EFECTOS INTERACTIVOS DEL STRESS TERMICO, ZINC Y VITAMINAS E Y C SOBRE LA VIABILIDAD DE LA CELULA ESPERMATICA DEL VERRACO

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1 Proyecto Nº SC EFECTOS INTERACTIVOS DEL STRESS TERMICO, ZINC Y VITAMINAS E Y C SOBRE LA VIABILIDAD DE LA CELULA ESPERMATICA DEL VERRACO Equipo Investigador: Fernando Sáiz Cidoncha (L.Q.) Juan Riopérez García del Rincón (Dr. Vet.) José Luis Millán Millán (L.V.) María Luisa Rodríguez Membibre (Dra. Vet.) Manuel Serrano Sánchez (L.V.) Pilar Marigorta del Val (L.Q.) Equivalente de jornada completa: 2,70 Centro de Investigación: Centro de Investigación y Tecnología. (SGIT). INIA. Duración: Coste: Enero Diciembre 1997 Miles de pesetas: Financiación INIA 100% 1

2 PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS La deficiencia de ciertos nutrientes en la alimentación del verraco afecta directamente al desarrollo de la reproducción lo que explica la gran variabilidad de resultados que existe en la bibliografía especializada. Parece evidente la influencia que tienen la nutrición y las condiciones medioambientales sobre la fertilidad del verraco y concretamente sobre la espermatogénesis. Las razas porcinas autóctonas actualmente explotadas en España son potencialmente prolíficas. Sin embargo, el sistema intensivo de reproducción y determinados estados fisiopatológicos exigen una suplementación nutritiva adecuada que permita que el semental desarrolle todo su potencial reproductivo, maximizando los resultados de fertilidad, fecundidad y prolificidad del semen fresco y conservado. Se pretenden estudiar los efectos sinérgicos del zinc, vitaminas antioxidantes (ácido ascórbico y d-α-tocoferol) sobre la producción y calidad espermática del semen de verraco para tratar de paliar la infertilidad estacional durante los meses estivales debida a un stress térmico. Este proyecto se basa en la acción que presentan dichos aditivos sobre el metabolismo lipídico en general y sobre la composición fosfolipídica de la membrana espermática en particular. Un reforzamiento sustancial de esta membrana daría lugar a una célula espermática más resistente con la subsecuente mejora en la viabilidad del esperma y un paralelo aumento en los niveles de fertilidad, además de un incremento de la resistencia de dichas células al stress térmico-osmótico a que son sometidas durante los procesos de congelación y refrigeración. El ión zinc se ha revelado recientemente como un agente que reduce el efecto negativo del stress térmico sobre la producción espermática. La función principal del ácido ascórbico es la de reconstituir la vitamina E y regular la tasa de glucocorticoides, estando ambas funciones estrechamente ligadas al stress y a conferir una mayor resistencia a temperaturas extremas. En términos económico-productivos, los efectos positivos de estos tratamientos se reflejarían en un incremento de fertilidad y fecundidad en la piara. El aumento del número de dosis seminales por verraco reduciría considerablemente los gastos de manejo y alimentación al disminuir la repetición de estros y los períodos improductivos de las hembras y al necesitar un menor número de reproductores para inseminar al mismo número de cerdas. Uno de los problemas más acuciantes en nuestras explotaciones porcinas es la elevada temperatura que soportan los verracos en los meses de verano que dan lugar a un significativo descenso de fertilidad y otro problema concomitante sería la baja fertilidad de las dosis seminales conservadas por congelación después de descongelarlas. El previsible reforzamiento de la membrana mediante la adición de nutrientes a las dietas aumentaría la resistencia de las células al tratamiento agresivo que supone la congelación con un incremento en la capacidad fecundante de dicho esperma. Para la realización de dicho proyecto se han utilizados 9 verracos Large White jóvenes, alojados y entrenados reproductivamente el Area de Reproducción Animal del INIA. Ninguno de estos animales tuvo dificultad en saltar sobre la hembra y todos han proporcionado un semen de elevada calidad. 1

3 Se alimentaron los verracos (2.5 kg/día) con tres piensos distintos: 1) Control. 2) Adicionado con Zinc-metionina (45 mg/kg) y Vitamina C (100 mg/kg) y 3) Adicionado con zinc-metionina (45 mg/kg) y Vitamina E (200 mg/kg). Se realizó la experiencia en el período estival (Temp. media= 25.5º C) e invernal (Temp. media= 12.6º C). Se recogieron semanalmente los eyaculados de todos los verracos por el método de la mano enguantada, evaluando en el semen los siguientes parámetros: Volumen (fracciones rica y pobre), Concentración (spz x 10 9 x mm 3 ), Espermatozoides totales (spz x 10 9 ), % de motilidad, % de acrosomas normales, % de colas en látigo, % gotas citoplásmicas proximales y % de gotas citoplásmicas distales en lo que se refiere a los parámetros morfológicos. Se evaluó, para determinar la calidad bioquímica del semen, la actividad de Aspartato Amino Transferasa tras un choque frío del semen, la composición fosfolipídica de la membrana (fosfolípidos totales y porcentaje de fosfatidil etanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidil colina, fosfatidil serina, lisofosfatidil colina y esfingomielina), la concentración de zinc, calcio libre, calcio protéico, proteína total y proteína hidroprecipitable en el plasma seminal. También se llevaron a cabo la evaluación del estado de decondensación de la cromatina nuclear tras congelar-descongelar algunas muestras de estos eyaculados. Se pretende conocer, inicialmente, el efecto del stress térmico sobre la calidad morfológica y bioquímica del semen de verraco y el efecto de la adición de estas vitaminas antioxidantes potenciadas con zinc-metionina sobre estas variaciones. Es bien conocida la problemática actual de la congelación de semen de verraco en cuanto a la baja fertilidad que consigue un semen así tratado. La posibilidad de mejorar la morfología y sobre todo la resistencia de la membrana espermática del verraco a través de la alimentación, será un arma de inmensas posibilidades para conseguir un semen más resistente a las agresiones que supone la conservación refrigerado y sobre todo congelado. Dentro de este mismo proyecto, y en colaboración con la Cátedra de Bioquímica seminal de la Universidad de Olsztyn (Polonia) y con la Academia de Ciencias Polacas, a través de un convenio de cooperación hispano-polaco, se evaluó el efecto de la atropina para reducir el volumen de eyaculado, facilitando así la congelación, y el efecto del acetato de ciproterona en el proceso de maduración del semen de verraco. RESULTADOS ƒse han entrenado 9 verracos Large White para recoger muestras de semen, habiendo saltado todos ellos y dando eyaculados de elevada calidad. Estos excelentes animales de conservan para ser utilizados en nuevos proyectos. ƒse pusieron a punto las técnicas analíticas siguientes: Cromatografía líquida de alta resolución para la identificación cuali y cuantitativa de fosfolípidos de membrana. Espectrofotometría de absorción atómica para la evaluación de calcio libre, combinado con proteínas y zinc total. Espectrofotometría visible/uv para evaluación de proteínas plasmáticas hidroprecipitables y de la actividad de Aspartato Amino Transferasa. Gravimetría (técnica propia) para análisis de proteínas plasmáticas totales. Técnicas de contrastación de semen (motilidad, acrosomía, formas anormales etc. Incorporación de la actinomicina tritiada y su evaluación por R.I.A. para determinar el estado de la cromatina nuclear del espermatozoide de verraco. 2

4 ƒse han analizado todas las muestras de semen del período de verano y de invierno según todos los parámetros previstos en los objetivos, hasta el cese forzado del auxiliar de laboratorio que dejó algunas muestras sin analizar en lo referente a calcio y fosfolípidos. ƒse han calculado las medias, desviaciones standard de todos los parámetros analizados, determinándose la significación de las diferencias tanto entre grupos (Testigo, pienso con vitamina C y pienso con vitamina E) como entre estaciones (verano e invierno). ƒse han observado diferencias significativas entre estaciones en volumen del eyaculado, motilidad, porcentaje de acrosomas normales y dañados, gotas citoplásmicas proximales niveles de zinc, proteínas hidroprecipitables y lisofosfatidil colina entre varios de los grupos, siendo estas diferencias previsibles y estando desviadas hacia una mejor calidad espermática en invierno frente al verano. Se han observado mejoras significativas en la calidad del semen con la adición de vitaminas antioxidantes frente al grupo testigo en lo que se refiere a parámetros tan indicativos de calidad como en concentración espermática, número total de espermatozoides, porcentaje de acrosomas normales y acrosomas dañados (formas anormales), niveles de proteínas totales e hidroprecipitables, niveles de calcio libre y ligado a proteínas y porcentaje de fosfolípidos que inciden en la calidad protectora de la membrana espermática como la esfingomielina, la fosfatidil colina y la lisofosfatidil colina. Se ha observado un significativo aumento de los niveles de vitamina E en sangre en el grupo alimentado con pienso suplementado con dicha vitamina. ƒse ha observado el efecto negativo del acetato de ciproterona sobre la calidad del semen de verraco en ambas estaciones del año. ƒse evalúa positivamente la inyección de atropina a los verracos en cuanto se reduce el volumen del eyaculado, aumentándose significativamente la concentración, proceso que mejora la capacidad de resistencia del semen de cerdo a la congelación. ƒla evaluación del estado de la cromatina nuclear del espermatozoide se ha revelado como una técnica excelente para predeterminar el comportamiento de la célula en su conservación tanto refrigerada como congelada. ƒa través de la determinación de la actividad de Aspartato Amino Transferasa puede hacerse un seguimiento del comportamiento del espermatozoide durante cualquier proceso agresivo y dicha actividad proporciona, igual que el estado de decondensación de la cromatina, preciosa información para valorar la capacidad de resistencia de un eyaculado determinado a la congelación y/o refrigeración. Estos resultados confirman la idea de la capacidad protectora de las vitaminas antioxidante para los espermatozoides de verraco derivada de la reducción de la peroxidación lipídica en los fosfolípidos de dicha membrana lo que anima para el diseño de un proyecto futuro en que contemplará la peroxidación y la degradación de la cromatina espermática en verracos protegidos con antioxidantes. INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES ƒel eyaculado de los verracos sometidos a stress térmico, con temperaturas superiores a 3

5 los 25º C (temperaturas estivales), condiciones que se dan muy a menudo en nuestro País, presenta unos muy pobres índices de calidad, tanto morfológicos como bioquímicos, en comparación con los de los mismos animales no sometidos a dicho stress (temperaturas invernales, de inicio de primavera y de final de otoño). ƒel descenso de calidad, evaluado por pruebas morfológicas y bioquímicas, coincide con una bajada de fertilidad y una menor resistencia a la conservación del semen, tanto congelado como refrigerado. ƒexiste una serie de parámetros bioquímicos de la célula espermática y del plasma seminal que pueden utilizarse como predictores del comportamiento de la célula en congelación. Entre ellos aparecen como más determinantes los niveles de fosfolípidos totales, los porcentajes relativos de ciertos fosfolípidos como la fosfatidil colina, lisofosfatidil colina y esfingomielina. ƒse ha demostrado que la evaluación del estado de la cromatina nuclear en la célula espermática del verraco es una información básica para predecir si ese eyaculado conseguirá o no resistir de una forma adecuada el proceso agresivo que lleva consigo la congelación seminal. ƒla actividad actual del aspartato amino transferasa es un indicativo excelente para conocer, durante los pasos de cualquier proceso de tratamiento del semen de verraco, las variaciones que dicho semen está sufriendo, información preciosa para modificar en sentido positivo cualquiera de las etapas de dicho proceso. ƒes posible mejorar la calidad de un eyaculado mediante la adición de ciertas sustancias beneficiosas en la alimentación de los verracos. ƒla adición de vitamina E (α-tocoferol; 200 mg/kg de pienso), potenciada con zincmetionina (45 mg/kg de pienso) produce un efecto positivo no significativo sobre la calidad del semen de verraco, en especial en animales sometidos a un stress térmico. ƒla adición de vitamina C (ácido ascórbico; 100 mg/kg de pienso), potenciada con zincmetionina (45 mg/kg de pienso) produce un efecto positivo estadísticamente significativo sobre la calidad del semen de verraco, notándose en especial en las muestras seminales recogidas en el verano, estando pues los animales sometidos a un stress térmico. ƒel descenso de la calidad del semen de verraco durante el verano, en lo que se refiere a su capacidad de conservación mediante refrigeración o congelación, se ve significativamente paliado también por la adición de zinc-metionina-vitamina C en el pienso de dichos animales. ƒse demuestra la acción negativa del acetato de ciproterona sobre el epidídimo lo que da lugar a una disminución de la calidad espermática y a un desplazamiento de los andrógenos de sus receptores. ƒse ha demostrado la acción beneficiosa de la inyección de atropina a los verracos antes de recogerles el semen en el sentido de una significativa reducción del volumen de plasma seminal y el consecuente aumento significativo de la concentración. Este hecho 4

6 da lugar a la eliminación de la centrifugación, etapa muy agresiva para el semen, del proceso de preparación de los eyaculados para ser congelados. ƒtodos estos resultados serán aplicados en futuros proyectos de congelación de semen de verraco tanto para predecir la capacidad de un eyaculado para ser congelado, eliminando aquellos que no superen unos índices bioquímicos mínimos preestablecidos, como para mejorar, por vía alimentaria, la calidad de estos eyaculados, en animales que han mostrado problemas morfológicos en el semen o cuyos eyaculados disminuyen de calidad debido al efecto del stress térmico estival. FORMACION DE PERSONAL Elaboración y presentación de la tesis doctoral de María del Carmen de Alba Romero, titulada Variaciones de la composición fosfolipídica de la membrana espermática del espermatozoide de verraco durante el equilibrio del semen en procesos de conservación, en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid Apto cum laude. Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Berta Doris Corcuera Urbina, titulada Efecto de la presión osmótica de los diluyentes de la congelación sobre la viabilidad del espermatozoide de verraco, en la Facultad de Biología de la Universidad Complutense de Madrid Apto cum laude. PUBLICACIONES Artículos científicos Strzezek, J., Fraser, J., Saiz Cidoncha, F., Wysocki, P., Martin Rillo, S El papel de la acción antiadrogénica del CPA (Acetato de ciproterona) en la inducción de cambios bioquímicos y morfológicos en semen de verraco. Anaporc, De Alba, C., Marigorta, P., Saiz Cidoncha, F., Strzezek, J., Lyczynski, A., Martin Rillo, S Aspartate aminotransferase activity changes during boar semen preservation at 15º C. J. of Physiology and Pharmacology, Sup Corcuera. B.D. Saiz Cidoncha, F., Marigorta, P., Sagües, A., Strzezek, J., Martin Rillo, S Effect of dilution on the chromatin decondensation levels in thawed boar semen (Homospermic and heterospermic samples). J. of Physiology and Pharmacology, Sup Martin Rillo, S., Pintado, B., De Alba, C., Sanchez, R., Garcia, P., Corcuera, D., Artiga, C., Sagües, A., Diaz, A., Saiz Cidoncha, F Effect of cooled and frozen boar semen on embryo development. Reproduction in Domestic Animals. Physiology, Pathology, Biotechnology, Strzezek, J., Fraser, L., Sáiz Cidoncha, F., Holdy, D., Wysocki, P Efecto de la atropina sobre la composición del semen y sobre las propiedades bioquímicas del plasma seminal en el verraco. Anaporc, 173. Marigorta, P., Sáiz Cidoncha, F., De Alba, C., Sagüés, A., Corcuera, B.D., Martín Rillo, S Acrosine and aspartate aminotransferase activities in boar semen during the freezing process as indicative of the cell status. Stocarstvo,

7 Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios Martin Rillo, S., Pintado, B., De Alba, C., Sanchez, R., Garcia, P., Corcuera, D., Artiga, C., Sagües, A., Diaz, A., Saiz Cidoncha, F. Effect of cooled and frozen boar semen on embryo development. III International Conference on Boar Semen Preservation. Mariensee-Hannover (Alemania) De Alba Romero, C., Marigorta Del Val, P., Saiz Cidoncha, F., Corcuera Urbina, B.D., Sagüés Navaridas, A., Martin Rillo, S. Clasificación del semen de verraco a partir de la valoración de ciertos parámetros bioquímicos. I Congreso de la Asociación Colombiana de Médicos Veterinarios Especialistas en Cerdos: ACOMVEC. Santafé de Bogotá (Colombia) Saiz Cidoncha, F., De Alba, C., Sagües, A., Marigorta, P., Corcuera, B.S., Martin Rillo, S. Acrosine and AAT activities in boar semen during the freezing process as indicative of the cell status. 46 Annual Meeting of the European Asociation for Animal Production (FEZ). Praga (República Checa) De Alba, C., Marigorta, P., Saiz Cidoncha, F., Le Coz, P., Lyczynski, A., Martin Rillo, S. Effect of boar semen dilution on spermatic membrane phospholipidic composition. 14 Congreso Internacional de la IPVS. Bolonia (Italia) Corcuera, B.D., Sagües, A., Marigorta, P., Saiz Cidoncha, F., Castro, J.M., Martin Rillo, S. Effect of the freezing technique on the chromatin decondensation levels. 14 Congreso Internacional de la IPVS. Bolonia (Italia) Sáiz Cidoncha, F., Riopérez, J., Marigorta, P., González, E., Romero, A. Effect of the addition of vitamin C or Vitamin E to boars feed on some morphological semen parameters. 48º Annual Meeting de la Federación Europea de Zootecnia (FEZ). Viena (Austria). Agosto, 1997 Otros trabajos de difusión de resultados Se ha pronunciado varias conferencias sobre objetivos y resultados del proyecto, en diversas reuniones científicas en Madrid, Badajoz y Murcia, durante 1996 y Se llevó a cabo, en 1.996, una revisión oral, por parte del investigador principal, de los resultados del Proyecto en una reunión de la Academia de Ciencias Polacas en Olsztyn (Polonia), invitado por el Académico Prof. Ziezik y en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Cracovia, en 1997, invitado por el Rector de dicha Universidad. 6

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