

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1 CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN DE GALLO: UNA ALTERNATIVA PARA LA RECUPERACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LA GALLINA DE RAZA MURCIANA. N. Duchi Duchi, L. Almela Veracruz, B. Peinado Ramón, A. Poto Remacha Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA) La Alberca, Murcia. España, nelduchi@yahoo.com RESUMEN La criopreservación de semen de gallo (conservación ex situ) constituye una técnica de reproducción asistida. Se utilizó 6 gallos de raza murciana de 1,5 a 2,0 años de edad como donantes de semen, previo entrenamiento mediante masaje dorso abdominal la recolección se realizó en Diluyente Lake & Stewart mas glicerol al 10,83% (v/v) a 15º C (1:10 semen:diluyente); posteriormente se colocó el contenido en refrigeración a 4ºC/1h; al término se empajuelo, sellado y criocongelación automática lenta (Roy Hammersted). Los resultados obtenidos fueron volumen 0,55±0,07ml y concentración 4,55x10 9 ±0,28spz/ml (Cámara de Makler), los valores de motilidad 3,57±0,14 y porcentaje de espermatozoides vivos 62,73±5,66% obtenidos al descongelar el semen (a 4º C por 7 min.) son bajos comparados con los valores de 4,04±0,11 y 82,63±3,21% de motilidad y sobrevivencia en semen fresco, en tanto el porcentaje de espermatozoides con daños en la membrana citoplasmática fue 68,50±3,50% para semen descongelado frente al 12,66±2,66% en semen fresco. En conclusión, estos datos de congelación de semen de gallo indican que la técnica puede ser suficiente para un banco de germoplasma, pero que se necesita mejorar los resultados para una mayor eficiencia de la congelación y descongelación. Palabras clave: Gallina murciana, semen de gallo, criocongelación, glicerol, diluyente INTRODUCCIÓN La criopreservación de gametos es una alternativa de conservación ex situ de los recursos genéticos animales en riesgo o peligro de extinción. La gallina Murciana es una raza autóctona de la región de Murcia cuya población hace algunos años atrás no estuvo lo suficientemente ajustada como para reproducirse in situ, y el número reducido de animales en un determinado momento llego al extremo de ser condenada a la desaparición. Posteriormente proyectos de investigación y estudios de caracterización racial sobre esta raza han hecho que se diseñe mecanismos para su completa recuperación y conservación mediante la selección de núcleos genéticos y crianza extensiva con avicultores de la huerta. Poto et al (1998), Martínez et al (1998). La criopreservación tiene por finalidad mantener la viabilidad espermática durante un ciclo de congelación, decongelación y almacenamiento indefinido en nitrógeno líquido. Pioneros en la reproducción avícola asistida fueron Burrows y Quinn (1937), quienes desarrollaron el método de masaje dorso abdominal en gallos para la extracción y recolección de semen. La fácil recolección de semen y el procesamiento, ha permitido su utilización de forma extensiva en la inseminación artificial (IA) con semen fresco Sexton (1979), Lake (1986) y Donoghue y Wishart (2000). El semen descongelado tiene baja fertilidad comparado con el semen fresco y/o refrigerado. Este estudio tuvo como objetivo congelar gametos de gallo de raza murciana como una alternativa de conservación ex situ y su posterior uso en programas de inseminación artificial para la recuperación y conservación de esta raza.

2 MATERIALES Y METODOS Animales experimentales Se utilizaron 6 gallos de raza murciana entre 1,5 a 2,0 años de edad como donantes de semen, fueron colocados en jaulas metálicas de 70x70x90 cm provista de bebedero automático y comedero tipo tolva, el alimento y agua fueron suministrados a voluntad; además estuvieron expuestos a condiciones medioambientales naturales. El ensayo se llevo a cabo durante cuatro meses. Recolección de semen y evaluación Para la recolección de semen se requirió de dos técnicos entrenados, uno se encargó de sujetar al animal y el otro realizó la recolección efectiva de semen. Se obtuvo un total de 96 eyaculados efectivos. El gallo fue colocado en posición supino ventral sobre un soporte y enseguida se le realizó el acto de masaje dorsal con proyección hacia la rabadilla y cola de acuerdo al método descrito en detalle por Burrows y Quinn (1937), enseguida a esto el operador con los dedos pulgar e índice de la mano derecha masajeo la cloaca hasta proyectar la salida de los cuerpos fálicos consiguiéndose así la expulsión de liquido blanquecino o semen, el cual fue recolectado en un tubo de ensayo conteniendo diluyente (imagen 1). Los eyaculados inmediatamente fueron analizados con respecto a su volumen, concentración, motilidad, porcentaje subjetivo de sobrevivencia y porcentaje de espermatozoides con normalidad y anormalidades en su membrana celular. El volumen fue determinado por volumetría, para la concentración se preparó una relación de 1:100, 100 µl de semen y 900 µl de solución de gluteraldehido, de esta dilución 10 µl de semen diluido en gluteraldehido se transfirió a la cámara de Makler para el respectivo conteo bajo el microscopio (200x), la motilidad espermática fue clasificada utilizando la escala de 0 5 (0 = motilidad nula, 1= movimiento sin motilidad progresiva, 2 = motilidad progresiva lenta, 3= movimientos laterales acompañados de motilidad progresiva lenta, 4= motilidad progresiva rápida y 5= motilidad progresiva muy rápida); el porcentaje de vitalidad fue analizada mediante percepción sensorial subjetiva; y para determinar el daño de la membrana celular se realizó una extensión vital sobre un porta objetos con una solución de eosina nigrosina y observado bajo el microscopio (400x). Criopreservación del semen Los eyaculados fueron recogidos en forma individual en 0,9 ml diluyente Lake & Stewart (1978), (100 mm de glutamato de sodio, 44 mm de fructosa, 4 mm de acetato de magnesio, 51 mm de acetato de potasio y 30 µm de polivinilpirrolidona) más 10,83% (v/v) de glicerol, posteriormente se ajusta la relación 1:10 de semen:diluyente más glicerol, se homogenizan los eyaculados hasta obtener un volumen total, luego se colocó la muestra en una cámara de enfriamiento a 4ºC para que se estabilice la solución por 1 hora aproximadamente, al término de este tiempo se procede a embasar en pajillas de 0,25 ml, se sella con alcohol polivílico en polvo, siempre manteniendo a la misma temperatura. Se puso en marcha el Criocongelador SYS LAB hasta que la temperatura de la cámara llegara a 4ºC para enseguida transferir a su interior la gradilla con las pajuelas. Para el proceso de congelación se siguió la curva de congelación lenta propuesta por Roy Hammersted (1992). Finalmente las muestras fueron introducidas en nitrógeno liquido y almacenadas. Descongelación del semen

3 Para la valoración del semen descongelado en cuanto a las variables de motilidad, porcentaje de vitalidad y evaluación de daños en la membrana celular, se procedió a la descongelación de las pajillas en cámara fría a 4ºC por 7 min. El semen descongelado fue transferido a tubos de ensayo y mantenidos a la misma temperatura durante la evaluación. RESULTADOS En el cuadro 1 se reporta los resultados para cada una de las variables motivo de estudio, observándose una variación porcentual de todos los parámetros obtenidos al evaluar semen fresco y descongelado, a simple vista los datos de volumen y concentración espermática fueron de 0,55±0,07ml y 4,55x10 9 ±0,28 de espermatozoides /ml de semen respectivamente, valores que dan una apreciación singular si comparamos con volúmenes y concentraciones obtenidas en mamíferos domésticos. CUADRO 1: Valoración espermática del semen fresco y descongelado de gallo de raza murciana Semen Fresco Variable Unid. Promedio EE Volumen ml 0,55 0,07 Concentración x10 9 /ml 4,55 0,28 Motilidad % 4,04 0,11 Vitalidad % 82,63 3,21 SPZ sin daño de membrana % 87,33 2,66 SPZ con daño de membrana % 12,67 2,66 Semen Descongelado Motilidad % 3,57 0,14 Vitalidad % 62,73 5,66 SPZ sin daño de membrana % 31,50 3,50 SPZ con daño de membrana % 68,50 3,50 EE= Error estándar, SPZ= Espermatozoide DISCUSIÓN Estos datos preliminares de valoración de la calidad de semen fresco y descongelado demuestran que en el proceso de congelación y descongelación afectan a la motilidad progresiva observándose el valor de 3,57±0,14 frente al valor de 4,04±0,11 del semen fresco, el porcentaje subjetivo de células vivas vistas al microscopio fue de 62,73 ±5,66% para el semen descongelado cuyo valor es bajo comparado con el 82,63±3,21% del semen fresco, y los valores que quizá son de mayor importancia técnica son los referentes a la integridad del espermatozoide es decir las células que no han sufrido daños en su membrana celular (células que no se tiñen), se obtuvo el 31,50±3,50% en el material descongelado frente al valor 87,33±3,21% de semen fresco, la disminución de viabilidad espermática se deprime en 56 puntos porcentuales.

4 CONCLUSIONES Estos datos de congelación de semen de gallo indican que la técnica puede ser suficiente para un banco de germoplasma, pero que se necesita mejorar los resultados para una mayor eficiencia de la congelación y descongelación. BIBLIOGRAFÍA Burrows, W. H., and J. P. Quinn, The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Sci. 16: Donoghue, A. m. and G. J. Wishart Storage of poultry semen. Anim. Reprod. Scie. 62: FAO Segundo documento de líneas directrices para la elaboración de planes generales de gestión de los recursos genéticos de animales de granja, gestión de pequeñas poblaciones en peligro, Italia. Hammerstedt, R.H., and J.K. Graham Criopreservation of poultry sperm: The enigma of glycerol. Cryobiology 29:26-38 Lake, P. E., The history and future of the cryopreservation of avian germ plasm. Poultry Sci. 65:1 5. Lake, P. E., and J. M. Stewart, Preservation of fowl semen in liquid nitrogen an improved method. Br. Poult. Sci. 19: Martínez, M., Peinado, B., Almarcha, C., Poto, A La gallina de raza Murciana: Creación y situación actual. El Arca. SERGA, 2: Poto, A., Peinado, B., Martínez, M Medidas zoométricas de los ejemplares encontrados de gallina Murciana. II Congreso Nacional de la Sociedad Española para los Recursos Genéticos Animales. Póster. Palma de Mallorca de diciembre. Sexton, T. J., Preservation of poultry semen. A review. Pages in: Animal Reproduction Science. BARC Symposium No. 3. H. Hawk, ed. USDA/ARS/BARC, Beltsville, MD. Imagen 1. Extracción de semen a un gallo Murciano

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